單基因病胚胎著床前遺傳學(xué)檢測專家共識

摘要隨著分子生物學(xué)技術(shù)、遺傳診斷技術(shù)的發(fā)展以及相關(guān)術(shù)語的更新，單基因病胚胎著床前遺傳學(xué)檢測（preimplantationgenetictestingformonogenic/singlegenedisorders，PGT-M）技術(shù)不斷進(jìn)步和更新，廣泛應(yīng)用于臨床以避免遺傳病患兒的出生和阻斷致病基因的家族傳遞。目前，關(guān)于PGT-M的共識還很少，為了規(guī)范PGT-M的應(yīng)用，中國醫(yī)師協(xié)會生殖醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會精準(zhǔn)輔助生殖研究學(xué)組及中國醫(yī)師協(xié)會醫(yī)學(xué)遺傳醫(yī)師分會部分專家，包括生殖醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)和心血管醫(yī)學(xué)專家，共同制定了這一共識。共識包括PGT-M的適應(yīng)證、禁忌證、診斷策略、遺傳和生殖咨詢、報告形式、結(jié)果解釋、知情同意和患者隨訪等。這一共識將使更多相關(guān)的臨床工作者和研究人員獲益，供臨床及實驗室參考使用?！娟P(guān)鍵詞】

著床前遺傳學(xué)檢測；單基因?。粚＜夜沧R

單基因病是指由單個基因突變所導(dǎo)致的疾病，突變可發(fā)生于一條染色體上的基因或同時發(fā)生在兩條同源染色體上的等位基因上。根據(jù)在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OnlineMendelianInheritanceinMan，OMIM）統(tǒng)計，截止到2020年11月，已發(fā)現(xiàn)的單基因病超過7000種，其中已明確表型和分子致病機(jī)制的有近6000種。雖然單基因病多屬于罕見病，但發(fā)病率超過1%，部分患者的臨床表現(xiàn)為致死、致殘、致愚，對健康危害極大。因此，為預(yù)防或阻止由此引起的出生缺陷，迫切需要通過產(chǎn)前或者單基因病胚胎著床前遺傳學(xué)檢測（preimplantationgenetictestingformonogenic/singlegenedisorders，PGT-M）技術(shù)進(jìn)行干預(yù)。PGT-M可以對著床前胚胎進(jìn)行致病基因變異診斷，選擇沒有疾病表型的胚胎移植入子宮，阻斷疾病向子代傳遞。隨著分子遺傳診斷技術(shù)和測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多單基因病的致病基因被明確，臨床對PGT-M的需求日益增長。新的胚胎遺傳檢測策略和方法同步開發(fā)與應(yīng)用，推動了相關(guān)指南與共識的更新，歐洲人類生殖和胚胎學(xué)學(xué)會（EuropeanSocietyofHumanReproductionandEmbryology，ESHRE）從2005年至2020年3次更新了PGT-M的實踐指南［1］；美國人類生殖研究所（InstituteforHumanReproduction，IHR）于2015年提出了用于人類白細(xì)胞抗原（humanleukocyteantigen，HLA）配型的PGT-M指南［2］；Girard等［3］于2016年提出了針對高加索人群最常見的單基因遺傳病——囊性纖維化的PGT-M指南。近年來，PGT-M技術(shù)在我國的應(yīng)用取得了穩(wěn)步、快速的發(fā)展，具有相應(yīng)檢測資質(zhì)的輔助生殖機(jī)構(gòu)不斷增多。因此，為了規(guī)范該項技術(shù)近年來，PGT-M技術(shù)在我國的應(yīng)用取得了穩(wěn)步、快速的發(fā)展，具有相應(yīng)檢測資質(zhì)的輔助生殖機(jī)構(gòu)不斷安全有效地實施，需要根據(jù)我國國情特點(diǎn)以及臨床應(yīng)用的實際情況等，制定與之相適應(yīng)的共識，進(jìn)一步規(guī)范技術(shù)的應(yīng)用。由中國醫(yī)師協(xié)會生殖醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會精準(zhǔn)輔助生殖研究學(xué)組和中國醫(yī)師協(xié)會醫(yī)學(xué)遺傳醫(yī)師分會部分專家討論，形成了以下有關(guān)PGT-M技術(shù)方面的專家共識。本共識涵蓋了PGT-M相關(guān)實驗室方法和遺傳檢測策略與質(zhì)控管理等建議，供臨床及實驗室參考使用。一.PGT-M適應(yīng)證與禁忌證1.PGT-M適應(yīng)證：基因突變?yōu)槊鞔_致病或致病基因連鎖標(biāo)記明確的家系，可以進(jìn)行PGT-M，且需綜合考慮疾病的嚴(yán)重程度及就診家系的實際情況［4］。（1）單基因?。悍蚱抟环綖閱位虿』颊呋蚍蚱揠p方是同一單基因病的攜帶者，曾孕育或具有生育致畸、致殘、致死的單基因病患兒高風(fēng)險的夫妻，可以進(jìn)行PGT-M［5］。（2）線粒體?。河杉?xì)胞核基因突變導(dǎo)致的線粒體病，PGT檢測策略同常規(guī)單基因病；由線粒體DNA（mitochondrialDNA，mtDNA）突變導(dǎo)致的線粒體病，因大多數(shù)突變具有異質(zhì)性［6-7］，需要個案咨詢。（3）HLA分型：已生育嚴(yán)重血液/腫瘤疾病、原發(fā)性免疫缺陷病、遺傳性代謝病等疾病患兒的夫妻，在缺乏其他有效治療方法的情況下，需要選擇生育與患兒HLA配型相同的同胞，對患兒進(jìn)行造血干細(xì)胞移植治療［8-10］。（4）具有較高致病概率的遺傳易感性嚴(yán)重疾?。悍蚱揠p方或一方攜帶能導(dǎo)致嚴(yán)重疾病的具有高外顯率、家族遺傳傾向、較高致病概率的易感基因突變，如遺傳性乳腺癌的BRCA1、BRCA2致病突變等［11-12］。2.PGT-M禁忌證［13］：①基因突變的致病性不明確或基因定位不明確的遺傳性疾??；②非疾病表型的胚胎選擇，如外貌、身高、體質(zhì)量、性別等；③輔助生殖技術(shù)禁忌證和/或妊娠禁忌證；④其他情況，如中國法律不允許和/或經(jīng)生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會討論后不適宜PGT-M。3.其他特殊情況：夫妻雙方已生育一個攜帶新發(fā)致病基因變異的患兒，因不能完全排除男方或女方生殖腺嵌合的可能，經(jīng)過充分的遺傳咨詢，在尊重患者夫婦意愿的前提下，可考慮自然妊娠后行產(chǎn)前診斷或選擇PGT-M治療。如有兩次或以上患兒生育史或妊娠史，可能存在生殖腺嵌合，符合PGT-M適應(yīng)證。二.臨床遺傳咨詢實施PGT-M前，患者夫妻需先接受臨床遺傳咨詢，充分了解遺傳病的特征、診療進(jìn)展以及生育風(fēng)險［14］；告知夫妻可選擇的干預(yù)措施，如胚胎著床前檢測、產(chǎn)前診斷等，以及現(xiàn)階段不同檢測技術(shù)和策略的優(yōu)點(diǎn)和局限性，夫妻知情后自愿選擇。1.遺傳咨詢（1）PGT-M治療前遺傳咨詢：進(jìn)行PGT-M之前遺傳咨詢是PGT-M的首要關(guān)鍵環(huán)節(jié)，需由具有遺傳咨詢能力的臨床醫(yī)師完成。首先要參考?？萍膊〉呐R床診斷（如腎內(nèi)科醫(yī)師對家族性遺傳性多囊性腎病的診斷和分型診斷），收集夫妻及相關(guān)家系成員的疾病相關(guān)信息、臨床資料及遺傳檢測結(jié)果，繪制遺傳家系圖譜；對病情的嚴(yán)重性、異質(zhì)性以及基因型/表型相關(guān)性進(jìn)行分析確認(rèn)［15］。在開展治療前需告知患者夫婦，PGT-M僅針對夫妻雙方已知的且明確致病的基因突變進(jìn)行檢測分析，雙方未知的或胚胎新發(fā)生的致病突變不在本次PGT-M檢測范圍內(nèi)。①常染色體顯性遺傳病及X-連鎖顯性遺傳病家系，需告知對于攜帶突變的胚胎均不予移植。②常染色體隱性遺傳病家系，攜帶雙方突變的胚胎不予移植。對于只攜帶一方突變的胚胎，理論上不致病，極少數(shù)情況有較輕癥狀。攜帶一方突變的胚胎需經(jīng)過遺傳咨詢、簽署知情同意書后方可移植。③對于X-連鎖隱性遺傳病家系，攜帶基因突變的男性胚胎，不予移植；對于攜帶基因突變的女性胚胎，理論上不致病，但其男性后代有50%的患病風(fēng)險，女性后代50%概率為攜帶者，需遺傳咨詢，夫妻雙方慎重考慮做出取舍胚胎的決定。④對于單基因病合并染色體異常的家系，如平衡易位，需告知所應(yīng)用技術(shù)是否可以區(qū)分正常核型和平衡易位核型等，患者自愿選擇。⑤對于臨床上高度懷疑為生殖腺嵌合的夫妻，應(yīng)經(jīng)過咨詢并評估生殖腺嵌合的來源后，可實施PGT-M。需告知夫妻，對于生殖腺存在受累或不受累配子的情況，無論是受累的胚胎還是未受累的胚胎都可能有共同的背景單體型，進(jìn)行PGT-M可能會丟棄帶有高危單體型的未受累胚胎的風(fēng)險。（2）胚胎檢測后/移植前遺傳咨詢：夫妻如進(jìn)行PGT-M，檢測后需要進(jìn)行第二次遺傳咨詢，告知胚胎的檢測結(jié)果和遺傳疾病的風(fēng)險等情況［16］。2.輔助生殖技術(shù)實施過程相關(guān)咨詢和處置：由婦產(chǎn)科生殖專業(yè)臨床醫(yī)師完成，包括夫妻雙方一般健康和生育狀態(tài)評估，控制性超促排卵（controlledovarianhyperstimulation，COH）、卵泡監(jiān)測、取卵術(shù)、卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmicsperminjection，ICSI）技術(shù)、胚胎體外培養(yǎng)及活檢（以囊胚活檢為主）、凍存胚胎等內(nèi)容。3.風(fēng)險評估與知情選擇：實施輔助生殖治療前，夫妻應(yīng)對PGT-M過程中的各類風(fēng)險充分知情：如超促排卵、取卵、精卵體外處理、ICSI、胚胎體外培養(yǎng)、胚胎活檢及凍融可能造成的配子、胚胎損傷的風(fēng)險；當(dāng)患者卵巢儲備低下，需要在決定PGT-M前充分向夫妻雙方交代無卵、無胚形成及檢測后無可利用胚胎的風(fēng)險；胚胎細(xì)胞狀態(tài)和技術(shù)局限性所致的檢測失敗風(fēng)險；首次活檢細(xì)胞檢測失敗，胚胎需要進(jìn)行二次活檢的風(fēng)險；染色體嵌合型胚胎發(fā)育潛能的不確定性以及無法鑒別的染色體結(jié)構(gòu)異常攜帶的風(fēng)險［17-18］；由于胚胎特性以及技術(shù)局限性導(dǎo)致的無法明確診斷的風(fēng)險；對于女方為遺傳病患者的病例，需評估妊娠期風(fēng)險；告知妊娠中期需進(jìn)行產(chǎn)前診斷及其所帶來的風(fēng)險等。所提供的咨詢建議應(yīng)不具有傾向性，應(yīng)包括患者夫妻適用的所有生育選擇，并告知遺傳阻斷方式如產(chǎn)前診斷和PGT-M的利弊，讓夫妻充分了解并自愿選擇治療方式［19］。相關(guān)咨詢記錄應(yīng)清晰、完整。結(jié)合家系調(diào)查、臨床資料和遺傳檢測結(jié)果以及相關(guān)單基因病的一般遺傳發(fā)病規(guī)律，充分評估夫妻的再次生育風(fēng)險。三.PGT-M的臨床促排卵和胚胎實驗室策略1.臨床促排卵策略：PGT-M的臨床過程同常規(guī)體外受精-胚胎移植（invitrofertilizationandembryotransfer，IVF-ET），由于PGT周期希望能夠獲得相對較多的胚胎以供遺傳檢測，從而得到一定數(shù)量的可用胚胎以供移植，對于卵巢儲備功能尚可的患者，建議選擇常規(guī)COH治療［20-21］。在相同的COH方案中，卵巢對外源性促性腺激素（gonadotropin，Gn）的反應(yīng)性存在個體差異。合適的促排卵方案選擇及正確應(yīng)用是IVF成功的關(guān)鍵。目前PGT-M主要對囊胚期胚胎進(jìn)行活檢，新鮮周期全胚凍存。因此對COH高反應(yīng)者，采用促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasinghormone，GnRH）拮抗劑方案，必要時聯(lián)合GnRH激動劑扳機(jī)，同時全胚冷凍，可以有效控制早期卵巢過度刺激綜合征（ovarianhyperstimulationsyndrome，OHSS）的發(fā)生率；而對反應(yīng)不良者則是盡量增加獲卵數(shù)，從而獲得更多胚胎以供挑選。對于卵巢低反應(yīng)者如常規(guī)COH方案失敗可嘗試使用自然周期、微刺激或黃體期促排卵等方案，PGT-M如果選擇這些非常規(guī)促排卵方案，需要向患者交代獲卵少、可能無可利用胚胎形成、PGT-M失敗等風(fēng)險，以便患者能夠充分知情選擇。臨床取卵操作策略擬行PGT-M患者取卵過程與其他患者相同，經(jīng)控制性促排卵后，給予hCG（5000~10000IU），36~38h安排取卵［22］。2.胚胎實驗室操作（1）體外獲取卵母細(xì)胞及精子前，輔助生殖實驗室需要獲知并記錄患者夫妻雙方的信息及PGT相關(guān)信息。（2）PGT-M周期的授精方式建議采用ICSI授精方式，盡最大可能減少母源顆粒細(xì)胞和父源精子對胚胎遺傳學(xué)檢測準(zhǔn)確性的干擾［23-24］。（3）根據(jù)胚胎發(fā)育階段不同，可以選擇卵母細(xì)胞極體、5~8-細(xì)胞期卵裂球和囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢［25］。囊胚活檢對胚胎發(fā)育的潛能影響較小，已成為目前PGT-M技術(shù)操作系列的主要活檢方式。囊胚期活檢是在ICSI后第5~6日、囊胚充分?jǐn)U張后進(jìn)行。建議活檢囊胚評分應(yīng)在4BB以上，活檢細(xì)胞數(shù)以5~8個為宜。通常囊胚活檢后的胚胎需立即冷凍保存，待胚胎遺傳學(xué)分析完成后，擇期對結(jié)果正常的胚胎進(jìn)行復(fù)蘇移植。胚胎活檢是PGT-M的重要步驟，建議活檢細(xì)胞取材量在滿足遺傳學(xué)檢測要求的前提下，盡量減少活檢細(xì)胞的數(shù)目，以降低對胚胎后期發(fā)育的影響。①極體僅能提供來自女方的遺傳信息，目前僅應(yīng)用于女方為新發(fā)致病突變攜帶者或者沒有相關(guān)家系成員用于胚胎連鎖分析的情況。活檢時要嚴(yán)格避免顆粒細(xì)胞污染［26］。第一極體、第二極體活檢一般分別在ICSI后0.5~2h、8~14h進(jìn)行。②卵裂球活檢在胚胎發(fā)育至6~8-細(xì)胞階段完成，目前臨床上較少應(yīng)用。推薦活檢1個胚胎細(xì)胞，最多不超過2個［27］。③囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢為目前PGT-M周期的主要胚胎活檢方式［28-29］。推薦在囊胚充分?jǐn)U張期、遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的位置進(jìn)行操作，通常建議活檢5~8個滋養(yǎng)層細(xì)胞，活檢后單囊胚凍存，活檢樣本與胚胎編號一一對應(yīng)。④活檢后細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、存儲與運(yùn)輸：活檢后的細(xì)胞應(yīng)按照后續(xù)遺傳檢測要求處理并轉(zhuǎn)移，避免因樣本處理不當(dāng)而導(dǎo)致的擴(kuò)增失敗。樣本標(biāo)識清晰，推薦管帽、管身均進(jìn)行標(biāo)記，應(yīng)包括患者及胚胎信息，樣本編碼唯一，記錄完整。待檢樣本應(yīng)盡快完成后續(xù)遺傳檢測，短期存儲可保存在-20℃，擴(kuò)增后的樣本在-80℃長期保存，避免反復(fù)凍融。運(yùn)輸應(yīng)保證全程冷鏈運(yùn)輸。⑤二次活檢：需要二次活檢的囊胚，應(yīng)在解凍復(fù)蘇、擴(kuò)張后再實施操作。反復(fù)凍融和多次活檢都會影響胚胎的著床能力與后期發(fā)育潛能。3.透明帶打孔的常規(guī)方法有：機(jī)械法、Tyrodes酸法和激光法。激光法鑒于其便捷、快速、高效，目前更為常用。機(jī)械法和激光法打孔可用于受精前的極體活檢。囊胚活檢的透明帶打孔可以在受精后第3日、第5日、活檢前4h或活檢時進(jìn)行。四.PGT-M策略和技術(shù)1.建議：PGT-M可分為檢測前的驗證和臨床檢測兩部分，具體如下。（1）檢測前驗證的建議：①建議對原始的分子遺傳報告中的檢測信息（如致病基因、致病變異位點(diǎn)、致病性以及報告中所提供的基因參考序列等）進(jìn)行確認(rèn)［30］。②建議明確疾病遺傳方式，采集家系成員的樣本，確保胚胎檢測的可靠性。同時驗證遺傳變異在家系中的共分離符合度，以確認(rèn)報告中致病基因的準(zhǔn)確性。③建議采用攜帶者或患者的外周血淋巴細(xì)胞或口腔頰黏膜等，進(jìn)行單個/較少細(xì)胞水平檢測方案的可行性和有效性驗證。④建議尋找并確定有效的遺傳標(biāo)記，如短串聯(lián)重復(fù)序列（shorttandemrepeat，STR）和單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP），建立雙親單體型分型，從而制定相應(yīng)的臨床檢測策略。（2）臨床檢測的建議：①建議PGT-M臨床檢測應(yīng)同時進(jìn)行基因致病變異位點(diǎn)的直接檢測和遺傳多態(tài)位點(diǎn)（STR或SNP）的連鎖分析，以避免因擴(kuò)增失敗、等位基因脫扣（alleledrop-out，ADO）等因素所導(dǎo)致的診斷不明［31］。②建議對于致病變異位點(diǎn)的連鎖分析，推薦在相應(yīng)致病基因上下游1Mb內(nèi)，各選擇不少于2個可用的SNP和/或STR位點(diǎn)用于分析。位點(diǎn)的選擇應(yīng)避免同源性高、GC含量高或有多聚核苷酸的序列。對于家系成員不全的情況，可以利用攜帶致病突變的極體或者單個精子或胚胎作為連鎖分析的依據(jù)。③建議在進(jìn)行遺傳連鎖分析時，特別注意致病變異附近的基因組重組情況。④建議采用PGT-M聯(lián)合胚胎染色體非整倍體檢測（PGTforaneuploidies，PGT-A）的檢測策略［32-33］。2.PGT-M的檢測方法：因PGT-M胚胎活檢細(xì)胞樣本稀少，在進(jìn)行下游遺傳學(xué)檢測前建議先進(jìn)行擴(kuò)增，以獲得充足的DNA樣本滿足擬采用的檢測策略。目前PGT-M技術(shù)中常用的胚胎DNA擴(kuò)增方式為單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增（whole-genomeamplification，WGA）［34］。（1）WGA：WGA是對單個細(xì)胞或少量細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增的技術(shù)。其目的是在盡量減少基因序列偏好性的前提下大幅度地增加DNA的總量，獲得基因組高覆蓋率的完整的擴(kuò)增產(chǎn)物。目前常用的WGA技術(shù)主要有多重置換擴(kuò)增（multipledisplacementamplification，MDA）［35］、多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增（multipleannealingandlooping-basedamplificationcycles，MALBAC）［36］和簡并寡核苷酸引物PCR（degenerateoligonucleotide-primedpolymerasechainreaction，DOP-PCR）等。①M(fèi)DA：MDA方法擴(kuò)增產(chǎn)物為10~100kb的DNA片段，復(fù)制的保真性強(qiáng)，基因組覆蓋度高，在對單核苷酸變異（singlenucleotidevariant，SNV）的分析以及構(gòu)建大片段文庫上有著顯著優(yōu)勢。但MDA存在擴(kuò)增偏倚，重復(fù)性稍差，應(yīng)用于拷貝數(shù)變異（copynumbervariations，CNV）檢測時需進(jìn)行數(shù)據(jù)校正。②MALBAC：MALBAC基因組擴(kuò)增存在一定可重復(fù)的序列偏好性，會造成基因組低覆蓋區(qū)CNV診斷偏倚，可經(jīng)過數(shù)據(jù)分析后進(jìn)行CNV校正。③DOP-PCR：由于PCR指數(shù)擴(kuò)增，任何擴(kuò)增過程中的細(xì)微偏差都會被放大，擴(kuò)增產(chǎn)物的覆蓋度較低［37］。（2）致病基因致病變異位點(diǎn)檢測技術(shù)①目標(biāo)變異位點(diǎn)測序：即包含致病變異位點(diǎn)和/或遺傳多態(tài)位點(diǎn)附近區(qū)域擴(kuò)增后Sanger測序［38-39］。主要用于點(diǎn)突變、小片段插入/缺失突變、遺傳多態(tài)位點(diǎn)的檢測。②片段分析：針對特定DNA靶點(diǎn)設(shè)計引物，每個靶點(diǎn)擴(kuò)增得到的大小不等的DNA片段；引物末端標(biāo)記熒光，PCR后產(chǎn)生帶不同熒光標(biāo)記的DNA片段；產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，利用熒光檢測器對DNA片段進(jìn)行識別和區(qū)分，從而提供片段大小、相對定量和基因分型等信息［32,40］。③限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）分析：限制性內(nèi)切酶能識別特定的DNA序列，當(dāng)致病變異生成新的或破壞了原有的限制性酶切位點(diǎn)時，酶切消化后會產(chǎn)生不同長度的片段，以此進(jìn)行分析［41］。該技術(shù)局限性在于限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)有限，而且酶切消化不完全或失敗導(dǎo)致誤診的可能［42］。④實時熒光定量PCR（quantitativereal-timePCR，qPCR）：變異位點(diǎn)（或多個位點(diǎn)）和遺傳信息標(biāo)記位點(diǎn)同時擴(kuò)增，探針設(shè)計靈活。目前已有許多成熟的適用于PGT-M基因分型的qPCR平臺和檢測試劑盒［43］。⑤雙突變擴(kuò)增阻滯系統(tǒng)檢測（dualamplificationrefractorymutationsystem，D-ARMS）結(jié)合qPCR：D-ARMS-qPCR方法主要用于變異類型為點(diǎn)突變、小片段插入/缺失突變的胚胎檢測。該方法可對已知突變進(jìn)行檢測，但對引物特異性的依賴較高，可用該方法檢測的疾病較少［44］。（3）致病基因的變異位點(diǎn)連鎖分析：當(dāng)胚胎樣本較少或致病變異位點(diǎn)檢測困難無法實現(xiàn)變異位點(diǎn)的直接檢測時，連鎖分析就更為重要。針對倒位、大片段缺失/重復(fù)等難以直接檢測的變異類型，采用基因上下游和基因內(nèi)部的遺傳多態(tài)位點(diǎn)（STR或SNP）連鎖分析進(jìn)行間接診斷［45］。3.PGT-M的檢測策略：單細(xì)胞或少量細(xì)胞經(jīng)WGA后進(jìn)行目標(biāo)變異位點(diǎn)檢測結(jié)合家系連鎖分析是目前PGT-M的主要檢測策略［46］。（1）基于WGA的SNP微陣列芯片檢測策略：該策略既可以檢測全基因組CNV，還可以基于SNP連鎖分析進(jìn)行單體型分型，但不能直接對突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，需要有先證者或相關(guān)家系成員樣本。該技術(shù)已成為國內(nèi)外PGT-M的常用檢測技術(shù)［47-49］。（2）基于WGA的高通量測序檢測策略：基于WGA的高通量測序技術(shù)越來越多地應(yīng)用于臨床PGT-M［50-53］。通過測序可同時得到胚胎染色體非整倍性信息和致病變異位點(diǎn)信息，同時利用致病基因周圍的SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析，實現(xiàn)一步測序完成胚胎的染色體篩查和致病變異位點(diǎn)檢測及連鎖分析。（3）通過高通量測序使用單體型挑選HLA配型一致的胚胎，要求同時具有夫妻雙方及患兒的DNA樣本。使用單體型HLA配型需要關(guān)注的HLA相關(guān)基因包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR和HLA-DQ。在具體單體型分析中，要求包括上述5個基因所在區(qū)域的上下游各不少于3個可用的雜合SNP位點(diǎn)。在包括上述5個基因的HLA區(qū)域內(nèi)，要求具有不少于6個可用的雜合SNP位點(diǎn)。在對胚胎進(jìn)行HLA配型的同時，需同時考慮檢測導(dǎo)致患兒疾病的突變位點(diǎn)，排除突變位點(diǎn)的遺傳。同時排除染色體數(shù)量異常。在得到胚胎單體型后，對于僅有母源或父源一方匹配的半合胚胎，夫妻雙方需充分知情后決定是否移植。（4）生殖腺嵌合的家系，需要采用特殊的連鎖分析策略進(jìn)行診斷，并建議對目標(biāo)變異位點(diǎn)進(jìn)行直接檢測。利用核心家系成員與至少兩名確診為同一單基因病的患兒確定“高?！眴误w型和“低?！眴误w型進(jìn)行連鎖分析。不建議使用未受累的樣本（子代、產(chǎn)前樣本或胚胎）作為單體型分型參考。可通過對單個精子或極體的分析對“高?！眴误w型和“低?！眴误w型進(jìn)行驗證。對于生殖腺嵌合家系，理論上攜帶“低?！眴误w型的胚胎可以移植，攜帶“高?！眴误w型而未檢測出致病變異的胚胎，由于單細(xì)胞擴(kuò)增過程等位基因脫扣風(fēng)險較大，不建議移植此類胚胎［32，54］。五.胚胎檢測報告與移植1.推薦PGT-M檢測報告應(yīng)包含以下信息［55］，①基本信息：報告標(biāo)題/名稱、報告的編號、分頁（包括實際頁數(shù)和總頁數(shù)）、報告的完成日期、送檢者、檢測者及審核者；②患者信息：夫妻的完整姓名和唯一患者識別碼、年齡、出生日期、性別及聯(lián)系方式等；③臨床信息：胚胎檢測項目，包括單基因病診斷、HLA分型及線粒體疾病檢測，其中單基因病需列明疾病名稱、遺傳方式、家系致病基因及變異位點(diǎn)等；胚胎信息，包括取卵日期、周期數(shù)、胚胎活檢樣本來源、活檢日期及胚胎編號等；PGT-M包括檢測結(jié)果、結(jié)果解釋與移植建議等；④檢測局限性和風(fēng)險等。2.胚胎移植（1）胚胎移植知情：①可移植胚胎的確定應(yīng)在輔助生殖實驗室、遺傳咨詢醫(yī)師、遺傳學(xué)檢測實驗室、臨床醫(yī)生和夫妻之間達(dá)成一致，不建議移植無結(jié)果或結(jié)論不確定的胚胎［56-58］。②對于常染色體隱性遺傳病或X-連鎖隱性遺傳病，在夫妻雙方充分知情后，可以考慮選擇移植攜帶變異但不受累的胚胎；對于PGT-M與染色體結(jié)構(gòu)異常檢測（PGTforstructuralrearrangements，PGT-SR）/PGT-A聯(lián)合診斷，建議夫妻咨詢后確定胚胎移植的優(yōu)先等級；對于HLA分型，建議夫妻咨詢后確定胚胎移植的優(yōu)先等級，告知夫妻胚胎HLA區(qū)域發(fā)生染色質(zhì)重排的可能性及風(fēng)險。③根據(jù)我國相關(guān)法律和倫理要求，不進(jìn)行非醫(yī)療目的的胚胎性別告知［56-58］。（2）胚胎解凍、移植：PGT-M均為囊胚凍融胚胎移植（frozen-thawedembryotransfer，F(xiàn)ET），如篩選出可以利用的胚胎，F(xiàn)ET同常規(guī)IVF-ET患者。①FET時間的確定：應(yīng)用自然周期、促排卵周期或人工周期建內(nèi)膜，排卵后5d或孕激素轉(zhuǎn)化內(nèi)膜后5~7d后移植囊胚。②FET囊胚數(shù)量：行PGT-M檢測的患者，建議行單胚胎移植。③黃體支持：PGT-M均為FET，取卵周期不行黃體支持。自然周期或促排卵周期可于排卵后（或黃素化日后）行常規(guī)孕激素補(bǔ)充；人工周期建內(nèi)膜患者于內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日開始加用孕激素，用量及用法參考相關(guān)共識及指南［22］。④妊娠后孕激素使用（移植后4周左右B超提示宮內(nèi)活胎后）：自然周期或促排卵周期移植者繼續(xù)應(yīng)用黃體支持1~3周停藥；人工周期移植者繼續(xù)雌孕激素原劑量用藥3~4周，之后2周內(nèi)逐漸減量至完全停藥［59-60］。六.PGT-M的臨床流程與質(zhì)量管理1.PGT-M的臨床流程：PGT-M的一般臨床流程包括遺傳咨詢和生殖咨詢、夫妻進(jìn)入輔助生殖治療周期、IVF和胚胎活檢、遺傳學(xué)檢測、胚胎移植、產(chǎn)前診斷、新生兒隨訪等，具體臨床流程見圖1。不同夫妻的需求存在差異，需在遵循基本臨床流程的基礎(chǔ)上，實施個體化治療方案。2.PGT-M的質(zhì)量管理：開展PGT的輔助生殖機(jī)構(gòu)及人員應(yīng)具備相關(guān)資質(zhì)，建議遵循ISO15189相關(guān)條例建立PGT-M全流程標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（standardoperationprocedure，SOP）體系，嚴(yán)格按照SOP執(zhí)行［61-62］。（1）夫妻入組質(zhì)量控制：①夫妻在進(jìn)入PGT-M治療周期前，需接受至少一次遺傳咨詢，按SOP要求保存完整的咨詢記錄、知情同意書和病案記錄。②對于入組評估或倫理要求有爭議的夫妻，需經(jīng)過專家會診或倫理委員會討論后決定是否進(jìn)行PGT-M。（2）胚胎實驗室質(zhì)量控制①胚胎實驗室的環(huán)境、儀器設(shè)備以及耗材使用均應(yīng)嚴(yán)格按照實驗室的SOP進(jìn)行管理。為避免交叉污染，在胚胎實驗室操作中，工作人員需全程穿著外科刷手衣，佩戴外科口罩、帽子，必要時佩戴無粉手套。②夫妻取卵前胚胎實驗室應(yīng)獲知夫妻的相關(guān)信息，包括但不限于夫妻姓名、PGT-M指征、活檢樣本類型（極體/卵裂球/滋養(yǎng)層細(xì)胞）及處理方式等。③胚胎實驗室內(nèi)需設(shè)立一個獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行活檢后樣本處理的操作，在每日實驗室工作結(jié)束之后需對該空間內(nèi)的所有操作臺面進(jìn)行清潔和滅菌（建議使用紫外線進(jìn)行滅菌），避免可能帶來的外源DNA污染。胚胎活檢要設(shè)立陰性對照樣本［23］。④PGT-M活檢過程中所需的所有耗材及試劑都需進(jìn)行單獨(dú)存放和標(biāo)記，并符合胚胎活檢及后續(xù)遺傳檢測的相關(guān)要求。試劑需分裝儲存，避免二次使用或反復(fù)凍融帶來的檢測異常，試劑存放應(yīng)避免溫度的變化導(dǎo)致擴(kuò)增效率的降低［63］?；顧z后樣本及相關(guān)試劑耗材應(yīng)存放在特定區(qū)域，遠(yuǎn)離DNA污染源。⑤活檢操作、活檢后細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的操作過程關(guān)鍵步驟雙人核對，活檢細(xì)胞的PCR管標(biāo)識清晰、唯一，對應(yīng)胚胎明確無誤。PGT-M胚胎在冷凍時，也應(yīng)確認(rèn)胚胎編號?；顧z完成后需將裝有活檢細(xì)胞的PCR