動物細(xì)胞培養(yǎng)課件11

動物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)展歷史1885年Roux最早嘗試使組織離體培養(yǎng)，材料是雞胚神經(jīng)板，采用生理鹽水為培養(yǎng)液，并首次采用組織培養(yǎng)這個術(shù)語。1907年Harrison將蛙胚神經(jīng)管區(qū)一片組織植入蛙的淋巴液凝塊中。1912年Carrel發(fā)現(xiàn)雞胚浸出液對細(xì)胞的生長具有很強(qiáng)的刺激效應(yīng)，在完全沒有抗生素的條件下使雞胚心臟的細(xì)胞維持了34年，傳代3400次。發(fā)展歷史1797年，英國醫(yī)師EdwardJenner將牛痘水痘液接種兒童，免得天花。1883年，第一個免疫接種狂犬病疫苗，標(biāo)志疫苗工業(yè)的誕生。1950-1985年，脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、流行性腮腺炎、乙型肝炎和帶狀皰疹問世。發(fā)展歷史1997年，英國醫(yī)師EdwardJenner將牛痘水痘液接種兒童，免得天花。1883年，第一個免疫接種狂犬病疫苗，標(biāo)志疫苗工業(yè)的誕生。1950-1985年，脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、流行性腮腺炎、乙型肝炎和帶狀皰疹問世。1955的年Earle報道DMEM加血清可代替生物體液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。發(fā)展歷史1954年，美國索爾克利用原代培養(yǎng)猴腎細(xì)胞制備脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。1962年，Capstick等人成功進(jìn)行BHK的懸浮培養(yǎng)，標(biāo)志工業(yè)化應(yīng)用的突破發(fā)展。以較安全的細(xì)胞株（WI-38和MRC-5）取代猴腎細(xì)胞，使人用病毒疫苗進(jìn)入臨床應(yīng)用，如麻疹疫苗（1963）、狂犬疫苗(1964)、流行性腮腺炎疫苗（1969）和風(fēng)疹疫苗（1969）。發(fā)展歷史20世紀(jì)70年代后期，Kohler和Milstein建立雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，促進(jìn)了抗體的診斷應(yīng)用。20世紀(jì)80年代初期，基因重組技術(shù)推動了動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在制藥工業(yè)中的應(yīng)用。表達(dá)生產(chǎn)的第一個非天然蛋白是用于心肌梗死溶栓治療的組織纖溶酶原激活劑（tPA），1986年成為產(chǎn)生首個進(jìn)入臨床應(yīng)用的重組蛋白藥物。第二個進(jìn)入臨床應(yīng)用的重組蛋白是紅細(xì)胞生成素（EPO），1989年Amgen公司進(jìn)行生產(chǎn)。實(shí)際應(yīng)用生產(chǎn)天然藥用蛋白。tPA，EPO，血友病（凝血因子VII和IX，干擾素及hGH，診斷藥物包括許多診斷和治療用單克隆抗體。基因重組蛋白的臨床應(yīng)用。制備單克隆抗體對環(huán)境和動物保護(hù)作用新藥研發(fā)發(fā)展方向臨床生物治療。肺囊性纖維化、進(jìn)行性肥大性肌營養(yǎng)不良癥和黑色素瘤。器官和組織的體外培養(yǎng)。疫苗研制藥理檢測模型組織培養(yǎng)中熱門的研究領(lǐng)域1)細(xì)胞內(nèi)部的活動，如DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、能量代謝；2)細(xì)胞內(nèi)部的流動，如RNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)方向運(yùn)轉(zhuǎn)，激素受體復(fù)合物的易位等；3)生態(tài)學(xué)，如營養(yǎng)、感染、病毒或化學(xué)誘變、藥物作用；4)細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，如胚胎誘導(dǎo)、細(xì)胞群體的動力學(xué)等。組織培養(yǎng)的分類及基本概念1.組織培養(yǎng)(TissueCulture)指的是從體內(nèi)取出組織，在模擬體內(nèi)生理環(huán)境，無菌、適當(dāng)溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法。2.細(xì)胞培養(yǎng)(CellCulture)培養(yǎng)物是單個細(xì)胞和細(xì)胞群。3.器官培養(yǎng)（OrganCulture）培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法。組織培養(yǎng)的細(xì)胞生物學(xué)特點(diǎn)1.體內(nèi)外細(xì)胞的差異：當(dāng)人工條件和體內(nèi)實(shí)際情況不完全相同時，細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，一旦失去神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和細(xì)胞間相互影響，生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中，發(fā)生變化則是必然。細(xì)胞最多見的表現(xiàn)是：返祖（Atavism）現(xiàn)象，即失去原有組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)、分化減弱或不顯、細(xì)胞趨單一化、不死性、惡性狀。2.細(xì)胞增殖和分化：是細(xì)胞生命進(jìn)化中所獲得的基本屬性，增殖使細(xì)胞數(shù)量增多；分化使機(jī)體結(jié)構(gòu)和功能多樣化，最后演變成完整的有機(jī)體。培養(yǎng)細(xì)胞的分化

細(xì)胞分化機(jī)制是極其復(fù)雜的，是在細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與體液和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用下，眾多基因參與、經(jīng)過多階段和多環(huán)節(jié)完成的動態(tài)演變過程。培養(yǎng)細(xì)胞的分化不適應(yīng)（Deadaption）細(xì)胞在體內(nèi)時所擁有的分化特性減弱或不顯。例如肝細(xì)胞在體外喪失了產(chǎn)生酪氨酸轉(zhuǎn)移酶的特性。脫分化（去分化）（Dedifferentiation）

由于基因變異而使細(xì)胞失去分化能力。如肝細(xì)胞失掉產(chǎn)生精氨酸酶及氨基酸轉(zhuǎn)移酶的特性后，儲存肝糖元的能力喪失，并很難再現(xiàn)。

不適應(yīng)和脫分化兩個概念不同：不適應(yīng)是因?yàn)樯鏃l件改變而使分化發(fā)生抑制；從分子水平考慮，脫分化很可能是基因變異所致。培養(yǎng)細(xì)胞的分化培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)1.貼附型：1）成纖維細(xì)胞：心肌細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞等2）上皮型細(xì)胞：消化管外皮細(xì)胞，肝臟上皮細(xì)胞等3）游走型細(xì)胞：神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞4）多形型細(xì)胞：神經(jīng)組織細(xì)胞2.懸浮型：如癌細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖1.原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）階段：或稱初代培養(yǎng)。從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代，隨不同的組織時間長短不一，一般為1~4w2.傳代培養(yǎng)（Subculture）階段：或稱繼代培養(yǎng)。也就是細(xì)胞系（Cellline）階段，細(xì)胞增殖旺盛，一般細(xì)胞可傳代10-50代。培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖3.衰退階段：自發(fā)性轉(zhuǎn)化（SpontaneousTransformation）：其標(biāo)志是獲得永生性（Immortality）或惡性（Malignancy）:細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系(Infinitecellline)或連續(xù)細(xì)胞系(Continuouscellline)。

如：BHK（倉鼠腎成纖維細(xì)胞），F(xiàn)9（小鼠胚胎癌細(xì)胞），M2R（黑色素瘤細(xì)胞）等。培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到一定密度后，都需要做傳代處理，傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞增殖速度有關(guān)。所謂細(xì)胞“一代”，即從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。如某一細(xì)胞系為50代即該細(xì)胞已傳代50次。

細(xì)胞傳代的三個階段1）潛伏期（Latentphase）：

細(xì)胞從接種到貼壁生長繁殖的一段時間。二倍體細(xì)胞該期時間長（24~96h）；連續(xù)細(xì)胞系時間短（10~30min）。

細(xì)胞傳代的三個階段2)指數(shù)生長期（Logarthmicgrowthphase）：

細(xì)胞增殖最旺盛時期，一般用細(xì)胞分裂指數(shù)（Mitoticindex，MI）表示，即細(xì)胞群中每1000個細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)介于0.1~0.5%，且受細(xì)胞種類培養(yǎng)液成分、pH、溫度等影響。指數(shù)生長期是細(xì)胞活力最好的時期，在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)生長期持續(xù)3-5d后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長空間日趨減少，細(xì)胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制（Contactinhibition）。而惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)分正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。癌細(xì)胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制（Densityinhibition）細(xì)胞傳代的三個階段

3)停滯期（Stagnatephase）：

即細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞與營養(yǎng)液的交換面積減少，代謝產(chǎn)物積累，PH下降細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入停滯期。在此時應(yīng)及時進(jìn)行換液傳代，否則因細(xì)胞中毒受損，大量細(xì)胞出現(xiàn)死亡，至少再傳1-2代后，細(xì)胞才能恢復(fù)。細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件1)儀器和設(shè)備:常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備：如CO2孵箱；培養(yǎng)器材：如培養(yǎng)瓶，純水設(shè)備，干燥消毒除菌設(shè)備，清洗設(shè)備等。2)培養(yǎng)液:目前常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F(xiàn)12等，可根據(jù)培養(yǎng)需求合理選擇。細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件3)血清：一般常用為小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它動物血清。由于不同的研究目的，血清成分往往干擾研究實(shí)驗(yàn)，如進(jìn)行藥物和受體及營養(yǎng)等方面的研究時，需要使用無血清培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件4)平衡鹽溶液:主要用于作為稀釋和灌注的液體，維持細(xì)胞滲透壓，提供緩沖系統(tǒng)，使培養(yǎng)液的酸監(jiān)度維持在培養(yǎng)細(xì)胞生理范圍內(nèi)，提供細(xì)胞正常代謝所需的水分和無機(jī)離子等。常用的有PBS，Hank’s等。5)抗生素:常用為青霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100單位）和鏈霉素（每毫升培養(yǎng)液50~100微克）。細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件6)其它添加成分：緩沖系統(tǒng)，常用為HEPES（N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonicacid），HEPES不是起維持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH變化的，所以調(diào)整pH常常用NaHCO3溶液。有機(jī)補(bǔ)充物，如丙酮酸鈉，谷胺酰氨等。促細(xì)胞分裂因子，如生長因子類的FGF(成纖維細(xì)胞生長因子)，EGF(表皮生長因子)。貼壁和鋪展因子，如膠原蛋白，纖粘蛋白等。可根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的特殊要求進(jìn)行添加。培養(yǎng)液的物理性質(zhì)pH值：大多數(shù)細(xì)胞在pH7.4時生長最好，一般不低于6.8，不高于7.6。酚紅是常用的指示劑，用來檢測PH的變化：紅色--pH7.4，橙色--pH7.0，黃色--pH6.5，藍(lán)紅色--pH7.6，紫色--pH7.8。溫度：溫度除直接影響細(xì)胞生長外，還與培養(yǎng)液的pH值有關(guān)，溫度低時CO2溶解性增加，從而影響pH。培養(yǎng)液的物理性質(zhì)滲透壓：培養(yǎng)液滲透壓一般介于260~320mmol/L之間。人類血漿滲透壓290mmol/L，小鼠類為310mmol/L。粘度：由于血清的存在，直接影響培養(yǎng)液粘度。表面張力：培養(yǎng)液的表面張力有利于培養(yǎng)物粘著于底物上面。細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法1.組織、細(xì)胞的解離方法1.1解離組織：在無菌情況下采取動物的組織或器官，放在含有抗生素的平衡鹽溶液(BSS)中，然后盡快在超凈臺或無菌室內(nèi)進(jìn)行解離處理。解離時應(yīng)注意:1)盡可能將脂肪和壞死組織去除干凈；2)剪碎組織時，避免損傷組織塊；3)解離組織用的各種酶系，需要先進(jìn)行低速離心。解離細(xì)胞

常用酶和鰲合劑進(jìn)行解離：當(dāng)實(shí)驗(yàn)室需要制備具有均勻細(xì)胞層的培養(yǎng)物；從單個細(xì)胞出發(fā)獲得細(xì)胞群體；從一定量的組織中獲得最多的細(xì)胞量時。解離細(xì)胞的方法1）胰蛋白酶解離細(xì)胞法：所需時間較短，主要缺點(diǎn)是破損細(xì)胞。2）膠原酶解離細(xì)胞法：這種方法對解離胚胎性、正常和惡性組織是很有效的。膠原酶最終濃度200u/ml，36.5℃溫育，一般溫育4-48h。膠原酶和透明質(zhì)酸酶協(xié)同作用有助于分離大鼠或兔的肝臟組織。3）機(jī)械解離細(xì)胞法：比酶法所需時間短，但細(xì)胞存活率較低。4）螯合劑解離細(xì)胞法：分離效果差。原代細(xì)胞培養(yǎng)1）外植塊培養(yǎng)：外植塊在一定限度內(nèi)可保持其原有組織結(jié)構(gòu)，有利于其適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境。短期培養(yǎng)的外植塊成為細(xì)胞培養(yǎng)的材料來源之一。2）單層細(xì)胞培養(yǎng)：每隔1~3d換液一次，細(xì)胞長成單層后傳代培養(yǎng)。原代細(xì)胞培養(yǎng)3）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：使細(xì)胞成懸浮狀態(tài)在培養(yǎng)液中連續(xù)生長。由于細(xì)胞本身是不粘附的，如小鼠白血病細(xì)胞和腹水腫瘤細(xì)胞；通過機(jī)械攪動使細(xì)胞保持懸浮狀態(tài)；通過選擇培養(yǎng)得到能懸浮生長的細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個問題1）培養(yǎng)液和培養(yǎng)物的比例：一定濃度的培養(yǎng)液僅能支持一定數(shù)量的細(xì)胞生長，不能盲目增加每單位體積的細(xì)胞濃度。2）PH：初培養(yǎng)pH應(yīng)為7.4，培養(yǎng)過程應(yīng)不低于7.0。3）培養(yǎng)瓶內(nèi)的空間：一般培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)液與液面上的空間體積之比為1:10。細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)注意的幾個問題4）容積、深度、表面面積：培養(yǎng)液體積與表面面積的比例為0.2~0.5ml/cm2。需高濃度氧的，在淺的培養(yǎng)液（2mm）中生長較好；需要低濃度氧的。在深的培養(yǎng)液（5mm）中生長較好。5）去除死細(xì)胞6）溫度控制：動物細(xì)胞培養(yǎng)對溫度波動的敏感性很大。溫度低于36.5℃，細(xì)胞生長緩慢；溫度高于37.5℃，細(xì)胞存活力降低。細(xì)胞系及其鑒定

原代培養(yǎng)的培養(yǎng)物中所含的細(xì)胞類型多而復(fù)雜。因此在培養(yǎng)初期，存活和生長的細(xì)胞類型也是多種多樣的。所以再培養(yǎng)不僅僅是為了維持細(xì)胞不斷地生長，而且是使培養(yǎng)物逐步成為具有增殖能力、特征專一、類型均勻的培養(yǎng)細(xì)胞，即細(xì)胞系(Cellline)。細(xì)胞克隆技術(shù)培育細(xì)胞系可采用細(xì)胞克隆技術(shù)。一個克隆的細(xì)胞群體是從一個單一母細(xì)胞繁殖而來，分離單一細(xì)胞并使其繁殖為一細(xì)胞群體的方法稱為克隆化(cloning)。細(xì)胞克隆技術(shù)的方法1.稀釋鋪板法2.飼養(yǎng)層克隆法3.膠原膜板或纖維蛋白膜板克隆法4.瓊脂克隆法5.在瓊脂基底上用甲基纖維素克隆法細(xì)胞系鑒定

當(dāng)細(xì)胞系建立后，應(yīng)對細(xì)胞系進(jìn)行一系列鑒定后，才能應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等方面的研究。鑒定內(nèi)容應(yīng)包括:1)細(xì)胞系的細(xì)胞來源；2)鑒定細(xì)胞系的純度，即除了主類細(xì)胞外，還雜有哪類細(xì)胞；3)細(xì)胞系的穩(wěn)定性，即在細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)過程中主要指標(biāo)應(yīng)無明顯變化；4)累積細(xì)胞系的形態(tài)及其表達(dá)特征的基本數(shù)據(jù)，以及其與來源細(xì)胞的差異等；細(xì)胞系鑒定指標(biāo)1.形態(tài)學(xué)：活細(xì)胞觀察；固定染色觀察培養(yǎng)細(xì)胞。2.染色體：染色體是一種鑒定細(xì)胞系的種屬、性別來源較為確切的指標(biāo)；也是檢查細(xì)胞系是否趨于穩(wěn)定，在離體培養(yǎng)條件下細(xì)胞有否發(fā)生轉(zhuǎn)化的可靠指標(biāo)；是區(qū)別正常細(xì)胞與惡性細(xì)胞的指標(biāo)。采用染色體數(shù)目、核型分析以及染色體分帶技術(shù)檢測。細(xì)胞系鑒定指標(biāo)3.同工酶譜：通常采用G6PD(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、LDH(乳酸脫氫酶)、核苷磷酸化酶三種方法，根據(jù)條件選擇。細(xì)胞系鑒定指標(biāo)4.細(xì)胞DNA遺傳特征:

限制性片斷長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphismRFLP)是指那些在生物進(jìn)化過程中，DNA序列發(fā)生某些中性突變，突變的結(jié)果是失去或獲得一個酶切點(diǎn)，因此當(dāng)基因組DNA用限制性內(nèi)切酶酶切后，限制性內(nèi)切酶片斷加長或縮短；用同源的克隆DNA為探針可以探測出來。另外也可能在生物進(jìn)化過程中DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，使DNA堿基排列序列改變，影響內(nèi)切酶切點(diǎn),使內(nèi)切酶酶切片斷呈多態(tài)性。一般采用Southern印跡雜交法檢測。培養(yǎng)細(xì)胞的污染問題及檢測

細(xì)胞培養(yǎng)的污染問題十分重要，一旦發(fā)生污染，將導(dǎo)致前功盡棄。所以細(xì)胞培養(yǎng)一定要建立無菌觀念。遇到培養(yǎng)污染要分析原因，及時處理。細(xì)胞污染的種類和判定

細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染物有細(xì)菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現(xiàn)以下情況時培養(yǎng)的細(xì)胞可能有污染：1)培養(yǎng)液的酸堿度發(fā)生異常的改變。2)培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁。3)光鏡觀察到菌絲和顆粒。4)細(xì)胞出現(xiàn)死亡或增殖緩慢等。污染物的檢測1.細(xì)菌和真菌污染的檢測：1）涂片染色鏡檢；2）接種培養(yǎng)：Trypticase大豆肉湯、BHI、Thioglycocollate肉湯和血瓊脂板適于廣泛的細(xì)菌檢測；Sabouraud肉湯、YM肉湯和營養(yǎng)肉湯適于檢測真菌。檢測到陽性結(jié)果后，應(yīng)高壓滅菌處理污染的培養(yǎng)物及其用具。污染物的檢測

2.支原體檢測:

支原體污染細(xì)胞后，能抑制細(xì)胞代謝和生長，改變核酸合成，影響細(xì)胞的抗原性，引起細(xì)胞染色體改變，干擾病毒的復(fù)制，以及具有類病毒作用。在培養(yǎng)細(xì)胞初期，由于支原體對細(xì)胞的繁殖影響較小而往往被忽略。1）熒光技術(shù)檢測：支原體含有DNA，能與一種熒光染料Hoechest33258特異性的結(jié)合，可根據(jù)細(xì)胞表面的熒光來顯示細(xì)胞是否污染有支原體。2）直接培養(yǎng)法：實(shí)驗(yàn)室常用。3）放射自顯影檢測：4）DNA分子雜交：檢測完畢后，所有實(shí)驗(yàn)用具均應(yīng)經(jīng)過高壓消毒處理。支原體檢測方法和處理5）污染支原體后的處理：抗生素處理：如加入泰樂菌素等。共培養(yǎng)法：與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)。重新克隆法：抗生素處理后，將細(xì)胞稀釋后傳代，每周換2次含抗生素的新鮮培養(yǎng)液，4~5周后，重復(fù)克隆2次。過濾法：0.22μm孔徑濾膜正壓過濾。支原體檢測方法和處理1）致細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）或集落的檢測：采用相差顯微鏡檢測2）血細(xì)胞吸附試驗(yàn)；3）雞胚接種。污染病毒的檢測為避免細(xì)胞間交叉污染，應(yīng)注意：了解各細(xì)胞系的特征；培養(yǎng)各細(xì)胞系的操作手續(xù)要快速；培養(yǎng)各細(xì)胞系不用同一瓶的培養(yǎng)液和酶等；吸過培養(yǎng)液和細(xì)胞懸液的吸管，不能放回儲存培養(yǎng)液和酶的瓶內(nèi)；經(jīng)常檢查培養(yǎng)物特征，注意任何突然的形態(tài)學(xué)改變，通過染色體或同工酶譜分析，檢查是否有交叉污染。細(xì)胞間交叉污染

在體外培養(yǎng)工作中，常要將體外培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存，在需要時再復(fù)溫融解進(jìn)行體外培養(yǎng)（復(fù)蘇）。要獲得好的凍存與復(fù)蘇效果，必須了解如下幾個問題：冷凍速率、復(fù)溫速率、冷凍保護(hù)劑，冷凍保存溫度。

細(xì)胞保存1、冷凍速率冷凍速率是指降溫的速度，是活細(xì)胞能否被冷凍到一個能永久保存的溫度的一個主要因素。冷凍速率太快或太慢都會造成細(xì)胞的損傷，只有以最適的冷凍速率冷凍細(xì)胞，才能獲得最佳的冷凍保存效果。

不同細(xì)胞最適冷凍速率的值也有所不同，所以一種細(xì)胞冷凍保存之前要測試出其最適冷凍速度，擬保證獲得最高冷凍存活率。

細(xì)胞保存2、復(fù)溫速率復(fù)溫速率是指細(xì)胞復(fù)蘇時溫度升高的速度。冷凍保存的細(xì)胞復(fù)蘇時，復(fù)溫速率不當(dāng)也會降低冷凍存活率。一般來說復(fù)溫速度越快越好，37℃水浴中，1～2分鐘內(nèi)要完成復(fù)溫。細(xì)胞保存3、冷凍保護(hù)劑冷凍保護(hù)劑是指可以保護(hù)細(xì)胞免受冷凍損傷的物質(zhì)，常被加到一定的溶液中進(jìn)行配制，作為冷凍保護(hù)液。紅細(xì)胞、大多數(shù)微生物和極少數(shù)有核的哺乳類動物細(xì)胞懸浮在水或簡單的鹽溶液中而不加冷凍保護(hù)劑，以最適的冷凍速率冷凍保存可獲得活的凍存物。細(xì)胞保存對大多數(shù)有核哺乳類動物細(xì)胞來說，在不加冷凍保護(hù)劑的情況下，無最適冷凍速率可言，也不能獲得活的凍存物。目前冷凍保護(hù)劑可分為滲透性和非滲透性兩類。具有滲透性的冷凍保護(hù)劑可以滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是一些小分子的物質(zhì)，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等，。非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉等。

細(xì)胞保存4、冷凍保存溫度冷凍保存溫度是指能長久保存細(xì)胞的一個深低溫度。在這樣的溫度下，細(xì)胞生化反應(yīng)極其緩慢或停止，但經(jīng)長期保存和復(fù)蘇后仍能保持正常的結(jié)構(gòu)和功能。從實(shí)際和效益的觀點(diǎn)出發(fā)，液氮溫度（﹣196℃）是目前最佳冷凍保存溫度。

細(xì)胞保存動物細(xì)胞培養(yǎng)過程動物細(xì)胞原代培養(yǎng)過程圖（1）動物處死：將出生2～3d乳鼠，用拉頸椎方法處死。背部向上釘在蠟盤中，用碘酒和酒精棉球擦拭腰部兩側(cè)被毛。（2）取腎及剪腎：在無菌條件下將腎臟取出，置于無菌培養(yǎng)皿中，剪去腎膜和脂肪，用Hanks液洗滌1次；放入另一培養(yǎng)皿中，縱向剪開腎臟，去掉腎盂，將腎剪成1mm3大小的塊，再并用Hanks液洗滌2～3次，直到液體澄清。方法與步驟（3）消化及分散組織塊：將上述清洗過的組織放入無菌青霉素瓶內(nèi)，加入5～6倍量的0.25％胰蛋白酶液（pH7.4～7.6），置37℃水浴中消化20～40min，每隔10min搖動一次，直到組織塊變得疏松，粘稠，且顏色略變?yōu)榘咨珵橹?。取出青霉素瓶，在超凈臺中吸去胰蛋白酶液，加入5ml培養(yǎng)液，用吸管反復(fù)吹打組織塊，使其分散成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液用兩層滅菌紗布過濾至另一燒杯中。（4）計(jì)數(shù)與稀釋：從過濾的細(xì)胞懸液中取出1ml滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，按白細(xì)胞法進(jìn)行計(jì)數(shù)；計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)液稀釋，稀釋后的濃度一般以每毫升含30～50萬個細(xì)胞為宜。（5）分裝與培養(yǎng)：將稀釋好的細(xì)胞懸液分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，塞緊瓶塞，在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）觀察：逐日檢查培養(yǎng)物是否污染，觀察細(xì)胞生長情況。待細(xì)胞已基本長成致密單層時，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

離體培養(yǎng)的細(xì)胞群體增殖達(dá)到一定密度時，細(xì)胞的生長和分裂速度就會減慢甚至停止，如不及時分離傳代培養(yǎng)，細(xì)胞將逐漸衰老死亡。傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化，把細(xì)胞分散成單細(xì)胞再傳代，而懸浮型生長細(xì)胞則用直接傳代法或離心法傳代。傳代細(xì)胞培養(yǎng)（一）貼壁細(xì)胞傳代培養(yǎng)（1）選取生長良好的細(xì)胞，在超凈工作臺的酒精燈旁，倒去瓶中的舊培養(yǎng)液，加入2～3ml的D-Hanks液，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞，以除去懸浮在細(xì)胞表面的碎片。（2）加入2滴管0.25％胰蛋白酶消化液，37℃消化2～3min，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時，倒去酶液。（3）用Hanks液洗滌1次，加入1～2滴管培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其成細(xì)胞懸液。（4）以1：2或1：3進(jìn)行分裝，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，注明代號、日期，輕輕搖勻，37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（5）觀察：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，即可觀察培養(yǎng)液的顏色及細(xì)胞的生長情況。方法與步驟（二）懸液細(xì)胞的傳代培養(yǎng)（1）取生長良好的細(xì)胞，在超凈工作臺用無菌吸管把培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞吹打均勻。（2）轉(zhuǎn)移到無菌的離心管中，蓋緊膠蓋，平衡后離心（1000r/min）5min。（3）在超凈工作臺