免疫原和抗血清的制備（免疫學(xué)檢驗(yàn)課件）

免疫原的制備

抗原和抗體是免疫學(xué)檢測(cè)中的兩大基本因素，抗原的純化是制備特異性抗體的先決條件，制得的抗體又可用于抗原的純化和檢測(cè)。

前言免疫原的制備

免疫原（immunogen）就是抗原，是指能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體并能與之發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。眾多的抗原物質(zhì)中絕少是單一組分的，所以必須從復(fù)雜的物質(zhì)中提取出目的抗原成分，制成合格的免疫原。

一、細(xì)胞性免疫原的制備1.綿羊紅細(xì)胞抗原制備采集新鮮綿羊紅細(xì)胞注入無(wú)菌并帶有玻璃珠的三角燒瓶?jī)?nèi)，充分搖動(dòng)15分鐘后除去纖維蛋白，再以無(wú)菌生理鹽水洗滌3次，最后配成1×106/ml濃度的細(xì)胞懸液，即可應(yīng)用。

2.細(xì)菌抗原的制備細(xì)菌抗原有菌體抗原和鞭毛抗原等，多選用典型菌株的液體或固體培養(yǎng)物經(jīng)集菌后處理。鞭毛抗原需用有動(dòng)力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛處理，而菌體抗原則需要在100℃加溫2～2.5小時(shí)后應(yīng)用。

蛋白質(zhì)、酶、核酸、細(xì)菌毒素等皆為可溶性抗原，這些物質(zhì)大多來(lái)源于人和動(dòng)物的組織和細(xì)胞，要想獲得此類抗原，通常要先破碎組織和細(xì)胞，再進(jìn)一步提取和純化。

二、可溶性抗原的制備及鑒定制備流程選材預(yù)處理細(xì)胞粉碎提取純化

鑒定冷藏保存

可溶性抗原包括蛋白質(zhì)、脂多糖、核酸等，多來(lái)源于人和動(dòng)物的組織或細(xì)胞，需先將組織或細(xì)胞破碎，再提取和純化，才能獲得所需的可溶性抗原。制備組織勻漿粉碎細(xì)胞蛋白質(zhì)脂多糖核酸提取1.組織勻漿的制備

高速搗碎法或研磨法2.細(xì)胞破碎的方法

（1）反復(fù)凍融法（2）超聲波破碎法（3）溶菌酶處理法（4）表面活性劑處理法

3.可溶性抗原的提純

方法：

超速離心法，選擇性沉淀法，凝膠過(guò)濾，離子交換層析，親和層析，電泳法4.純化抗原的鑒定、濃縮與保存鑒定內(nèi)容：分子量、含量、純度和免疫活性。濃縮：吸收法、蒸發(fā)法與超濾法。保存：液態(tài)或干燥狀態(tài)低溫保存。

用化學(xué)合成法或基因重組法制備的抗原，稱之為人工抗原，包括人工結(jié)合抗原、人工合成抗原和基因重組抗原。三、人工免疫原制備

半抗原不能直接做為免疫原，只有把這些半抗原和大分子物質(zhì)結(jié)合后，才具有免疫原性。這種經(jīng)過(guò)人工修飾的半抗原稱之為人工結(jié)合抗原，用于偶聯(lián)半抗原的大分子物質(zhì)稱為載體。

（一）人工結(jié)合抗原制備

半抗原是僅有抗原性而無(wú)免疫原性的物質(zhì)。多肽、甾體激素、核苷、某些藥物等小分子物質(zhì)均為半抗原。載體蛋白半抗原表位半抗原+載體（蛋白、合成載體）=完全抗原物理法或化學(xué)法（碳二亞胺法、戊二醛法）連接⑴蛋白質(zhì)類

⑵多肽聚合物

⑶大分子聚合物人工結(jié)合免疫原的鑒定要鑒定人工結(jié)合免疫原的質(zhì)量，必須要測(cè)定偶聯(lián)在載體上的半抗原量，一般要連接20個(gè)以上才具有免疫原性。常用的測(cè)定方法有吸收光譜分析法和核素標(biāo)記半抗原滲入法。

用化學(xué)方法將活化氨基酸聚合，使之成為合成多肽，即人工合成抗原。

（二）人工合成抗原

將編碼免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并與適當(dāng)載體DNA分子相結(jié)合，然后引入受體細(xì)胞中（如大腸桿菌或酵母菌）使之表達(dá)，能獲得免疫原性之融合蛋白，經(jīng)純化后可作為抗原，即基因工程抗原。

（三）基因工程抗原四、免疫佐劑

免疫佐劑（immunoadjuvant）是先于抗原或與抗原一起注入機(jī)體，可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)該抗原的特異性免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。免疫佐劑簡(jiǎn)稱佐劑（adjuvant），為一類非特異性的免疫增強(qiáng)劑。免疫佐劑可以是無(wú)免疫原性也可以是有免疫原性的。

在進(jìn)行動(dòng)物免疫時(shí)最常用的佐劑是福氏（Freund）佐劑，根據(jù)有無(wú)卡介苗又可分為福氏不完全佐劑和福氏完全佐劑。福氏不完全佐劑是由油劑和乳化劑制成，在福氏不完全佐劑中加入卡介苗就成了福氏完全佐劑。

（一）佐劑的種類

福氏佐劑和抗原的比例為1:1。由于福氏佐劑是油劑，加入抗原后要充分混合成乳劑。

混合方法：研磨法攪拌注射器混合法注射器混合法1.改變抗原的物理性狀，延長(zhǎng)抗原在體內(nèi)的存留時(shí)間，從而有效地刺激免疫系統(tǒng)；2.刺激單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，增強(qiáng)其抗原提呈能力；3.可加強(qiáng)淋巴細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)其對(duì)抗原的處理能力。

（二）佐劑的作用機(jī)制

免疫血清的制備

抗原和抗體是免疫學(xué)檢測(cè)中的兩大基本因素，抗原的純化是制備特異性抗體的先決條件，制得的抗體又可用于抗原的純化和檢測(cè)。

前言

抗血清的制備

抗血清（亦稱免疫血清）用抗原以不同途徑免疫動(dòng)物，從動(dòng)物血清中獲取抗體，該類含有抗體的血清稱為抗血清。由于免疫動(dòng)物的抗原往往具有多種抗原表位，可激活體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生針對(duì)抗原多種表位的混合抗體，因而抗血清也稱為多克隆抗體（polyclonalantibody，PcAb）。多價(jià)抗原多個(gè)B細(xì)胞克?。ㄖ旅舻腂細(xì)胞）多克隆抗體抗血清的制備流程免疫動(dòng)物選擇免疫方案制定動(dòng)物采血抗血清分離純化及鑒定

抗血清的保存

一、免疫動(dòng)物選擇

1.動(dòng)物種系抗原與免疫動(dòng)物種屬差異越大，免疫效果越好。2.個(gè)體個(gè)體必須適齡、健壯、無(wú)感染性疾病，體重符合要求。

3.抗原的性質(zhì)

蛋白質(zhì)類抗原對(duì)多數(shù)動(dòng)物皆適合，常選用家兔和山羊。

4.抗血清的要求

R（rabbit）型及H（horse）型，R型等價(jià)帶較寬，適用于診斷試劑；H型等價(jià)帶較窄，一般用作免疫治療。動(dòng)物種類的選擇時(shí)應(yīng)考慮以下因素

二、方案制定

1.免疫原的劑量

一定范圍內(nèi)，免疫原的用量越大，免疫反應(yīng)越強(qiáng)，產(chǎn)生的抗體效價(jià)越高。

2.免疫途徑皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、脾臟、淋巴結(jié)。初次常用皮內(nèi)，再次常用靜脈。

3.免疫時(shí)間間隔一般間隔10～20d為佳。兩次，以后的每次間隔一般為7～10d。次序日序（天）注射途徑注射劑量（ml）抗原11多點(diǎn)皮內(nèi)1.0沙門菌O抗原26靜脈0.5沙門菌O抗原311靜脈0.5沙門菌O抗原416靜脈1.0沙門菌O抗原519靜脈2.0沙門菌O抗原傷寒沙門菌O抗原免疫家兔的方案三、動(dòng)物采血法

動(dòng)物免疫3～5次后，可取少量血清檢測(cè)抗體效價(jià)與特異性，測(cè)試合格后，應(yīng)在末次免疫后5～7d及時(shí)采血分離血清。1．頸動(dòng)脈放血法最常用的方法，家兔、綿羊、山羊等可采用。2．心臟采血法此法多用于豚鼠、大鼠等小動(dòng)物，技術(shù)要求高。3．靜脈采血法可多次進(jìn)行，所以可收集到的血液量較多。家兔用耳中央靜脈；綿羊和山羊用頸靜脈。四、抗血清的分離純化及鑒定采集的血液多采用在室溫自然凝固，37℃或4℃待凝塊收縮后分離血清。前者迅速，但獲得血清較少；后者時(shí)間長(zhǎng)，但獲得血清多，而且效價(jià)穩(wěn)定。（一）抗血清的分離1.特異性抗體的純化（單價(jià)特異性是指抗血清只與其特異性抗原發(fā)生反應(yīng)。）

①親和層析法

②吸附劑方法2.IgG類抗體的純化

①鹽析

②凝膠過(guò)濾

③離子交換和親和層析法（二）抗血清的純化（三）抗血清的鑒定1.抗體效價(jià)的鑒定

一般原則是顆粒性抗原用凝集試驗(yàn)，可溶性抗原用雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。

2.抗體特異性的鑒定

常用雙向免疫擴(kuò)散法進(jìn)行鑒定。

3.抗體純度的鑒定

可采用免疫電泳、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)、SDS等方法鑒定。4.抗體親和力的鑒定

常用ELISA、RIA和平衡透析法等進(jìn)行測(cè)定。

五、抗血清的保存1.4℃保存：保存3～6個(gè)月2.-20℃～-40℃保存：保存3～5年3.冷凍真空干燥保存

：長(zhǎng)期保存多價(jià)抗原多個(gè)B細(xì)胞克?。ㄖ旅舻腂細(xì)胞）多克隆抗體

多克隆抗體

單克隆抗體

單克隆抗體(mo