生化制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

2024/11/51第一節(jié)概述

天然生物材料制備生化藥物的過(guò)程大體為：①原料的選樣和預(yù)處理；②原料的粉碎；③提取，即從原料中經(jīng)溶劑分離有效成分，制成粗品的工藝過(guò)程；④純化，即粗制品經(jīng)鹽析、有機(jī)溶劑沉淀、吸附、層析、透析、超離心、膜分離、結(jié)晶等步驟進(jìn)行精制的工藝過(guò)程；⑤干燥及保存；⑥制劑，即原料藥經(jīng)精細(xì)加工制成片劑、針劑、凍干劑等供臨床應(yīng)用的各種劑型。2024/11/52第二節(jié)原料選擇和預(yù)處理原料選擇的基本原則①要選擇有效成分含量高的新鮮材料；②來(lái)源豐富易得；③制造工藝簡(jiǎn)單易行；④成本比較低；⑤經(jīng)濟(jì)效果要好。

2024/11/53第三節(jié)原料的粉碎

一、機(jī)械法粉碎少量原料時(shí)，可使用高速組織搗碎機(jī)(10000r／min)、勻漿器、研缽等。工業(yè)生產(chǎn)上一般常用的粉碎設(shè)備有電磨機(jī)、球磨機(jī)、萬(wàn)能粉碎機(jī)，絞肉機(jī)、擊碎機(jī)等。二、物理法

1．反復(fù)凍融法；2．冷熱交替法；

3．超聲波處理法；4．加壓破碎法。2024/11/54第三節(jié)原料的粉碎三、生化和化學(xué)方法

1．自溶法

2．溶菌酶處理法

3.表面活性劑處理法

2024/11/55第四節(jié)提取

分固-液、液-液提取提取條件的選擇：溶劑、PH值、溫度影響提取的因素：被提取物質(zhì)溶解度的大小、擴(kuò)散作用的影響、分配作用的影響超臨界流體萃?。?024/11/56第五節(jié)分離純化

主要應(yīng)用的方法有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、pI沉淀法、膜分離法、層析法、凝膠過(guò)濾法、離子交換法等。一、鹽析法

1.鹽析及方法利用不同蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中，溶解度不同程度的降低來(lái)進(jìn)行分離純化的方法。有Ks法和β法。

2.特點(diǎn)對(duì)設(shè)備和條件要求低，安全，應(yīng)用范圍廣泛。在高濃度鹽存在下，蛋白質(zhì)不易發(fā)生變化，一般可在室溫下進(jìn)行操作。分辨率低，Ks法多用于提取液的前期分離工作。

2024/11/57第五節(jié)分離純化一、鹽析法

3.常用的中性鹽和加入方式常用中性鹽有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸納、氯化鈉、磷酸鈉等。硫酸銨的鹽析能力強(qiáng)，飽和溶液濃度大，溶解度受溫度影響小，一般不會(huì)使蛋白質(zhì)變性，缺點(diǎn)是緩沖能力差，pH常在4．5—5．5之間。但價(jià)廉易得，分段分離效果也比其他鹽類好。加入方式：分步固體鹽或飽和溶液2024/11/58第五節(jié)分離純化一、鹽析法

4.鹽析時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題

(1)鹽飽和度的影響；(2)pH的選擇；（3）蛋白質(zhì)濃度的影響；（4）溫度的影響；（5）鹽析沉淀物的脫鹽；

2024/11/59第五節(jié)分離純化二、有機(jī)溶劑沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中的溶解度差異而分離的方法，稱有機(jī)溶劑沉淀法。乙醇和丙酮是最常用的有機(jī)溶劑。有機(jī)溶劑沉淀法比鹽析法分辨力強(qiáng)，沉淀也好過(guò)濾，但對(duì)有些生物活性物質(zhì)能引起失活和變性。應(yīng)用時(shí)還應(yīng)注意防止溶劑揮發(fā)和火災(zāi)等。

2024/11/510第五節(jié)分離純化有機(jī)溶劑沉淀時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題

1控制工藝過(guò)程的溫度；

2防止溶劑局部濃度過(guò)高；

3及時(shí)處理沉淀物；

4pH值的選擇;5比鹽析法條件嚴(yán)格;2024/11/511第五節(jié)分離純化三、等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)：

2024/11/512第五節(jié)分離純化三、等電點(diǎn)沉淀法利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，而各種蛋白質(zhì)又具有不同的等電點(diǎn)的特性進(jìn)行分離的工藝過(guò)程，稱等電點(diǎn)沉淀法。由于各種蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，仍有一定的溶解度而沉淀不完全，多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)又都十分接近，所以單獨(dú)使用效果不理想，分辨力差，多用于提取后除雜蛋白，實(shí)際生產(chǎn)中常與有機(jī)溶劑沉淀法、鹽析法聯(lián)合使用。2024/11/513第五節(jié)分離純化四、膜分離法膜分離技術(shù)包括超濾、反滲透析、電滲析、微孔過(guò)濾、氣體滲析和超精密過(guò)濾等，其中超濾、反滲透析、微孔過(guò)濾和超精密過(guò)濾在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用較為常見。1．超濾在液壓（氮?dú)饣蛘婵眨?qū)動(dòng)下，分離粒子的范圍，一般為0．001一0．01μm（溶劑和小分子透過(guò)），適用于酶和蛋白質(zhì)類生化藥物的分離、濃縮、脫鹽、提純、除菌、除病毒和熱原等。2024/11/514第五節(jié)分離純化四、膜分離法

1．超濾2024/11/515第五節(jié)分離純化四、膜分離法

1．超濾參數(shù)：膜（纖維素硝酸酯或醋酸酯、芳香酰胺纖維等）；水的流速；相對(duì)分子質(zhì)量的截止值(截留分子量)。超濾設(shè)備：管式、多層板式、卷式和中空纖維型等。國(guó)外發(fā)展較快的是一種內(nèi)壓式中空纖維型。2024/11/516第五節(jié)分離純化四、膜分離法

2.反滲透溶劑從溶液濃度高的一側(cè)傳遞到濃度低的一側(cè)，稱反滲透。分離介質(zhì)：高分子透過(guò)性薄膜；設(shè)備：與超濾相仿應(yīng)用：美國(guó)Millipore設(shè)計(jì)的反滲透裝置，已有100多套，生產(chǎn)符合美國(guó)藥典的純水或注射用水，還用于氨基酸、激素的濃縮等2024/11/517第五節(jié)分離純化四、膜分離法

3．微孔濾膜由高分子材料制成的薄膜過(guò)濾介質(zhì)，可以過(guò)濾一般介質(zhì)不能截留的細(xì)菌和微粒。膜的微孔徑在0．2一l0μm之間。過(guò)濾器有板式和管式兩種。廣泛應(yīng)用于濾除微粒和微生物，如濾除大輸液和水針劑中的污染微粒；還有熱敏性藥物的除菌，如胰島素、C0A、ATP、血清蛋白、丙種球蛋白、激素等。2024/11/518第五節(jié)分離純化四、膜分離法

4．超精密過(guò)濾以聚乙烯醇為主體的中空多孔濾膜，分級(jí)性能在超濾膜與微孔濾膜之間，為0．01—0．2μm。用于水的精制(脫除鐵質(zhì)、菌和微粒)、循環(huán)水的凈化、除懸浮固體離子以及糖液、酶液的精制等。2024/11/519第五節(jié)分離純化五、離子交換法（離子交換層析）

1、基本原理

離子交換樹脂：載體、功能團(tuán)、平衡離子載體：樹脂（苯乙烯型、丙烯酸型、酚醛型）、纖維素、葡聚糖凝膠。功能團(tuán)：磺酸根、磷酸根、羧基；季胺鹽、伯仲叔胺基；CM、DEAE等。平衡離子：氫離子、鈉離子、氫氧根離子、2024/11/520第五節(jié)分離純化五、離子交換法（離子交換層析）

2、樹脂種類第一類強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂；第二類弱酸性陽(yáng)離子交換樹脂；第三類強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂；第四類弱堿性陰離子交換樹脂；

2024/11/521第五節(jié)分離純化五、離子交換法（離子交換層析）

3、影響交換速度的因素2024/11/522第五節(jié)分離純化五、離子交換法（離子交換層析）

3、影響交換速度的因素樹脂顆粒大小、攪拌和流速、離子濃度、離子的水合半徑、酸堿性的強(qiáng)弱和溶液pH值、交聯(lián)度的大小、有機(jī)溶劑、交換容量。2024/11/523第五節(jié)分離純化五、離子交換法（離子交換層析）

4、離子交換操作方法（1）樹脂的選擇當(dāng)目的物具有較強(qiáng)的堿性和酸性時(shí)，宜選用弱酸性和弱堿性的樹脂；氨基酸多用強(qiáng)酸樹脂；蛋白質(zhì)、酶和其它生物大分子的分離多采用弱堿或弱酸性樹脂，以減少生物大分子的變性，有利于洗脫，并提高選擇性。另外因素：孔徑、化學(xué)穩(wěn)定性、機(jī)械性能等2024/11/524第五節(jié)分離純化五、離子交換法（離子交換層析）

4、離子交換操作方法（2）樹脂的處理和再生（3）基本操作方法操作方式：靜態(tài)和動(dòng)態(tài)洗脫方式：靜態(tài)和動(dòng)態(tài)；洗脫液分酸、堿、鹽、溶劑等。2024/11/525第五節(jié)分離純化六、凝膠層析定義：指混合物隨流動(dòng)相流經(jīng)裝有凝膠作為固定相的層析柱時(shí)，因其各種物質(zhì)分子大小不同而被分離的技術(shù)。又稱凝膠過(guò)濾、凝膠滲透過(guò)濾、分子篩過(guò)濾等。也稱阻滯擴(kuò)散層析、排阻層析等。特點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，分離效果好，回收率高，分離條件緩和，不致引起生物活性物質(zhì)變性和失活，凝膠可重復(fù)使用．無(wú)需繁復(fù)的再生處理。缺點(diǎn)是分離速度較慢。廣泛應(yīng)用于分離氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶及多糖等生化物質(zhì)。2024/11/526第五節(jié)分離純化六、凝膠層析

1．基本原理2024/11/527第五節(jié)分離純化六、凝膠層析

2．幾種常用凝膠葡聚糖凝膠（SephadexG）是一種非離子型的無(wú)定形或稱珠狀顆粒物質(zhì)，化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，不溶于水、弱酸、堿和鹽溶液。含有少量的羧基，故對(duì)陽(yáng)離子有輕微的吸附作用。聚丙烯酰胺凝膠（生物凝膠—P）在pH2一11范圍內(nèi)使用。它由碳—碳骨架構(gòu)成，完全是惰性的，適宜作為凝膠層析的載體。缺點(diǎn)是不耐酸，遇酸時(shí)酰胺鍵會(huì)水解成羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團(tuán)。2024/11/528第五節(jié)分離純化六、凝膠層析

2．幾種常用凝膠瓊脂糖凝膠（瑞典sepharose．美國(guó)稱Bio—Gel—A，英國(guó)稱Sagavac等。）是一種天然凝膠，不是共價(jià)交聯(lián)，是以氫鍵交聯(lián)的。不同孔隙程度是以改變瓊脂搪濃度而達(dá)到的?；瘜W(xué)穩(wěn)定性不如葡聚糖凝膠。疏水性凝膠常用的為聚甲基丙烯酸酯(Polmethacrylate)凝膠或以二乙烯苯為交聯(lián)劑的聚苯乙烯凝膠(如Styroge1及Bio—Beads—S)。。2024/11/529第五節(jié)分離純化六、凝膠層析

2．幾種常用凝膠2024/11/530第五節(jié)分離純化六、凝膠層析

3.影響凝膠層析的因素

(1)凝膠的選擇（考慮凝膠特性以及分離目的和樣品的性質(zhì)）；

(2)洗脫液流速（約在30—200m1/h）；

(3)離子強(qiáng)度和pH值；

(4)分離液體積通常為凝膠床總體積的5％-10％；

(5)柱的長(zhǎng)度和直徑（長(zhǎng)徑之比通常為10：1或7：1）；（6）V0和Vi

（裝填良好的柱，V0和Vi的值的比率應(yīng)為40%-60%）。2024/11/531第五節(jié)分離純化六、凝膠層析

4、凝膠層析的應(yīng)用（1）脫鹽；（2）分子量測(cè)定；（3）去熱原和分離純化；2024/11/532第五節(jié)分離純化七、親合層析

1．基本原理定義：利用生物大分子的特異親和力而設(shè)計(jì)的層折技術(shù)。特點(diǎn)：從粗提液中，通過(guò)一次簡(jiǎn)便處理．便可獲得高純度的活性物質(zhì)，既可分離一些生物材料中含量極微的物質(zhì)，又能分離一些性質(zhì)十分相似的物質(zhì)。具有設(shè)備要求不高，操作簡(jiǎn)便，適用范圍廣，特異性強(qiáng)，分離速度快，效果好，條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。但親合吸附劑的通用性較差，洗脫條件較苛刻。2024/11/533第五節(jié)分離純化七、親合層析1．基本原理配基：可逆結(jié)合的特異性物質(zhì)。載體：與配基結(jié)合的層析介質(zhì)。配體：2024/11/534第五節(jié)分離純化七、親合層析

2．幾種常用載體（1）瓊脂糖凝膠

Sepharose2B、4B和6B(Pharmacia)和U1trogelsA一2，A—4，A一6(LKB)。這類載體能使吸附物質(zhì)保持活性，能迅速活化并接上各種功能基團(tuán)，結(jié)構(gòu)疏松孔徑大，流速快，非專一性吸附少;SepharoseCL是用2，3—二溴丙烷處理的交聯(lián)瓊脂糖，它的穩(wěn)定性明顯增加，能在pH3一14中應(yīng)用，擴(kuò)大了親和柱制備時(shí)化學(xué)反應(yīng)選用的范圍，并能經(jīng)受比較劇烈的洗脫條件。

2024/11/535第五節(jié)分離純化七、親合層析

2．幾種常用載體其他的還有葡聚糖凝膠、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、多孔玻璃珠等。

3.配基

特殊配基：底物、抑制劑、輔因子（酶）；抗原、病毒、細(xì)胞（抗體）；互補(bǔ)的堿基順序、組蛋白、核酸聚合酶（核酸）。

通用配基：蛋白質(zhì)A-SepharoseCL-4B（IgG及其系列）、ConA-Sepharose(α-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃甘露醇)等。2024/11/536第五節(jié)分離純化七、親合層析

4．影響吸附劑親和力的幾個(gè)因素

(1)配基濃度（配體濃度）；

(2)空間障礙（特別是親合力低或分子量大而配基為小分子）；

(3)配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)；

(4)載體孔徑；

(5)微環(huán)境；

5．洗脫條件2024/11/537第六節(jié)濃縮

濃縮手段：蒸發(fā)、沉淀蒸發(fā)濃縮裝置：薄膜蒸發(fā)濃縮、減壓蒸發(fā)濃縮、吸收濃縮（最常用的吸收劑有聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、凝膠等）等。2024/11/538第六節(jié)濃縮2024/11/539第七節(jié)結(jié)晶

結(jié)晶一般生化藥物