DB11∕T 2023-2022 魚(yú)類(lèi)貝類(lèi)環(huán)境DNA識(shí)別技術(shù)規(guī)范

DB11北京市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》魚(yú)類(lèi)貝類(lèi)環(huán)境DNA識(shí)別技術(shù)規(guī)范GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)從生物生活環(huán)境中直接提取到的不同物種DNA的總和，包含動(dòng)植物脫落的細(xì)胞或游離的DNA，可一種用于擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，包括變性、退火、延般把堿基序列相似度不小于97%的OTU定義為為高通量測(cè)序時(shí)區(qū)分不同樣點(diǎn)來(lái)源的物種基因序列，在擴(kuò)增引物5’端增加的序列特異性短片段標(biāo)除非另有說(shuō)明，試劑均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭?，試?yàn)用水均使用——消毒液：次氯酸鈉和蒸餾水配制，有效氯濃度）；——75%乙醇：無(wú)水乙醇和超純水3:1配制，其中消毒用75%乙醇）；）；——蛋白酶K：酶活力單位為20；——乙酸銨（CH3COONH4——乙酸鈉（CH3COONa·3H2O）；——脫氧核糖核苷三磷酸：脫氧腺苷三磷酸、脫氧鳥(niǎo)嘌呤三磷酸、脫氧胸苷三磷酸、脫氧胞苷三磷酸的等摩爾數(shù)混合物（各2.5×10-3m），——低溫離心機(jī)：最高離心轉(zhuǎn)速不低于13000rpm，溫控范圍低至4℃;d)河流型水體：參照SL219中水質(zhì)監(jiān)測(cè)斷面6.2.2離岸樣點(diǎn)：魚(yú)類(lèi)eDNA樣品在水深<10m處水面下0.5m采集，水深≥10m處分水面下0.5m7.1.3剪刀和鑷子用自來(lái)水和75%乙醇清洗，超純水浸洗，烘干備用。7.2.1連接真空泵和抽濾器，用鑷子取0.45μm孔徑的混合纖維素酯濾膜置于玻璃濾膜臺(tái)中央，蓋上浴裂解3h，期間每隔0.5h進(jìn)行間斷性震蕩；c)將裂解液轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)編號(hào)的新離心管中，加入等體積Tris飽e)轉(zhuǎn)移上清液到對(duì)應(yīng)編號(hào)的新離心管中，j)使用超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總DNA濃度和質(zhì)量，利用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA完也可采用符合5.1中要求的動(dòng)物組織細(xì)胞DNA提取試劑盒完成，具體操作也可采用符合5.1中要求的柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒完成，具體操作下游引物R：CATAGTGGGGTATC上游引物F：GGWACWGGWTGAACWGTW可參考附錄A中列出的8堿基條形碼參考序列進(jìn)行添加，也可根據(jù)情況自行設(shè)計(jì)添加。不影響擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系包括PCR聚合酶、聚合酶緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、上下游引物、經(jīng)8.1和8.2提對(duì)PCR擴(kuò)增樣品進(jìn)行第二代高通量測(cè)序，利用分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，去除測(cè)b)去除讀長(zhǎng)上的引物序列，去除錯(cuò)配擴(kuò)增序列，此步驟處理后一般僅留存35~45%的序列；d)去除測(cè)序深度較低的序列，即測(cè)序所得堿基總量小于10×的序列；e)去除由于測(cè)序讀長(zhǎng)限制導(dǎo)致的末端序列不穩(wěn)定的部f)將前后兩端的讀長(zhǎng)拼接成一條完整的序列，最低重疊堿基數(shù)一般設(shè)置為20bp；g)將拼接的序列進(jìn)行去重復(fù)處理并排序，即刪除相同的序列，每個(gè)序列僅保留一條；i)將篩選和處理后的結(jié)果輸出fasta格式的序列文件保存。a)經(jīng)篩選與處理的測(cè)序數(shù)據(jù)需使用相關(guān)生物信息學(xué)分析軟件基于97%序列相似度進(jìn)行聚類(lèi)，獲相似度和覆蓋度均大于85%的OTUs；d)提取物種的分類(lèi)信息，包括界、門(mén)、綱、目、科、屬、種等界門(mén)綱目科屬種1...b)樣品采集完成后置于4℃保存、運(yùn)輸并確保在24h內(nèi)完成抽濾，濾膜在a)抽濾所用器具規(guī)范滅菌和清洗，避c)DNA提取和純化所用器具按規(guī)范滅菌，耗材一次性使用，避免交叉污染。d)確保純化后的PCR產(chǎn)物純度合格，按規(guī)定保存避免降解。123456789[1]HJ710.8-2014生物多樣性觀測(cè)技[3]DB43/T432-2[4]黃祥飛，陳偉民，蔡啟銘.《湖[5]孟偉，