第06章 流式細(xì)胞術(shù)課件

第六章流式細(xì)胞術(shù)第06章流式細(xì)胞術(shù)dun第六章流式細(xì)胞術(shù)第一節(jié)流式細(xì)胞術(shù)概述第二節(jié)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展簡史第三節(jié)流式細(xì)胞儀主要技術(shù)指標(biāo)第四節(jié)流式細(xì)胞儀主要構(gòu)造和工作原理第五節(jié)流式細(xì)胞術(shù)常規(guī)檢測時的樣品制備第六節(jié)流式細(xì)胞計的調(diào)試和使用第七節(jié)流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用 第06章流式細(xì)胞術(shù)dun第一節(jié)流式細(xì)胞術(shù)概述流式細(xì)胞術(shù)(Flow

Cytometry，

FCM)是上世紀(jì)七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù)，它集計算機技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體，同時具有分析和分選細(xì)胞功能?？蓽y量細(xì)胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀，還可檢測細(xì)胞表面和細(xì)胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA含量等;可對群體細(xì)胞在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析，

在短時間內(nèi)檢測分析大量細(xì)胞，并收集、儲存和處理數(shù)據(jù)，進(jìn)行多參數(shù)定量分析；能夠分類收集(分選)某一亞群細(xì)胞，分選純度大于95%。第06章流式細(xì)胞術(shù)dunFCM特點①測量速度快，最快可在1秒種內(nèi)計測數(shù)萬個細(xì)胞；②可進(jìn)行多參數(shù)測量，可以對同一個細(xì)胞做有關(guān)物理、化學(xué)特性的多參數(shù)測量，并具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義；③是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術(shù)、計算機技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、圖像技術(shù)等從多領(lǐng)域的知識和成果；④既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。第06章流式細(xì)胞術(shù)dunFCM發(fā)展的水平凝聚了半個世紀(jì)以來人們在這方面的心血和成果，在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科和醫(yī)學(xué)、檢驗學(xué)等應(yīng)用學(xué)科得到廣泛應(yīng)用。目前使用的流式細(xì)胞儀主要由美國的兩個廠家生產(chǎn)：BECKMAN-

COULTER公司和Becton-Dickinson公司(簡稱B-D公司)。流式細(xì)胞儀主要有兩型：臨床型（又稱小型機、臺式機）和綜合型（又稱大型機、分析型）。綜合型除具備檢測分析功能外，還具有細(xì)胞分選功能，多用于科學(xué)研究。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun第二節(jié)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展簡史1934年，Moldavan首次提出了使懸浮的單個血紅細(xì)胞等流過玻璃毛細(xì)管，在亮視野下用顯微鏡進(jìn)行計數(shù)，并用光電記錄裝置計測的設(shè)想，在此之前，人們還習(xí)慣于測量靜止的細(xì)胞，因為要使單個細(xì)胞順次流過狹窄管道容易造成較大的細(xì)胞和細(xì)胞團塊的淤阻。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun1953年Crosland-Taylor根據(jù)雷諾對牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律的研究認(rèn)識到：管中軸線流過的鞘液流速越快，載物通過的能力越強，并具有較強的流體動力聚集作用。于是設(shè)計了一個流動室，使待分析的細(xì)胞懸浮液都集聚在圓管軸線附近流過，外層包圍著鞘液；細(xì)胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定了現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)中的液流技術(shù)基礎(chǔ)。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun1956年，Coulter在多年研究的基礎(chǔ)上利用Coulter效應(yīng)生產(chǎn)了Coulter計數(shù)器。其基本原理是：使細(xì)胞通過一個小孔，只在細(xì)胞與懸浮的介質(zhì)之間存在著導(dǎo)電性上的差異，便會影響小孔道的電阻特性，從而形成電脈沖信號，測量電脈沖的強度和個數(shù)則可獲得有關(guān)細(xì)胞大小和數(shù)目方面的信息。1967年Holm等設(shè)計了通過汞弧光燈激發(fā)熒光染色的細(xì)胞，再由光電檢測設(shè)備計數(shù)的裝置。1973年Steinkamp設(shè)計了一種利用激光激發(fā)雙色熒光色素標(biāo)記的細(xì)胞，既能分析計數(shù)，又能進(jìn)行細(xì)胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代FCM計數(shù)技術(shù)的主要歷程。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun現(xiàn)代的FCM數(shù)據(jù)采集和分析技術(shù)是從組織化學(xué)發(fā)源的。1965年，Kamentsky在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上提出了兩個新設(shè)想：(1)細(xì)胞的組分是可以用光度學(xué)來定量測定的，即分光光度術(shù)可以定量地獲得有關(guān)細(xì)胞組織化學(xué)的重要信息。(2)細(xì)胞的不同組分可以同時進(jìn)行多參數(shù)測量，從而可以對細(xì)胞進(jìn)行分類。Kamentsky不僅思路敏捷，而且能身體力行。他是第一個把計算機接口接到儀器上并記錄分析了多參數(shù)數(shù)據(jù)的人，也是第一個采用了二維直方圖來顯示和分析多參數(shù)的人。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞化學(xué)中的應(yīng)用的先驅(qū)者是VanDilla和美國的LosAlamos小組。1967年該研究組研制出流液束、照明光軸、檢測系統(tǒng)光軸三者相互正交的流式細(xì)胞計的基礎(chǔ)上，首次用熒光Feulgen反應(yīng)對DNA染色顯示出DNA的活性與熒光之間存在著線性關(guān)系，并在DNA的直方圖上清楚地顯示出細(xì)胞周期的各個時相。Gohde和Dittrich接著把這項技術(shù)推向?qū)嵱茫麄冇昧魇郊?xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期借以研究細(xì)胞藥代動力學(xué)問題。FCM用于免疫組織化學(xué)中的關(guān)鍵是對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，其它和在細(xì)胞化學(xué)的應(yīng)用并沒有多大差異。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun第三節(jié)流式細(xì)胞儀主要技術(shù)指標(biāo)3.1流式細(xì)胞儀的分析速度3.2流式細(xì)胞儀的熒光檢測靈敏度3.3前向角散射（FSC）光檢測靈敏度3.4流式細(xì)胞儀的分辨率3.5流式細(xì)胞儀的分選速度第06章流式細(xì)胞術(shù)dun3.1流式細(xì)胞儀的分析速度一般流式細(xì)胞儀每秒檢測1000～5000個細(xì)胞，大型機可達(dá)每秒上萬個細(xì)胞。3.2流式細(xì)胞儀的熒光檢測靈敏度最多能測出單個細(xì)胞上達(dá)600個的熒光分子，兩個細(xì)胞間的熒光差大于5%即可區(qū)分。3.3前向角散射（FSC）光檢測靈敏度前向角散射反映被測細(xì)胞的大小，一般流式細(xì)胞儀能夠測量到0.2μm～0.5μm。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun3.4流式細(xì)胞儀的分辨率用變異系數(shù)CV值來表示，一般流式細(xì)胞儀能夠達(dá)到低于2.0%，這也是測量標(biāo)本前用熒光微球調(diào)整儀器時要求必須達(dá)到的。3.5流式細(xì)胞儀的分選速度一般流式細(xì)胞儀分選速度大于1000個/秒，分選細(xì)胞純度可達(dá)99%以上。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun第四節(jié)流式細(xì)胞儀主要構(gòu)造和工作原理4.1流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)4.2激光光源及光束形成系統(tǒng)4.3光學(xué)系統(tǒng)4.4信號系統(tǒng)（檢測、存儲、顯示和分析）4.5細(xì)胞分選系統(tǒng)第06章流式細(xì)胞術(shù)dun流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)示意圖第06章流式細(xì)胞術(shù)dun4.1流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)流動室(Flow

Cell或Flow

Chamber)是流式細(xì)胞儀的核心部件流動室由石英玻璃制成單細(xì)胞懸液在細(xì)胞流動室里被鞘流液包繞通過流動室內(nèi)的一定孔徑的孔檢測區(qū)在該孔的中心，細(xì)胞在此與激光垂直相交，在鞘流液約束下細(xì)胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun流動室孔徑有60μm、100μm、150μm

、250μm等多種，供檢測者選擇。小型儀器一般固定裝置了一定孔徑的流動室。流動室里的鞘液流一般是穩(wěn)定流動，控制鞘液流的裝置是在流體力學(xué)理論的指導(dǎo)下由一系列壓力系統(tǒng)、壓力感受器組成。調(diào)整好鞘液壓力和標(biāo)本管壓力,

鞘液流包繞樣品流并使樣品流保持在液流的軸線方向，能夠保證每個細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時間相等，從而使激光激發(fā)的熒光信息準(zhǔn)確無誤。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun4.2激光光源及光束形成系統(tǒng)流式細(xì)胞儀的主要測定信號熒光是由激發(fā)光激發(fā)的，熒光信號的強弱與激發(fā)光的強度和照射時間相關(guān)。激光是一種相干光源，能提供單波長、高強度、高穩(wěn)定性的光照。流式細(xì)胞儀可配備一根或多根激光管，常用氬離子氣體激光管（波長488nm），此外可配備氦氖離子氣體激光管（波長633nm）和/或紫外激光管。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun在激光光源和流動室之間有兩個圓柱形透鏡，將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束(22μm×66μm)橢圓形激光光斑內(nèi)激光能量成正態(tài)分布，使通過激光檢測區(qū)的細(xì)胞受照強度一致。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun4.3光學(xué)系統(tǒng)流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)由若干組透鏡、小孔、濾光片組成，可分為流動室前和流動室后兩組。流動室前的光學(xué)系統(tǒng)由透鏡和小孔組成，透鏡和小孔（一般為2片透鏡、1個小孔）的主要作用是將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束，使激光能量成正態(tài)分布，使通過激光檢測區(qū)的細(xì)胞受照強度一致，最大限度的減少雜散光的干擾。流動室后的光學(xué)系統(tǒng)主要由多組濾光片組成，濾光片的主要作用是將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun濾光片主要有三類：長通濾片(LP)只允許特定波長以上的光線通過。短通濾片(SP)只允許特定波長以下的光線通過。；帶通濾片(BP)只允許特定波長的光線通過。不同組合的濾片可以將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管(PMT)，如接收綠色熒光(FITC)的PMT前面配置的濾光片是LP550和BP525，接收色橙紅色熒光(PE)的PMT前面配置的濾光片是LP600和BP575，接收紅色熒光(CY5)的PMT前面配置的濾光片是LP650和BP675。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun4.4信號系統(tǒng)（檢測、存儲、顯示和分析）當(dāng)測定標(biāo)本在鞘流液的約束下，細(xì)胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)時，產(chǎn)生散射光和熒光信號。散射光分為：前向角散射或0o散射（Forward

Scatter，F(xiàn)S）側(cè)向角散射或90o散射（Side

Scatter，SS）。散射光是細(xì)胞的物理參數(shù)，與細(xì)胞樣本的制備(如染色)無關(guān)。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun前向角散射(FS)反映被測細(xì)胞的大小，它由正對著流動室的光電二極管裝置，接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?。?cè)向角散射(SS)反映被測細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核膜的折射率和細(xì)胞內(nèi)顆粒的性狀，它由一個光電倍增管(PMT)

接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，這些電信號存儲在流式細(xì)胞儀的計算機硬盤或軟盤內(nèi)。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun熒光信號也有兩種：一種是細(xì)胞自發(fā)熒光，它一般很微弱。一種是細(xì)胞樣本經(jīng)標(biāo)有特異熒光素的單克隆抗體染色后，經(jīng)激光激發(fā)發(fā)出的熒光，它是我們要測定的熒光，熒光信號較強。這兩種熒光信號的同時存在是我們測定時需要設(shè)定陰性對照的理由，以便從測出的熒光信號中減去細(xì)胞自發(fā)熒光和抗體非特異結(jié)合產(chǎn)生的熒光。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun流式細(xì)胞儀測定常用的熒光染料有多種，其分子結(jié)構(gòu)不同，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜也各異，選擇熒光染料時必須依據(jù)流式細(xì)胞儀所配備的激光光源的發(fā)射光波長。如氬離子氣體激光管，它的發(fā)射光波488nm。氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長633nm。488nm激光光源常用的熒光染料有FITC（異硫氰酸熒光素）、PE（藻紅蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(葉綠素蛋白)、ECD(藻紅蛋白-得克薩斯紅)等。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun各種熒光信號由各自的光電倍增管(PMT)

接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柡螅鎯υ诹魇郊?xì)胞儀的計算機硬盤或軟盤內(nèi)。信號存儲時，數(shù)據(jù)一般是以List

mode（列表排隊）方式存入的。采用List

mode方式有兩大優(yōu)點：①節(jié)約內(nèi)存和磁盤空間；②易于加工處理分析。List

mode方式數(shù)據(jù)缺乏直觀性，數(shù)據(jù)的顯示和分析一般采用一維直方圖、二維點陣圖、等高線圖和密度圖等。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(1)單參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析細(xì)胞的每一個單參數(shù)測量數(shù)據(jù)用直方圖來顯示橫坐標(biāo)表示散射光或熒光信號相對強度值，其單位是道數(shù)，可以是線性的，也可以是對數(shù)的縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(2)雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析：細(xì)胞的雙參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系用一維直方圖、二維點陣圖、假三維地形圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun二維點陣圖前向散射光（FS）和側(cè)向散射光（SS）組成的點陣圖，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)均是線性的，圖中的細(xì)胞可以很容易地圈“門”(

Bitmap，無定型門)，從而分析各亞群細(xì)胞的數(shù)據(jù)第06章流式細(xì)胞術(shù)dun假三維地形圖X軸：SSC；Y軸：FSC；Z軸：細(xì)胞數(shù)。儀器的計算機很容易給出兩種熒光的測定值：陰性細(xì)胞%、兩種熒光各自的陽性細(xì)胞%、兩種熒光的雙陽性細(xì)胞%、各群細(xì)胞的平均熒光強度等。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun等高線圖分別是測定細(xì)胞的兩種熒光雙參數(shù)數(shù)據(jù)，橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別代表一種熒光參數(shù)，同理只要設(shè)定“十字門”就可得到兩種熒光的各種測定值，密度圖和等高線圖較點陣圖更直觀。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(3)三參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析：細(xì)胞的三參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系每兩個數(shù)據(jù)組成一對（三參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細(xì)胞數(shù)量每兩個數(shù)據(jù)可組成6對數(shù)據(jù)）用一維直方圖、二維點陣圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。三個熒光數(shù)據(jù)關(guān)系可以用分光圖（prism）表示，分光圖可直接給出8個數(shù)據(jù)（如ABC代表3種熒光，可有A+B+C+、A+B+C-

、A-B+C+、

A+B-C+

、A+B-C-、

A-B+C-、

A-B-C+、A-B-C-）。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun列表模式其實只是多參數(shù)數(shù)據(jù)文件的一種計算機存貯方式三個以上的參數(shù)數(shù)據(jù)顯示是用多個直方圖、二維圖和假三維圖來完成的。可用ListMode中的特殊技術(shù)，開窗或用游標(biāo)調(diào)出相關(guān)部分再改變維數(shù)進(jìn)行顯示。例如，“一調(diào)二”就是在一維圖上調(diào)出二維圖來；“二調(diào)一”就是從二維圖中調(diào)出一維圖來。下圖給出了從二維圖等高圖中調(diào)出相應(yīng)窗口的直方圖的示意圖。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun從二維圖設(shè)窗調(diào)出直方圖示意第06章流式細(xì)胞術(shù)dun4.5細(xì)胞分選系統(tǒng)如果在細(xì)胞流動室上裝有超聲壓電晶體，通電后超聲壓電晶體發(fā)生高頻震動，可帶動細(xì)胞流動室高頻震動，使細(xì)胞流動室里噴嘴流出的液流束被連續(xù)分?jǐn)喑梢贿B串均勻的液滴，每秒鐘形成液滴上萬個。每個液滴中包含著一個樣品細(xì)胞，液滴中的細(xì)胞在形成液滴前已被測量，如符合預(yù)定要求則可被充電，在通過偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場時向左或向右偏轉(zhuǎn)被收集在指定容器中；不含細(xì)胞液滴或細(xì)胞不符合預(yù)定要求液滴不被充電，亦不發(fā)生偏轉(zhuǎn)而進(jìn)入中間廢液收集器中，從而實現(xiàn)了分選。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun第五節(jié)常規(guī)檢測時的樣品制備5.1直接免疫熒光標(biāo)記法5.2間接免疫熒光標(biāo)記法5.3最小化非特異性結(jié)合的方法第06章流式細(xì)胞術(shù)dun5.1直接免疫熒光標(biāo)記法取一定量細(xì)胞(約1×106細(xì)胞／mL)，在每一管中分別加入50μl的平衡鹽緩沖液，并充分混勻，于室溫中靜置1分鐘以上，再直接加入連接有熒光素的抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記反應(yīng)（如做雙標(biāo)或多標(biāo)染色，可把幾種標(biāo)記有不同熒光素的抗體同時加入），孵育20-60分鐘后，用PBS(pH7.2-7.4)洗1~2次，加入緩沖液重新懸浮，上機檢測。優(yōu)點：操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，易于分析，適用于同一細(xì)胞群的多參數(shù)的同時測定。雖然直標(biāo)抗體成本較高，但減少了間接標(biāo)記法中較強的非特異熒光的干擾，更適用于臨床標(biāo)本的檢測。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun5.2間接免疫熒光標(biāo)記法取一定量的細(xì)胞懸液(約1×106細(xì)胞／mL)，先加入特異的第一抗體，待反應(yīng)完全后，洗去未結(jié)合抗體，再加入熒光標(biāo)記的第二抗體，生成抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物，以FCM檢測激發(fā)熒光。優(yōu)點：費用較低，二抗應(yīng)用廣泛，多用于科研。缺點：①二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強，易影響實驗結(jié)果。所以標(biāo)本制備時應(yīng)加入陰性或陽性對照。②步驟較多，增加了細(xì)胞的丟失，不適用測定細(xì)胞數(shù)較少的標(biāo)本。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun5.3最小化非特異性結(jié)合的方法(1)熒光標(biāo)記的抗體的濃度應(yīng)該合適，如果濃度過高，背景會因為非特異性的相互作用的增加而增高。(2)在使用第一抗體之前，將樣品與過量的蛋白（如小牛血清蛋白(BSA)、或來自于同一寄主的正常血清來作為標(biāo)記的第二抗體）一起培育，這個步驟通過阻斷（封阻）第一抗體和細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的非特異性交互作用來降低背景。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(3)在使用第一抗體之后，將樣品與5%至10%的來自于同一寄主的正常血清和作為標(biāo)記的第二抗體一起培育，這個步驟會減少不必要的第二抗體與第一抗體、細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間的交互作用。用來自于同樣的樣品的血清稀釋標(biāo)記過的抗體可以略過此步驟。此步驟也可能引入不良影響。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(4)使用F(ab’)2片段會使背景決定于第一或第二抗體與FC受體的全分子結(jié)合。大多數(shù)的第二抗體的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗體的F(ab’)2片段一般是不能利用或很難制作。在NaN3存在的條件下，將新鮮組織或細(xì)胞與正常血清一起培育應(yīng)選擇優(yōu)先加入第一抗體。在此情況下，即使在隨后的步驟中用完所有的抗體分子，F(xiàn)C受體決定的背景影響已不再重要。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(5)其它已標(biāo)記的抗體和其他一些內(nèi)在的免疫球蛋白或加入實驗系統(tǒng)中的其它物質(zhì)的交叉反應(yīng)也可能會有背景影響。為了降低背景，在多重標(biāo)記過程中，所有的已標(biāo)記的抗體應(yīng)被吸附，避免其他種類蛋白的交叉反應(yīng)。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun第六節(jié)流式細(xì)胞計的調(diào)試和使用6.1調(diào)試和校準(zhǔn)6.2儀器的操作和使用第06章流式細(xì)胞術(shù)dun6.1調(diào)試和校準(zhǔn)流式細(xì)胞計在使用前，甚至在使用過程中都要精心進(jìn)行調(diào)試，以保證工作的可靠性和最佳性。調(diào)試的項目主要是激光強度、液流速度和測量區(qū)的光路等。激光強度：除調(diào)整反射鏡的角度以調(diào)整到所需波長的激光出光外，還要結(jié)合顯示屏上的光譜曲線使激光的強度輸出為最大。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun液流速度：可通過操作臺數(shù)字顯示監(jiān)督，調(diào)節(jié)氣體壓力大小以獲得穩(wěn)定的液流速度。測量區(qū)光路調(diào)節(jié)：這是調(diào)試工作的關(guān)鍵。需要保證在測量區(qū)的液流、激光束、90°散射測量光電系統(tǒng)垂直正交，而且交點較小。一般可在用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球等校準(zhǔn)中完成。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun6.2儀器的操作和使用①打開電源，對系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)熱；②打開氣體閾，調(diào)節(jié)壓力，獲得適宜的液流速度；開啟光源冷卻系統(tǒng)；③樣品管中加入去離子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；④利用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品，在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上，0o和90o散射的熒光強度最強，并要求變異系數(shù)為最?。虎葸x定流速、測量細(xì)胞數(shù)、測量參數(shù)等，同時選擇計算機屏上數(shù)據(jù)的顯示方式；⑥樣品測量完畢后，用去離子水沖洗液流系統(tǒng)；⑦關(guān)閉氣體、測量裝置，用計算機進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；⑧將所需結(jié)果打印出來。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun在操作和使用中一定要注意如下事項：①光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件，暴露的較強的光線下以后，需要較長時間的“暗適應(yīng)”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽；②光源不得在短時間內(nèi)(一般要1h左右)關(guān)上又打開；使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常；③液流系統(tǒng)必需隨時保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要經(jīng)過過濾、消毒；④注意根據(jù)測量對象的變換選用合適的濾片系統(tǒng)、放大器的類型等；⑤特別強度每次測量都需要對照組。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun第七節(jié)流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用7.1細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測7.2流式細(xì)胞術(shù)分析血小板7.3細(xì)胞凋亡研究第06章流式細(xì)胞術(shù)dun7.1細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測1、概述檢測單個細(xì)胞特定細(xì)胞因子的表達(dá)手段包括：ELISPOT、原位雜交、免疫細(xì)胞化學(xué)、限制性稀釋分析（limitingdilutionanalysis，LDA）和單細(xì)胞PCR等。原位雜交和免疫組化觀察細(xì)胞因子蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)，可以識別Th1和Th2細(xì)胞，能夠可獲得較強的細(xì)胞內(nèi)信號，但工作量大、主觀性強，難以大樣本檢測，且人肉眼識別能力有很大的局限性。第06章流式細(xì)胞術(shù)dunELISPOT及單細(xì)胞PCR技術(shù)，技術(shù)性強、勞動強度大，難以進(jìn)行廣泛推廣。自然狀態(tài)下，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生少量的細(xì)胞因子，通常要對T淋巴細(xì)胞體外活化進(jìn)行研究。在體外刺激過程中，T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子已釋放出來，胞內(nèi)細(xì)胞因子信號較弱，難以進(jìn)行檢測。Jung與Picker采用Monensin、PMA等藥物預(yù)孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin阻斷胞內(nèi)高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運，使得細(xì)胞因子聚集、蓄積，增強細(xì)胞因子信號可被流式細(xì)胞儀檢測。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun胞內(nèi)流式分析法用抗細(xì)胞因子抗體與細(xì)胞表面或胞內(nèi)特定亞群標(biāo)志組合，即可檢測不同細(xì)胞亞群細(xì)胞因子的分泌。同時采用特殊的化學(xué)與抗體選擇，確保靜止與無細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的最小熒光背景。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun2、常用的標(biāo)本類型和處理方法全血使用肝素鈉抗凝的真空采血管采血，不宜采用肝素鋰、EDTA和ACD抗凝劑。血樣在8小時內(nèi)分析，超過8小時會導(dǎo)致活性的損失，一般細(xì)胞因子陽性細(xì)胞會減少5%。如不能在8小時之內(nèi)檢測，應(yīng)將真空采血管水平放置于室溫。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun4、所需試劑(1)細(xì)胞表面染色的熒光標(biāo)記的單抗試劑依據(jù)實驗需要選擇特殊表面標(biāo)志：CD45圈定所有淋巴細(xì)胞；CD3圈定T淋巴細(xì)胞；CD4圈定T輔助淋巴細(xì)胞亞群；CD8圈定T抑制淋巴細(xì)胞亞群；CD19/或CD20圈定B淋巴細(xì)胞；CD56圈定NK淋巴細(xì)胞；CD14圈定單核細(xì)胞。(2)熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體：FITC、PE和APC標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體。(3)溶血素：用外周全血檢測時需使用溶血素溶解紅細(xì)胞。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(4)激活劑Phorbol12-Myristate13Acetate(PMA)，配置儲液分裝，-20℃儲存，勿反復(fù)凍融，每次實驗稀釋儲存液。Ionomycin于-20℃儲存，實驗時稀釋儲存液。StaphylococcalenterotoxinB(SEB)，4℃儲存。CD3：包被在培養(yǎng)板中，在蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑存在下活化未稀釋的血液細(xì)胞。CD28：加速不同刺激劑（包括SEB、CD3等）的活化效應(yīng)。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(5)阻斷劑阻斷高爾基體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運作用，使得刺激細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子聚集在胞漿內(nèi)。①Brefeldin-A(BFA)分裝，-20℃儲存，勿反復(fù)凍融，實驗使稀釋儲存液。②Monensin第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(6)不含谷氨酰胺的RPMI-1640。(7)固定劑：含4%的多聚甲醛PBS溶液。細(xì)胞在體外刺激后需要對細(xì)胞進(jìn)行固定。固定的目的在于通過蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細(xì)胞因子固定在細(xì)胞內(nèi)，另一方面避免細(xì)胞表面抗原丟失。(8)破膜劑：含1%皂甙、0.05%疊氮化鈉的Hanks溶液(HBBS)。將細(xì)胞膜穿孔，已利于熒光標(biāo)記的細(xì)胞因子抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，于相應(yīng)的細(xì)胞因子結(jié)合.(9)其它試劑：無菌無疊氮鈉PBS、乙醇、含1%多聚甲醛的PBS，4℃儲存。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun5、細(xì)胞培養(yǎng)和刺激的基本方法細(xì)胞活化的最終結(jié)果是產(chǎn)生細(xì)胞因子，根據(jù)檢測指標(biāo)和標(biāo)本的不同，選擇不同的刺激劑和刺激時間，以獲得最佳的實驗結(jié)果。為防止細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子分泌到胞外，在培養(yǎng)的最后4-6個小時，需要使用蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑(如3uMmonensin，10mg/ml的BFA)第06章流式細(xì)胞術(shù)dun檢測細(xì)胞因子陽性對照刺激方法人IFN-

方法2(4-24小時)人TIMP-1方法5人TNF-方法7(6小時)人IL-1

方法3(6小時)人IL-1方法3(24小時)人IL-2方法2(4-24小時)人IL-4方法4人IL-5方法1人IL-6單核細(xì)胞：方法3(6-12小時)；T細(xì)胞：方法6人IL-10方法1檢測細(xì)胞因子陽性對照刺激方法人IL-12方法8人IL-15方法3人Fractalkine/CX3CL1方法1人IL-8/CXCL8方法3(24小時)人MCP-1/CCL2方法3(24小時)人MIP-1

/CCL3方法3(24小時)人MIP-1

/CCL4方法3(24小時)人RANTES/CCL5方法1小鼠IL-2方法9小鼠IL-4方法10小鼠IL-5方法10小鼠IL-6方法11小鼠IFN方法9or方法12小鼠TNF-方法9細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子流式檢測推薦的陽性對照活化方法第06章流式細(xì)胞術(shù)dun方法1：只使用轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測；方法2：人的PBMCs使用PMA(10ng/ml)和Ionomycin(1uM)刺激4-24小時；方法3：人的PBMC使用LPS(0.5-1ug/ml)刺激24小時；方法4：人的PBMCs或者純化的CD4+細(xì)胞在包被人CD3抗體的培養(yǎng)板中，使用含有重組人的IL-2（10ng/ml）和IL-4（10ng/ml）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；細(xì)胞洗滌后在含有重組人IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2天；最后收獲細(xì)胞，使用PMA(10ng/ml)和Ionomycin(1uM)刺激6小時；方法5：CD4+T細(xì)胞使用PHA(10ng/ml)刺激4天；方法6：T細(xì)胞使用抗CD3的單抗、抗CD28的單抗和重組人的IL-1

(ClinImmunoImmunopath70:1)；方法7：使用PMA(50ng/ml)和Ionomycin(500ng/ml)刺激；方法8：將PBMCs細(xì)胞使用重組人IFN(10ng/ml)刺激2小時，后使用IFN(10ng/ml)+LPS(1ug/ml)刺激22小時或者使用相同的方法刺激THP-1細(xì)胞；方法9：EL4在包被抗小鼠CD3抗體(25ug/ml)的培養(yǎng)板中，使用抗CD28抗體(2ug/ml)+PMA(5ng/ml)+Ionomycin(500ng/ml)刺激6小時；方法10：CD4+T細(xì)胞在包被小鼠CD3(25ug/ml)抗體的培養(yǎng)板中，使用含有抗小鼠的CD28(2ug/ml)的抗體，重組小鼠的IL-2（10ng/ml）和IL-4（50ng/ml）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；然后在含有重組小鼠IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3天；最后收獲細(xì)胞，使用PMA(5ng/ml)、Ionomycin(500ng/ml)和monensin刺激6小時；方法11：小鼠ip巨噬細(xì)胞使用Mouseip1ug/mlLPS刺激24小時；方法12：小鼠脾細(xì)胞使用PMA(5ng/ml)和Ionomycin(500ng/ml)刺激6小時。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun6、流式檢測細(xì)胞染色基本過程(1)收獲細(xì)胞(2)阻斷Fc受體(3)細(xì)胞表面染色(4)固定和破膜(5)細(xì)胞內(nèi)染色(6)上機或加入PFA固定后再上機第06章流式細(xì)胞術(shù)dun7.2流式細(xì)胞術(shù)分析血小板血栓性疾病、出血性疾病、心血管疾病以及自身免疫性血小板減少癥等疾病的病理生理過程與血小板相關(guān)。血小板功能檢測包括黏附、聚集和活化功能試驗。流式細(xì)胞儀檢測全血中血小板表面相關(guān)標(biāo)志物，拓寬了血小板相關(guān)疾病的診斷與功能研究方法，豐富了血小板功能評估指標(biāo)。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun1、流式細(xì)胞儀血小板分析應(yīng)用范圍(1)通過分析信號傳遞、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、顆粒釋放、糖蛋白構(gòu)形、膜磷脂、與抗凝因子的結(jié)合和微粒形成，分析血小板活化，血小板對刺激物的反應(yīng)性。(2)通過分析受激后表面結(jié)合蛋白觸發(fā)凝血鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和表面糖蛋白缺陷檢測，分析血小板止血功能的獲得性和遺傳性缺陷。(3)結(jié)合血小板大小，檢測血小板RNA含量，分析血小板成熟度，計數(shù)網(wǎng)織血小板。(4)發(fā)現(xiàn)血小板抗體，做定性和定量分析。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun2、血小板分析的臨床意義(1)血栓性疾病活化血小板的檢測能預(yù)測冠狀血管成形術(shù)后發(fā)生急性缺血事件的危險性；非風(fēng)濕性心房纖顫患者栓塞和栓塞前期均有血小板活化；胰島素依賴性糖尿病，子癇前期，外周血管疾病等均可測出血小板活力增加和(或)循環(huán)中存在活化血小板；早產(chǎn)兒的血小板對凝血酶、二磷酸腺苷(ADP)、TXA2的體外激活能力降低。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(2)血小板缺陷性疾病全血法流式細(xì)胞術(shù)提供了一個簡單、迅速的方法來診斷血小板膜糖蛋白缺陷性疾病，如1：巨大血小板綜合征，是由于GPIb-IX復(fù)合物先天缺陷，導(dǎo)致血小板形態(tài)巨大，功能異常的出血性疾病。如2：血小板無力癥，是由于GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物先天缺陷，導(dǎo)致血小板聚集功能障礙。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(3)貯存池疾病原發(fā)性貯存池疾病（δ-SPD）常規(guī)用血小板聚集法檢測，但特異性和靈敏度均不理想。檢測血小板致密顆粒的阿的平熒光顯微鏡法，主觀性大，操作繁瑣，一次檢測的血小板數(shù)目有限。全血法流式細(xì)胞術(shù)為δ-SPD的診斷簡單、迅速，一次能定量檢測5000個以上阿的平染色的血小板。與正常人相比，δ-SPD患者阿的平染色顯著下降(從49%降至15%)。常在骨髓增殖異常綜合征和晚期腎衰中出現(xiàn)的獲得性致密顆粒貯存池疾病，也能用全血法流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測和診斷。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(4)血小板減少性疾病破壞過多或生成減少均能導(dǎo)致血小板減少。血小板相關(guān)抗體（PAIg）是反映血小板的破壞的指標(biāo)（臨床意義仍有爭議）。PAIg的檢測有多種方法，但流式細(xì)胞術(shù)法有其優(yōu)越性。流式細(xì)胞儀能測定單個血小板上的PAIg，只要測定104甚至103個血小板，在統(tǒng)計學(xué)上就能精確地得出PAIg的平均水平，因而用血量少，只要1ml血液制備的血小板就足夠。流式細(xì)胞術(shù)還能同時測定其他一些反映血小板破壞的指標(biāo)，如PAIgG、PAIgM、C3等。血小板的生成與巨核細(xì)胞有關(guān)，全血法流式細(xì)胞術(shù)能像檢測網(wǎng)織紅細(xì)胞那樣，檢測分泌到循環(huán)中的“網(wǎng)織”血小板，來判斷血小板的生成。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(5)血小板儲存與輸注用P-選擇素(CD62)、CD63、GPⅡb/Ⅲa作分子標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)血庫中儲存血小板有時間依賴性的活化現(xiàn)象。儲存5天以上，40%～60%血小板表達(dá)活化標(biāo)志CD62。雖然其形態(tài)改變、乳酸脫氫酶泄漏以及β-TG的釋放也能反映其活化，但用CD62作為儲存血小板的質(zhì)量控制指標(biāo)最理想?；罨难“逶谘h(huán)中的存活時間很短。若血小板在儲存時活化了，即使輸注也不能很好地提高患者止血能力。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(6)抗血栓藥物的監(jiān)測活化血小板的檢測可以判斷患者是否需要抗血栓藥物治療。也可以監(jiān)測這些抗血栓藥物的作用，避免毒副反應(yīng)的發(fā)生。(7)此外，全血法流式細(xì)胞術(shù)還可用于檢測血小板聚集，研究其免疫表型HPA-Ⅰa，測定嚴(yán)重血小板減少患者的血小板數(shù)目。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun3、流式細(xì)胞儀分析全血中血小板的優(yōu)點(1)全血中血小板更接近生理狀態(tài)。(2)操作簡便，減少操作造成的血小板狀態(tài)改變。(3)同時檢測血小板的多個標(biāo)志物，結(jié)合FSC和SSC，評估多個參數(shù)，進(jìn)行定量分析。(4)多采用血小板特異抗體，找出血小板，避免雜質(zhì)碎片的干擾。(5)檢測血小板亞群靈敏度高。(6)用血量少。(7)無放射性污染。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun4、全血樣本的制備(1)抽取抗凝全血：檢測血小板功能時，應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)化的抽血規(guī)程。做血小板活化試驗時，應(yīng)盡量減少人為造成的血小板活化。(2)Falcon管中加取全血和適量直標(biāo)熒光抗體，充分混勻，室溫避光處反應(yīng)，通常放置15分鐘。(3)1%多聚甲醛固定樣本。(4)上機檢測。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun5、質(zhì)量控制標(biāo)本(1)陰性對照(IsotypeControl)：非特異熒光的強弱取決于抗體濃度、單克隆熒光抗體特異性和純度，應(yīng)與試驗管抗體相對應(yīng)。在多色分析時，同型對照應(yīng)與其它抗體同時使用，以避免補償造成的誤差。(2)血小板體外活化試驗：使用正常人活化標(biāo)本作為陽性質(zhì)控。使用正常人未活化標(biāo)本作為陰性質(zhì)控。(3)血小板自身抗體檢測：使用含有已知血小板抗體的血清與血小板孵育，作為陽性質(zhì)控。使用不含血小板抗體的血清與血小板孵育，作為陰性質(zhì)控。(4)血小板表面抗原缺失：如巨血小板癥，血小板表面CD42a/CD42b缺失，血小板無力癥血小板表面gpIIb/IIIa，即CD41/CD61缺失或異常。使用正常人標(biāo)本做陽性對照，抗體的同型對照做陰性對照。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun6、數(shù)據(jù)分析——設(shè)門：(1)FSC-SSC點圖中找出血小板，缺點是血小板較小，不易通過大小將碎片或雜質(zhì)完全分開第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(2)從CD41或CD61-SSC點圖中畫出血小板門，由于特異性高，可以有效地去除碎片和雜質(zhì)的干擾。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun7.3細(xì)胞凋亡研究細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在基因控制下的有序死亡，在疾病發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，因而研究細(xì)胞凋亡有重要意義。細(xì)胞凋亡檢測方法很多，應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)可根據(jù)細(xì)胞在凋亡過程中發(fā)生一系列形態(tài)、生化變化從多個角度對細(xì)胞凋亡進(jìn)行定性和定量的測定。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun1、細(xì)胞形態(tài)變化通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞光散射的變化來觀察細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞前向角光散射的能力顯著降低，90°角光散射的能力增加；在細(xì)胞凋亡晚期，前向角和90°角光散射的信號均降低。此方法特異性不強，目前使用較少。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun2、細(xì)胞膜功能改變(1)磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine

PS）異位正常情況下，PS位于細(xì)胞膜內(nèi)層，細(xì)胞發(fā)生凋亡時PS從細(xì)胞膜內(nèi)翻轉(zhuǎn)并暴露在細(xì)胞膜外層，是細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期事件。PS與Annexin

Ⅴ（一種具有強力抗凝作用的血管蛋白）具有高度親和力。應(yīng)用流式細(xì)胞儀采用FITC-

Annexin

Ⅴ/PI雙染法進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測，操作過程簡單，指標(biāo)敏感可同時描述三群不同狀態(tài)細(xì)胞：FITC-

Annexin

Ⅴ-/PI-細(xì)胞，即正?；盍?xì)胞；FITC-

Annexin

Ⅴ+/PI-細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞；FITC-

Annexin

Ⅴ+/PI+細(xì)胞，即已死亡細(xì)胞。第06章流式細(xì)胞術(shù)dun(2)PI/Hoechst33342雙染法Hoechst33342（HO）是一種DNA的特異性熒光染料，可通過完整細(xì)胞膜。應(yīng)用PI/Hoechst33342可將細(xì)胞分為三群：正常活細(xì)胞（HO強/

PI-）；凋亡細(xì)胞（HO弱/

PI-），（由于凋亡細(xì)胞發(fā)生DNA降解和