大學(xué)考研筆記教案基因工程電子教案

教案課程：基因工程學(xué)時(shí)：30學(xué)時(shí)班級(jí)：植保、農(nóng)學(xué)、園藝教師：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)《基因工程》電子教案一、教學(xué)進(jìn)度計(jì)劃教學(xué)進(jìn)度表周次學(xué)時(shí)教學(xué)內(nèi)容備注12緒論22DNA的組成、結(jié)構(gòu)32天然DNA的制備、限制性核酸內(nèi)切酶及DNA的片段化42特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增52DNA片段的化學(xué)合成及凝膠電泳檢測(cè)62分子克隆的載體及質(zhì)?？寺〉妮d體72病毒（噬菌體）克隆載體及染色體定位整合克隆載體82人工染色體克隆載體及特殊用途克隆載體92目的基因、目的基因的制備及目的基因的分離102受體細(xì)胞及重組DNA分子轉(zhuǎn)入原核生物112重組子的篩選122基因表達(dá)的機(jī)制132基因表達(dá)的調(diào)控元件及外源基因表達(dá)系統(tǒng)（前部分）142外源基因表達(dá)系統(tǒng)（后部分）及基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)與分離純化152基因工程應(yīng)用二、授課內(nèi)容及學(xué)時(shí)分配授課內(nèi)容及學(xué)時(shí)分配章節(jié)各章名稱理論課周次理論課時(shí)數(shù)實(shí)驗(yàn)課時(shí)數(shù)總課時(shí)數(shù)1緒論212DNA重組883基因工程克隆的載體664目的基因的制備235目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞446外源基因的表達(dá)667基因工程的應(yīng)用22合計(jì)3030三、單元教學(xué)計(jì)劃名稱第一章緒論目的要求使學(xué)生清晰基因工程的基本概念，知道基因工程的研究范圍和內(nèi)容，了解基因工程的誕生與發(fā)展?fàn)顩r。重點(diǎn)難點(diǎn)基因工程的含義、理論依據(jù)、研究的基本技術(shù)路線以及基因工程研究的內(nèi)容。時(shí)間教學(xué)組織教學(xué)方法2學(xué)時(shí)一、引言1.基因工程含義1）廣義含義2）狹義含義2.基因工程理論依據(jù)1）DNA分子的切割與連接2）核酸分子雜交3）凝膠電泳4）細(xì)胞轉(zhuǎn)化5）DNA序列結(jié)構(gòu)分析以及基因人工合成、基因定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增技術(shù)3.基因工程研究的基本技術(shù)路線1)從大大原核生物細(xì)胞中提取克隆的載體；2）從真核生物細(xì)胞中提取外源DNA；3）用限制性內(nèi)切酶將載體打開，并用限制性內(nèi)切酶消化真核生物DNA；4）用DNA連接酶將真核生物DNA片斷接到載體上，獲得重組體；5）用原核或真核生物細(xì)胞作為受體，使重組體進(jìn)入并得至擴(kuò)增，通過(guò)特定手段，能找到含有理想重組體的受體細(xì)胞。4.基因工程研究發(fā)展史1）50年代以前2）50年代以后3）最近20年二、基因工程研究?jī)?nèi)容1.從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過(guò)酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟發(fā)，分離出帶有目的基因的DNA片斷。2.在體外將帶有目的基因的外源DNA片斷連接到能自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，并與之一起增殖4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。5.從這些篩選出來(lái)的受體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用。6.將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。三、基因工程研究發(fā)展前景理論講授；舉例并借助課件進(jìn)行輔助教學(xué)。名稱第二章DNA重組目的要求使學(xué)生了解DNA的組成、結(jié)構(gòu)和DNA的重組類型；理解DNA的濃縮及純化，限制性核酸內(nèi)切酶的特異性及作用機(jī)制，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的原理及其應(yīng)用；掌握大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取以及λ噬菌體DNA的提取，瓊脂糖凝膠電泳的原理及方法，限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)系統(tǒng)；E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶的連接機(jī)理。重點(diǎn)難點(diǎn)天然DNA的提取，限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶的作用機(jī)理及方法，PCR擴(kuò)增DNA片段的基本原理和方法，瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)的原理和方法。DNA的純化與濃縮，DNA片段的化學(xué)合成，DNA片段的連接。時(shí)間教學(xué)組織教學(xué)方法8學(xué)時(shí)第一節(jié)DNA的組成和結(jié)構(gòu)一、DNA的組成.1．組成元素2．基本單位3．化學(xué)結(jié)構(gòu)二、DNA的空間結(jié)構(gòu)規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)1．空間結(jié)構(gòu)A－DNA的結(jié)構(gòu)B－DNA的結(jié)構(gòu)2．堿基互補(bǔ)配對(duì)原則3．DNA分子的特點(diǎn)三、DNA復(fù)制起始位點(diǎn)和復(fù)制子的結(jié)構(gòu)1．復(fù)制的基本機(jī)理2．復(fù)制起始位點(diǎn)3．復(fù)制子及復(fù)制子的結(jié)構(gòu)4．復(fù)制的特點(diǎn)四、DNA的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的定義啟動(dòng)子啟動(dòng)子的基本結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄所需酶的種類2．轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄區(qū)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄的過(guò)程第二節(jié)天然DNA的制備一、天然DNA的來(lái)源和用途.1．天然DNA的來(lái)源2．天然DNA的用途二、天然DNA的提取天然DNA的提取方法與原理三、DNA的純化四、DNA的濃縮DNA濃度的測(cè)定方法第三節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶和DNA片段化一、限制性核酸內(nèi)切酶定義功能二、限制性核酸內(nèi)切酶的類型及作用機(jī)制限制性核酸內(nèi)切酶的類型2．限制性核酸內(nèi)切酶的作用機(jī)制三、限制性核酸內(nèi)切酶命名規(guī)則及識(shí)別序列限制性核酸內(nèi)切酶的命名規(guī)則2．限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列四、限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA的位點(diǎn)五、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)系統(tǒng)第四節(jié)特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增一、PCR基本原理PCR擴(kuò)增的定義PCR擴(kuò)增的基本原理二、PCR擴(kuò)增特異性DNA片段的主要條件1．模板核酸2．引物3．緩沖液4．Mg2+5．三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）6．耐熱DNA聚合酶7．溫度循環(huán)參數(shù)1）變性溫度與時(shí)間2）復(fù)性溫度與時(shí)間3）延伸溫度與時(shí)間4）循環(huán)數(shù)三、PCR擴(kuò)增DNA片段的方法1．試劑1）引物2）耐熱的DNA聚合酶3）10×PCR緩沖液4）5mmol/LdNTP貯備液5）DNA模板2．基本反應(yīng)步驟PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成1）模板DNA的變性2）模板DNA與引物的退火(復(fù)性)3）引物的延伸四、常用的DNA片段PCR擴(kuò)增系統(tǒng)1．兼并引物（DegeneratePrimer）PCR2．套式引物（NestedPrimer）PCR3．復(fù)合PCR（MultiplexPCR）4．反向PCR（InversePCR或ReversePCR）5．不對(duì)稱PCR（AsymmetricPCR）6．標(biāo)記PCR（LP-PCR）和彩色PCR7．加端PCR8．錨定PCR或固定PCRDNA片段的化學(xué)合成一、苷酸片段的化學(xué)合成方法1．原位合成2．直接點(diǎn)樣二、化學(xué)方法合成的DNA片段1．歷史2．基本原理3．基本原料4．合成步驟DNA片段大小的凝膠電泳檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)室中常用的電泳參數(shù)1.瓊脂糖凝膠電泳參數(shù)2.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳參數(shù)3.脈沖場(chǎng)凝膠電泳參數(shù)二、DNA片段的連接及重組類型1．DNA重組的概念及作用2．DNA片段的連接重組3．DNA連接酶4．DNA片段之間的連接5．DNA重組類型以理論講授為主；配合課件進(jìn)行講授為輔；名稱第三章基因克隆的載體目的要求使學(xué)生了解與構(gòu)建克隆載體相關(guān)的質(zhì)粒和λ噬菌體的性質(zhì)；啟動(dòng)子探針型克隆載體和誘導(dǎo)型表達(dá)克隆載體等特殊用途的克隆載體。掌握大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體pBR322的構(gòu)建。熟練掌握構(gòu)建λ噬菌體克隆載體的基本策略，并了解其應(yīng)用。重點(diǎn)難點(diǎn)大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體pBR322的構(gòu)建。構(gòu)建λ噬菌體克隆載體的基本策略及其應(yīng)用。時(shí)間教學(xué)組織教學(xué)方法6學(xué)時(shí)引言一、分子克隆的載體1．載體的定義2．作為載體應(yīng)該具備的基本條件第一節(jié)質(zhì)?？寺≥d體一、質(zhì)粒定義與構(gòu)型1．定義2．構(gòu)型二、質(zhì)?？寺≥d體的特性具有獨(dú)立復(fù)制起點(diǎn)2．具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量3．具有較高拷貝數(shù)4．具有選擇性標(biāo)記5．易于導(dǎo)入細(xì)胞6．具有安全性三、構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體時(shí)預(yù)處理的主要問(wèn)題、基本策略和具體實(shí)例1．構(gòu)建一種質(zhì)粒載體時(shí)預(yù)處理的主要問(wèn)題2．質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建的基本策略3．以常用的pBR322為例說(shuō)明載體構(gòu)建的步驟1）pBR322的定義2)pBR322質(zhì)粒載體的特點(diǎn)3）pBR322質(zhì)粒載體構(gòu)建的步驟4）pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)第二節(jié)病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體1．關(guān)于λ噬菌體的簡(jiǎn)介2．λ噬菌體的構(gòu)建二、cosmid克隆載體1．cosmid克隆載體的特征2．cosmid克隆載體的構(gòu)建三、M13噬菌體克隆載體1．M13DNA2．M13DNA的復(fù)制和M13噬菌體的增殖3．構(gòu)建M13噬茵體克隆載體的策略和途徑4．M13克隆載體的應(yīng)用四、SV40克隆載體1．SV40－DNA的復(fù)制和SV40的增殖2．構(gòu)建SV40克隆載體的基本策略和途徑1）取代型克隆載體2）病毒－質(zhì)粒重組克隆載體。五、反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體1．定義2．勞斯肉瘤病毒的生物學(xué)特性3．構(gòu)建RSV反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體的策略和途徑第三節(jié)染色體定位整合克隆載體一、定位整合克隆載體的幾種模式1．內(nèi)源平臺(tái)雙交換置換克隆載體2．外源平臺(tái)雙交換置換克隆載體3．內(nèi)源平臺(tái)雙交換插入克隆載體4．內(nèi)源平臺(tái)單交換插入克隆載體二、定位整合克隆載體1．植物染色體定位整合克隆載體2．動(dòng)物染色體定位整合克隆載休第四節(jié)人工染色體克隆載體一、人工染色體克隆載體的含義和特點(diǎn)含義特點(diǎn)二、人工染色體克隆載體的構(gòu)建三、人工染色體克隆載體的應(yīng)用1．構(gòu)建基因組文庫(kù)2．基因治療3．基因功能的鑒定第五節(jié)特殊用途克隆載體一、啟動(dòng)子探針型克隆載體1．啟動(dòng)子探針型克隆載體的定義2．類型和相應(yīng)內(nèi)含簡(jiǎn)介1）Kanr標(biāo)記的啟動(dòng)子探針克隆載體。2）gfp標(biāo)記的啟動(dòng)子探針克隆載體。3）hPh標(biāo)記的啟動(dòng)于探針克隆載體。4）Kanr標(biāo)記的自動(dòng)子探針克隆載體。二、誘導(dǎo)型表達(dá)克隆載體1．誘導(dǎo)型表達(dá)克隆載體的定義2．類型和相應(yīng)內(nèi)含簡(jiǎn)介1）二價(jià)金屬離子誘導(dǎo)表達(dá)克隆載體。2）干旱誘導(dǎo)表達(dá)克隆載體。3）紅光誘導(dǎo)表達(dá)克降載體。三、反義表達(dá)克隆載體1．反義表達(dá)克隆載體2．類型及相應(yīng)內(nèi)含簡(jiǎn)介1）SOD基因反義表達(dá)更隆載體．2）NHE1基因反義表達(dá)克隆載體。采用引導(dǎo)式的教學(xué)講授法，并輔助多媒體課件名稱第四章目的基因的制備目的要求了解原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的基因組成，理解基因組文庫(kù)、cDNA基因文庫(kù)的概念，掌握cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建及目的基因的分離，并能利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴(kuò)增目的基因。重點(diǎn)難點(diǎn)cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建及目的基因的分離；利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴(kuò)增目的基因，基因組文庫(kù)的構(gòu)建以及篩選目的基因片段的差別雜交及減法雜交技術(shù)。時(shí)間教學(xué)組織教學(xué)方法2學(xué)時(shí)第一節(jié)目的基因及目的基因的制備一、基本概念及組成1．目的基因2．結(jié)構(gòu)基因的組成3．原核生物基因的組成4．真核生物基因的組成5．其它基因的組成二、直接分離法1．限制性核酸內(nèi)切酶酶切分離法2．雙抗體免疫法分離編碼蛋白的基因3．利用酶促反轉(zhuǎn)錄法直接從特定mRNA分離基因三、構(gòu)建基因組文庫(kù)分離法四、cDNA基因文庫(kù)的構(gòu)建及目的基因分離五、利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴(kuò)增目的基因六、基因的化學(xué)合成第二節(jié)目的基因的分離一、目的基因的功能克隆1.根據(jù)特異蛋白分離目的基因2.功能互補(bǔ)法克隆基因二、序列克隆法三、篩選目的基因片段的差別雜交及減法雜交技術(shù)四、利用差示分析法分離目的基因克隆五、功能結(jié)合法篩選目的基因六、DNA插入誘變法分離目的基因采用引導(dǎo)式的教學(xué)講授法，并輔助多媒體課件名稱第五章目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的要求理解受體細(xì)胞、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)化率、體外包裝等相關(guān)概念；掌握感受態(tài)細(xì)胞的制備方法，核酸分子雜交檢測(cè)法來(lái)篩選重組子，重組λ噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌；了解重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞。重點(diǎn)難點(diǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備，重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌，重組λ噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌，核酸分子雜交檢測(cè)法。時(shí)間教學(xué)組織教學(xué)方法4學(xué)時(shí)第一節(jié)受體細(xì)胞一、原核生物細(xì)胞1．原核生物細(xì)胞成為理想受體細(xì)胞類型的原因？2．為什么說(shuō)有為數(shù)不少的真核生物基因不能在大腸桿菌中表達(dá)出具有生物活性的功能蛋白？二、真菌細(xì)胞1．為什么說(shuō)酵母菌是最理想的真菌受體細(xì)胞？三、植物細(xì)胞四、動(dòng)物細(xì)胞第二節(jié)重組DNA分子轉(zhuǎn)入原核生物一、重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化大腸桿菌1．以革蘭氏陽(yáng)性細(xì)茵為例，細(xì)菌轉(zhuǎn)化的一種可能基本步驟，即原生質(zhì)體化假說(shuō)。2.支持該假說(shuō)的理由及證據(jù)二、重組入噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌1．體外包裝2．入噬菌體DNA體外包裝的主要過(guò)程三、受體細(xì)胞的選擇1．受體細(xì)胞的選擇依據(jù)四、重組DNA分子轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞1．重組DNA分子轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法2．重組DNA分子導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞第三節(jié)重組子的篩選一、遺傳表型直接篩選法1．根據(jù)載體選擇標(biāo)記初步篩選轉(zhuǎn)化子1）抗藥性篩選2）插入失活篩選法3）插入表達(dá)篩選法4）顯色互補(bǔ)篩選法5）利用報(bào)告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞6）利用遺傳選擇標(biāo)記篩選哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞2.依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析的篩選法二、核酸分子雜交檢測(cè)法三、免疫化學(xué)檢測(cè)法四、轉(zhuǎn)譯篩選法采用啟發(fā)式與問(wèn)答式相結(jié)合的教學(xué)方法，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)查閱相關(guān)的文獻(xiàn)資料使教學(xué)內(nèi)容不段創(chuàng)新。名稱第六章外源基因的表達(dá)目的要求理解啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、衰減子、絕緣子、反義子等概念；掌握外源基因在大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)形式、酵母表達(dá)系統(tǒng)中酵母基因表達(dá)載體即其種類、免疫學(xué)檢測(cè)法，而在基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化上只掌握柱層析法；對(duì)芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)和鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)等原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)僅作了解。重點(diǎn)難點(diǎn)基因表達(dá)的機(jī)制，外源基因表達(dá)系統(tǒng)，包括原核生物表達(dá)系統(tǒng)和真核生物表達(dá)系統(tǒng)；基因表達(dá)的調(diào)控序列；酵母基因表達(dá)載體，哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體。時(shí)間教學(xué)組織教學(xué)方法6學(xué)時(shí)第一節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制一、外源基因的起始轉(zhuǎn)錄二、mRNA的延伸與穩(wěn)定性三、外源基因mRNA的有效翻譯四、表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性五、目的基因沉默第二節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控元件一、啟動(dòng)子二、增強(qiáng)子三、終止子四、衰減子五、絕緣子六、反義子第三節(jié)外源基因表達(dá)系統(tǒng)一、大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)二、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)三、鏈霉菌表達(dá)系統(tǒng)四、藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)五、酵母表達(dá)系統(tǒng)六、哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)七、植物細(xì)胞基因表達(dá)系統(tǒng)第四節(jié)基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)與分離純化一、基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)二、基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化采用啟發(fā)式與問(wèn)答式相結(jié)合的教學(xué)方法，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)查閱相關(guān)的文獻(xiàn)資料使教學(xué)內(nèi)容不段創(chuàng)新。名稱第七章基因工程應(yīng)用目的要求了解基因工程在制藥工業(yè)上、動(dòng)物、植物等方面的應(yīng)用；了解基因工程疫苗、腫瘤的基因治療。重點(diǎn)難點(diǎn)基因工程疫苗的制備，腫瘤的基因治療時(shí)間教學(xué)組織教學(xué)方法2學(xué)時(shí)一、基因工程藥物1.基因工程激素類藥物2.基因工程細(xì)胞因子類藥物3.基因工程抗體4.基因工程受體5.基因工程疫苗二、轉(zhuǎn)基因植物1.抗病蟲害轉(zhuǎn)基因植物2.抗逆轉(zhuǎn)基因植物3.藥用轉(zhuǎn)基因植物4.轉(zhuǎn)基因植物食品三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物1.利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物改良動(dòng)物品種2.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為生物反應(yīng)器3.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物篩選藥物4.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)用于人體器官移植四、基因治療1.腫瘤的基因治療2.分子遺傳病的基因治療3.心血管病的基因治療4.艾滋病的基因治療五、基因芯片1.基因芯片原理及技術(shù)2.基因芯片的應(yīng)用采用啟發(fā)式與問(wèn)答式相結(jié)合的教學(xué)方法，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)查閱相關(guān)的文獻(xiàn)資料使教學(xué)內(nèi)容不段創(chuàng)新。四、教案內(nèi)容課目第一章緒論目的要求使學(xué)生清晰基因工程的基本概念，知道基因工程的研究范圍和內(nèi)容，了解基因工程的誕生與發(fā)展?fàn)顩r。重點(diǎn)難點(diǎn)基因工程的含義、理論依據(jù)、研究的基本技術(shù)路線以及基因工程研究的內(nèi)容。主要內(nèi)容一、引言1.基因工程含義1）廣義含義：是指包括細(xì)胞工程、染色體工程、細(xì)胞器工程等。2）狹義含義：所謂的基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒和其它載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參入到原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定的繁殖。2.基因工程理論依據(jù)（每一點(diǎn)只講概要）1）DNA分子的切割與連接2）核酸分子雜交3）凝膠電泳4）細(xì)胞轉(zhuǎn)化5）DNA序列結(jié)構(gòu)分析以及基因人工合成、基因定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增技術(shù)3.基因工程研究的基本技術(shù)路線1)從大大原核生物細(xì)胞中提取克隆的載體；2）從真核生物細(xì)胞中提取外源DNA；3）用限制性內(nèi)切酶將載體打開，并用限制性內(nèi)切酶消化真核生物DNA；4）用DNA連接酶將真核生物DNA片斷接到載體上，獲得重組體；5）用原核或真核生物細(xì)胞作為受體，使重組體進(jìn)入并得至擴(kuò)增，通過(guò)特定手段，能找到含有理想重組體的受體細(xì)胞。4.基因工程研究發(fā)展史1）50年代以前主要從細(xì)胞染色體水平上進(jìn)行研究，屬于基因的染色體遺傳學(xué)階段；2）50年代以后則主要從DNA大分子水平上進(jìn)行研究，屬于基因的分子生物學(xué)階段；3）最近20年由于重組DNA技術(shù)的完善和應(yīng)用，人們已經(jīng)改變了從表型到基因型的傳統(tǒng)研究基因的途徑，而能夠直接從克隆目的基因出發(fā)，研究基因的功能及其與表型間的關(guān)系，使基因的研究進(jìn)入了反向生物學(xué)階段。二、基因工程研究?jī)?nèi)容1.從復(fù)雜的生物有機(jī)體基因組中，經(jīng)過(guò)酶切消化或PCR擴(kuò)增等步驟發(fā)，分離出帶有目的基因的DNA片斷。2.在體外將帶有目的基因的外源DNA片斷連接到能自我復(fù)制的并具有選擇記號(hào)的載體分子上，形成重組DNA分子。3.將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞，并與之一起增殖4.從大量的細(xì)胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆。5.從這些篩選出來(lái)的受體細(xì)胞克隆，提取出已經(jīng)得到擴(kuò)增的目的基因，供進(jìn)一步分析研究使用。6.將目的基因克隆到表達(dá)載體上，導(dǎo)入寄主細(xì)胞，使之在新的遺傳背景下實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的物質(zhì)。三、基因工程研究發(fā)展前景1.闡明了基因是遺傳信息的載體，沒(méi)有基因也就沒(méi)有生命。2.關(guān)于基因組核苷酸全序列的測(cè)定與分析，是重組DNA技術(shù)促進(jìn)基礎(chǔ)生物學(xué)研究的又一出色的范例。3.1984年美國(guó)科學(xué)家首先提出了研究人類基因組的設(shè)想。4.我國(guó)自1992年開始執(zhí)行的《水稻基因組作圖和測(cè)序計(jì)劃》也已經(jīng)取得了良好的進(jìn)展。5.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一種潛在的利用是，有可能將它作為專門生產(chǎn)一些特殊藥物的“生物工廠”（bio-factories）。課目第二講DNA的組成、結(jié)構(gòu)目的要求使學(xué)生了解DNA的組成、結(jié)構(gòu)；理解DNA的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，掌握復(fù)制的機(jī)理，復(fù)制子、啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和定義。重點(diǎn)難點(diǎn)復(fù)制的機(jī)理，復(fù)制子、啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和定義。Z-DNA結(jié)構(gòu)的生物學(xué)意義。主要內(nèi)容第一節(jié)DNA的組成和結(jié)構(gòu)一、DNA的組成.1．組成元素：C、H、O、N、P2．基本單位：脫氧核苷酸（4種）3．化學(xué)結(jié)構(gòu)：脫氧核苷酸鏈二、DNA的空間結(jié)構(gòu)（一）、空間結(jié)構(gòu)1）規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)a.兩條反式平行的多核苷酸鏈圍繞同一中心軸相互纏繞b.嘌呤和嘧啶堿位于比螺旋的內(nèi)側(cè)。c.雙螺旋的平均直徑為2nm，兩個(gè)相鄰的堿基對(duì)之間相距的高度，即堿基堆積距離為0.34nm,兩個(gè)核苷酸這間的夾角為36〇。d.兩條核苷酸鏈依靠彼此堿基之間形成的氫鍵相連系而結(jié)合在一起。2）A－DNA的結(jié)構(gòu)A-DNA也是由反向的兩條多核苷酸鏈組成的雙螺旋，也為右手螺旋，但是螺體較寬而短，堿基對(duì)與中軸這傾角也不同，呈19〇。3）Z－DNA的結(jié)構(gòu)a.定義：在CGCGCG晶體中，磷酸基在多核苷酸骨架上的分布呈Z字形，所以呈它為Z－DNA。Z－DNA只有一條大溝，而無(wú)小溝。b.生物學(xué)意義：應(yīng)當(dāng)指出Z－DNA的形成通常在熱力學(xué)上是不利的。因?yàn)閆－DNA中帶負(fù)電荷的磷酸根距離太近了，這會(huì)產(chǎn)生靜電排斥。但是，DNA鏈的局部不穩(wěn)定區(qū)的存在就成為潛在的解鏈位點(diǎn)。DNA解螺旋卻是DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄等過(guò)程中必要的環(huán)節(jié)，因此認(rèn)為這一結(jié)構(gòu)與基因調(diào)節(jié)有關(guān)。比如SV40增強(qiáng)子區(qū)中就有此結(jié)構(gòu)，又如鼠類微小病毒DNS復(fù)制區(qū)起始點(diǎn)附近有GC交替排列序列。此外，DNA螺旋上溝的特征在其信息表達(dá)過(guò)程中起關(guān)鍵作用。調(diào)控蛋白都是通過(guò)其分子上特定的氨基酸側(cè)鏈與DNA雙螺旋溝中的堿基對(duì)一側(cè)的氫原子供體或受體相互作用，形成氫鍵從而識(shí)別DNA上的遺傳信息的。大溝所帶的遺傳信息比小溝多。溝的寬窄和深淺也直接影響到調(diào)控蛋白質(zhì)對(duì)DNA信息的識(shí)別。ZDNA中大溝消失，小溝狹而深，使調(diào)控蛋白識(shí)別方式也發(fā)生變化。這些都暗示ZDNA的存在不僅僅是由于DNA中出現(xiàn)嘌呤一啶嘧交替排列之結(jié)果，也一定是在漫漫的進(jìn)化長(zhǎng)河中對(duì)DNA序列與結(jié)構(gòu)不斷調(diào)整與篩選的結(jié)果，有其內(nèi)在而深刻的含意，只是人們還未充分認(rèn)識(shí)而已。（二）、堿基互補(bǔ)配對(duì)原則：A－T，G－C（三）、DNA分子的特點(diǎn)：穩(wěn)定性、特異性、多樣性。三、DNA復(fù)制起始位點(diǎn)和復(fù)制子的結(jié)構(gòu)1．復(fù)制的基本機(jī)理DNA由兩條螺旋的多核苷酸鏈組成，兩條鏈的堿基通過(guò)A:T和G:C之間的氫鍵聯(lián)結(jié)在一起。在復(fù)制過(guò)程中首先兩條鏈間的氫鍵破裂并使雙鏈解旋和分開，然后以每條鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則(A:T，G:C)，由DNA聚合酶催化合成新的互補(bǔ)鏈，結(jié)果由一條鏈成為互補(bǔ)的兩條鏈，這樣新形成的兩個(gè)DNA分子與原來(lái)的DNA分子的堿基序列完全相同。在此過(guò)程中，每個(gè)子代DNA的一條鏈來(lái)自親代DNA，另一條鏈則是新合成的。這種復(fù)制方式稱此過(guò)程中，每個(gè)子代DNA的一條鏈來(lái)自親代的DNA，另一條鏈則是新合成的。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制(semiconservationreplication)。2．復(fù)制起始位點(diǎn)DNA復(fù)制在生物細(xì)胞中要從DNA分子上特定位置開始。這個(gè)特定的位置就稱為復(fù)制起點(diǎn)(Originofreplication)，用ori表示。3．復(fù)制子及復(fù)制子的結(jié)構(gòu)a.DNA復(fù)制從起點(diǎn)開始雙向進(jìn)行直到終點(diǎn)為止，每一個(gè)這樣的DNA單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單元(replicon)。b.在原核生物中，每個(gè)DNA分子上就有一個(gè)復(fù)制子;而在真核生物中，每個(gè)DNA分子有許多個(gè)復(fù)制子，每個(gè)復(fù)制子長(zhǎng)約50-200kb。因此，真核細(xì)胞DNA的復(fù)制是由許多個(gè)復(fù)制子共同完成的。c.既然DNA復(fù)制不是隨機(jī)的從DNA分子上的任何一點(diǎn)起始，而是從特定的區(qū)域開始，這說(shuō)明復(fù)制起點(diǎn)有其結(jié)構(gòu)上的特殊性。分子遺傳學(xué)者們利用分子克隆技術(shù)，分離出大腸桿菌染色體DNA復(fù)制起點(diǎn)oriC。它由422bp的DNA片段組成，其核苷酸序列已經(jīng)搞清。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)該為(1)在oriC區(qū)域內(nèi)有一系列對(duì)稱排列的反向重復(fù)序列，即回文結(jié)構(gòu)(palindrome)，這表明區(qū)域與復(fù)制酶系統(tǒng)的識(shí)別有關(guān)(2)在oriC區(qū)中還有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)(啟動(dòng)子)的核苷酸序列，這暗示了轉(zhuǎn)錄可能在大腸桿菌染色體DNA復(fù)制起始著重的作用。目前已有許多實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)錄確實(shí)是復(fù)制的起始所必需的，但具體的作用機(jī)制尚不清楚。4．復(fù)制的特點(diǎn)a.DNA復(fù)制的最主要特點(diǎn)是半保留復(fù)制，b.它還是半不連續(xù)復(fù)制(Semi-ondisctinuousreplication)。DNA雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，因此，在?fù)制起點(diǎn)處兩條DNA鏈解開成單鏈時(shí)，一條是5'→3'方向，另一條是3'→5'方向。以這兩條鏈為模板時(shí)，新生鏈延伸方向一條為3'→5'，另一條為5'→3'。但生物細(xì)胞內(nèi)所有催化DNA聚合酶都只能催化5'→3'延伸，這是一個(gè)矛盾。岡崎片段(Okaxakifragments)的發(fā)現(xiàn)使這個(gè)矛盾得以解決。在復(fù)制起點(diǎn)兩條鏈解開形成復(fù)制泡(replicationbubbles)，DNA向兩側(cè)復(fù)制形成兩個(gè)復(fù)制叉(replicationforks)。以復(fù)制叉移動(dòng)的方向?yàn)榛鶞?zhǔn)，一條模板鏈?zhǔn)?'→5'，以此為模板而進(jìn)行的新生DNA鏈的合成沿5'→3'方向連續(xù)進(jìn)行，這條鏈稱為前導(dǎo)鏈(leadingstrand)。另一條模板鏈的方向?yàn)?'→'3'，以此為模板的DNA合成也是沿5'→3'方向進(jìn)行，但與復(fù)制叉前進(jìn)的方向相反，而且是分段，不連續(xù)合成的，這條鏈稱為滯后鏈(laggingstrand)，合成的片段即為岡崎片段。這些岡崎片段以后由DNA連接酶連成完整的DNA鏈。這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物是普遍存在的，稱為DNA合成的半不連續(xù)復(fù)制。四、DNA的轉(zhuǎn)錄1．啟動(dòng)子1）啟動(dòng)子的定義是指RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并起動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA序列2）啟動(dòng)子的基本結(jié)構(gòu)a.原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)b.真核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)真核啟動(dòng)子一般包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及其上游約100-200bp序列，包含有若干具有獨(dú)立功能的DNA序列元件，每個(gè)元件約長(zhǎng)7-30bp。最常見(jiàn)的哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子中的元件序列見(jiàn)表。表哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子中常見(jiàn)的元件元件名稱共同序列結(jié)合的蛋白因子名稱分子量結(jié)合DNA長(zhǎng)度TATAboxTATAAAATBP30,00010bpGCboxGGGCGGSP-1105,00020bpCAATboxGGCCAATCTCTF/NF160,00022bpOctamerATTTGCATOct-176,00020bpOct-253,00023bpBGGGACTTTCCNFB44,00010bpATFGTGACGTAFT?20bp啟動(dòng)子中的元件可以分為兩種①核心啟動(dòng)子元件(corepromoterelement)指RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小的DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及其上游-25/-30bp處的TATA盒。核心元件單獨(dú)起作用時(shí)只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。②游啟動(dòng)子元件(upstreampromoterelements)包括通常位于-70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)更遠(yuǎn)的上游元件。這些元件與相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合能提高或改變轉(zhuǎn)錄效率。不同基因具有不同的上游啟動(dòng)子元件組成，其位置也不相同，就使得不同的基因表達(dá)分別有不同的調(diào)控。2．轉(zhuǎn)錄1）轉(zhuǎn)錄所需酶的種類和性質(zhì)a.原核生物的RNA聚合酶類該酶由五個(gè)亞基（αββ’ωσ）組成。α亞基分子量為65000亞基數(shù)目2功能與啟動(dòng)子結(jié)合β亞基分子量為155000亞基數(shù)目1功能含催化部位，起催化作用β’亞基分子量為51000亞基數(shù)目1功能與DNA結(jié)合ω亞基分子量為11000亞基數(shù)目1σ亞基分子量為70000亞基數(shù)目1功能識(shí)別起始位點(diǎn)b.真核生物的RNA聚合酶類真核生物的RNA聚合酶類及性質(zhì)2）轉(zhuǎn)錄區(qū)的結(jié)構(gòu)3）轉(zhuǎn)錄的過(guò)程：起始、延長(zhǎng)和終止課目第三講天然DNA的制備、限制性核酸內(nèi)切酶及DNA的片段化目的要求理解DNA的純化，掌握大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取以及λ噬菌體DNA的提取。熟練掌握限制性核酸內(nèi)切酶的類型、命名規(guī)則、識(shí)別序列和DNA的切害位點(diǎn)以及反應(yīng)系統(tǒng)。重點(diǎn)難點(diǎn)天然DNA的提取和純化；大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取以及λ噬菌體DNA的提?。幌拗菩院怂醿?nèi)切酶的類型、識(shí)別序列和DNA的切害位點(diǎn)。主要內(nèi)容第二節(jié)天然DNA的制備一、天然DNA的來(lái)源和用途.1.天然DNA的來(lái)源:大腸桿菌質(zhì)粒以及λ噬菌體2．天然DNA的用途:主要用于體外操作DNA二、天然DNA的提?。ㄒ唬⒋竽c桿菌質(zhì)粒DNA的提取方法質(zhì)粒DNA的提取是從事基因工程工作中的一項(xiàng)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)，提取方法有很多種，以下介紹一種最常用的方法。此方法適用于小量質(zhì)粒DNA的提取，提取的質(zhì)粒DNA可直接用于酶切、PCR擴(kuò)增等。簡(jiǎn)要方法如下：1．1%含質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2mlLB培養(yǎng)基。2．37℃3．取1.5ml菌體于Ep管，以10000rpm離心30s，棄上清液。4．加0.3ml溶液I充分混合。5．加入0.3ml溶液II(0.2mM/LNaOH，1％SDS)，輕輕翻轉(zhuǎn)混勻。6．加入0.3m1預(yù)冷溶液III輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于室溫不超過(guò)5min。7．以10，000rpm離心16min，取上清液于另一新Ep管8．加入1/2等體積的異丙醇。9．再以10，000rpm離心16min，棄上清。10．70％乙醇0．5ml洗滌一次，抽干所有液體。11．待沉淀干燥后，溶于TE緩沖液或水中。（二）、λ噬菌體DNA提取λ噬菌體是最早使用的克隆載體，λ噬菌體的基因組是一長(zhǎng)度約為50kb的雙鏈DNA分子，它在宿主細(xì)胞有兩種生活途徑，其一是裂解生長(zhǎng)，環(huán)狀DNA分子在細(xì)胞內(nèi)多次復(fù)制，合成大量噬菌體基因產(chǎn)物，裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌再進(jìn)行下一次感染；其二是溶源性生長(zhǎng)，即感染細(xì)胞內(nèi)λ噬菌體DNA整合到宿主菌染色體DNA中與之一起復(fù)制，并遺傳給子代細(xì)胞，宿主細(xì)胞不裂解。平板培養(yǎng)時(shí)，裂解生長(zhǎng)形成噬斑。液體培養(yǎng)時(shí)，裂解生長(zhǎng)使菌液中宿主菌最后全部被裂解而釋放出大量的噬菌體顆粒。經(jīng)過(guò)改造的λ噬菌體克隆位點(diǎn)可插入幾到幾十kb的外源DNA。許多cDNA和基因組文庫(kù)是以λ噬菌體作為克隆載體構(gòu)建的。因此，在經(jīng)文庫(kù)篩選得到目的克隆后，我們常常需要利用λ噬菌體裂解生長(zhǎng)的特點(diǎn)，培養(yǎng)獲得大量的噬菌體顆粒，并提取λ噬菌體DNA來(lái)開展進(jìn)一步的工作。具體步提取驟如下：1.將上述裂解液轉(zhuǎn)移至離心管，離心8000g×10min，去細(xì)菌碎片，取上清液。2.加RNaseA、DNaseI至1μg/ml，37℃3.加9.3gPEG8000，5.8gNaCl，搖勻至溶解，冰浴1hr或4℃4.4℃離心10000g×5.加2mlSM液，充分洗溶管壁及沉淀，移到新微量離心管，加20μl10%SDS，20μl0.5MEDTA，68℃6.加等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），混勻，離心12000g×5min，取上層液到一新微量離心管，加等體積氯仿/異戊醇（24：1），混勻，離心12000g×5min。7.取上層液到一新微量離心管，加等體積異丙醇，混勻，-20℃1hr，4℃離心12000g8.1ml預(yù)冷的70%乙醇洗滌沉淀1-2次，4℃離心8000g×9.沉淀溶于20μlTE，-20℃DNA的純化DNA純化的主要目的是回收得到純的目的DNA片段，去除影響DNA連接酶活性的物質(zhì)以及其它的DNA片段。純化DNA片段的方法有多種，如：電洗脫法、從低熔點(diǎn)或普通瓊脂糖凝膠中回收、玻璃珠純化、柱層析以及硅膠吸附等方法。目前一些生物公司推出了直接從PCR產(chǎn)物中或瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的試劑盒，有效地加快了DNA的純化的速度。三、DNA純化的基本步驟：1．從破壞的細(xì)胞壁和膜里釋放出可溶性的高分子DNA2．通過(guò)變性或蛋白質(zhì)分解使DNA和蛋白質(zhì)的復(fù)合體解離3．將DNA從其他大分子中分離出來(lái)。第三節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶和DNA片段化一、限制性核酸內(nèi)切酶1．定義：是指從核酸鏈中間水解3’，52．功能：在生物體內(nèi)，限制性內(nèi)切酶的主要功能是保護(hù)細(xì)菌不受噬菌體的感染，這一觀點(diǎn)已被人們廣泛接受。在體外的基因操作中，可在特定位點(diǎn)切開DNA，產(chǎn)生可體外連接的基因片段。研究者很快發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶是研究基因組成、功能及表達(dá)非常有用的工具。二、限制性核酸內(nèi)切酶的類型及作用機(jī)制和切割DNA的位點(diǎn)1．限制性核酸內(nèi)切酶的類型按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系，切斷核酸的情況不同，分為三類：Ⅰ類限制性核酸內(nèi)切酶由3種不同亞基構(gòu)成，兼具有修飾酶活性和依賴于ATP的限制性內(nèi)切酶活性，它能識(shí)別和結(jié)合于特定的DNA序列位點(diǎn)，去隨機(jī)切斷在識(shí)別位點(diǎn)以外的DNA序列，通常在識(shí)別位點(diǎn)周圍400-700bp。這類酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。Ⅱ類限制性核酸內(nèi)切酶與Ⅰ類酶相似，是多亞蛋白質(zhì)，既有內(nèi)切酶活性，又有修飾酶活性，切斷位點(diǎn)在識(shí)別序列周圍25-30bp范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)除Mg2+外，也需要ATP供給能量。Ⅲ類限制性核酸內(nèi)切酶只由一條肽鏈構(gòu)成，僅需Mg2+，切割DNA特異性最強(qiáng)，且就在識(shí)別位點(diǎn)范圍內(nèi)切斷DNA。是分子生物學(xué)中應(yīng)用最廣的限制性內(nèi)切酶。通常在重組DNA技術(shù)提到的限制性核酸內(nèi)切酶主要指Ⅱ類酶而言。制性核酸內(nèi)切酶的作用機(jī)制每種限制酶識(shí)別和切割的通常為4-6個(gè)核苷酸序列,稱為限制性位點(diǎn)(restrictionsites)或切點(diǎn).限制酶切割雙鏈DNA的方式有兩種，產(chǎn)生的末端也有兩種：第一種是交錯(cuò)切割，即兩條鏈的切點(diǎn)不在同一水平而是相隔數(shù)個(gè)堿基，故斷口產(chǎn)生兩小段自身互補(bǔ)的單鏈，這種末端容易互補(bǔ)連接，稱為粘性末端（cohesiveterminus）(圖13－1)；第二種為平整切割，即兩條鏈在同一水平切開，得到平齊末端（bluntterminus）(圖13－2)。由于具有相同粘性末端的DNA片段在DNA連接酶的作用下很容易共價(jià)連接，因此被廣泛地應(yīng)用于重組DNA操作中。具有相同平齊末端的DNA片段也可以連接，但連接效率只有粘性末端連接效率的1％。12圖13－2限制酶的兩類切割方式大部分限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別DNA序列具有回文結(jié)構(gòu)特征，切斷的雙鏈DNA都產(chǎn)生5’磷酸基和3①產(chǎn)生3’5’…G↓AATTC…3’→5’…3’…CATAA↑G…5’EooPⅠ3'…CTTAAOHpG②產(chǎn)生5’突出的粘性末端：以PstⅠ5’…CTGCA↓G…3’→5’…3’…G↑ACGTC…5’PstⅠ3’…③產(chǎn)生平末端（bluntend）:NruⅠ為例：5’…TCG↓CGA…3’→5’…3’…AGC↑GCT…5’NruⅠ3’…三、限制性核酸內(nèi)切酶命名規(guī)則及識(shí)別序列1．限制性核酸內(nèi)切酶的命名規(guī)則限制酶根據(jù)其來(lái)源命名。例如，限制酶EcoRⅠ來(lái)源于大桿菌E.coli的RY13菌株,Ⅰ指在該菌株中分離的第一個(gè)限制酶。具體情況如下圖所示。2．限制性核酸內(nèi)切酶的識(shí)別序列下面是一些最常用的限制酶的來(lái)源及其識(shí)別順序名稱識(shí)別序列來(lái)源AvaC↓(C)CG(A)GTGAnabaenavariabilisBamHG↓GATCCBacillusamyloliquefaciensHBglⅡA↓GATCTBacillusglobigiiEcoRⅠG↓*ATTCAEscherichiacoliRY13EcoRⅡ↓CC(AGGTEscherichiacoliR245HaeⅢGG↓*CCHaemophilusaegyptiusHindⅢ*↓AGCTTAHemophilusinfluenzaeRdHpaⅠGTT↓AACHaemophilusparainfluenzaeHpaⅡC↓*GGC同上KpnⅠGGTAC↓CKlebsiellapneumoniaeMboⅠ↓GATCMoraxellabovisPstⅠCTGCA↓GProvidenciastuartii四、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)系統(tǒng)（一）、建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的酶切反應(yīng)目前大多數(shù)研究者遵循一條規(guī)則，即10個(gè)單位的內(nèi)切酶可以切割1μg不同來(lái)源和純度的DNA。如果加入更多的酶，則可相應(yīng)縮短反應(yīng)時(shí)間；如果減少酶的用量，對(duì)許多酶來(lái)說(shuō)，相應(yīng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（不超過(guò)16小時(shí)）也可完全反應(yīng)。（二）、選擇正確的酶不言而喻，選擇的酶在底物DNA上必須至少有一個(gè)相應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn)。識(shí)別堿基數(shù)目少的酶比堿基數(shù)目多的酶更頻繁地切割底物。（三）、酶內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應(yīng)當(dāng)立即置于冰上。酶應(yīng)當(dāng)是最后一個(gè)被加入到反應(yīng)體系中（在加入酶之前所有的其它反應(yīng)物都應(yīng)當(dāng)已經(jīng)加好并已預(yù)混合）。酶的用量視在底物上的切割頻率而定。（四）、DNA待切割的DNA應(yīng)當(dāng)已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污劑或過(guò)多鹽離子的污染，以免干擾酶的活性。DNA的甲基化也應(yīng)該是酶切要考慮到的因素。關(guān)于甲基化的內(nèi)容。（五）、緩沖液對(duì)于每一種酶NEB都提供相應(yīng)的最佳緩沖液，可保證幾乎100%的酶活性。使用時(shí)的緩沖液濃度應(yīng)為1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以實(shí)現(xiàn)最佳活性。在這種情況下，我們也相應(yīng)提供100X的BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不會(huì)受太大影響。（六）、反應(yīng)體積內(nèi)切酶活力單位的定義是：1小時(shí)內(nèi)，50μl反應(yīng)體積中，降解1μg的底物DNA所需的酶為一個(gè)活力單位。較小的反應(yīng)體積更容易受到移液器誤差的影響。為了將甘油的濃度控制在5%以下，要注意酶的體積不要超過(guò)總體積的10%（一般酶都貯存于50%的甘油中）。（七）、混合這是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反應(yīng)完全，必須使反應(yīng)液充分混合。我們推薦用槍反復(fù)吸取混合，或是用手指輕彈管壁混合，然后再快速離心一下即可。注意：不可振蕩?。ò耍?、反應(yīng)溫度大部分酶的反應(yīng)溫度為37°C；從嗜熱菌中分離出來(lái)的內(nèi)切酶則要求更高的溫度。一般為50（九）、反應(yīng)時(shí)間1酶活單位的定義時(shí)間為1小時(shí)。如果加入的酶較多，可以相應(yīng)地縮短反應(yīng)時(shí)間；反之，如果加入的酶量較少，也可以延長(zhǎng)時(shí)間以使反應(yīng)達(dá)到完全。（十）、終止反應(yīng)如果不進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)，可用終止液來(lái)終止反應(yīng)。在NEB我們使用如下反應(yīng)終止液：50%的甘油，50mMEDTA（pH8.0），和0.05%溴酚藍(lán)（10μl/50μl反應(yīng)液）。如果要進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)，可用熱失活法終止反應(yīng)（65°C或（十一）、貯存大部分酶應(yīng)貯存于-20°C。少部分酶則須在-70°（十二）、穩(wěn)定性每隔1-2個(gè)月都會(huì)對(duì)所有的酶有一個(gè)活性檢測(cè)；最近的一次檢測(cè)結(jié)果將被貼在售出的每一管酶上。通過(guò)三十多年來(lái)的經(jīng)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)大部分酶在推薦的保存緩沖液里在-20°C條件下十分穩(wěn)定。高于（十三）、對(duì)照反應(yīng)如果發(fā)現(xiàn)您的DNA底物不能被成功切開，可以進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)以查明原因。具體方法如下：將不加內(nèi)切酶的底物DNA（待切底物）與加入了內(nèi)切酶的對(duì)照DNA（有多個(gè)已知酶切位點(diǎn)）同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。若實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明底物DNA降解，則說(shuō)明DNA在純化過(guò)程中或反應(yīng)液里引入了核酸酶污染；若實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物DNA保持完整，而對(duì)照DNA被成功切開，則可以排除酶質(zhì)量的原因，此時(shí)可以將對(duì)照DNA和待切底物DNA混合起來(lái)再次進(jìn)行反應(yīng)，以確定樣品中是否有抑制劑。如果有抑制劑存在（通常是鹽、EDTA或酚），則混合物里的對(duì)照DNA也無(wú)法被切開。課目第四講特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增目的要求要求學(xué)生熟練掌握PCR擴(kuò)增的定義、基本原理、擴(kuò)增DNA片斷的基本條件、試劑、步驟和常用的DNA片段PCR擴(kuò)增系統(tǒng)。重點(diǎn)難點(diǎn)PCR擴(kuò)增的基本原理、擴(kuò)增DNA片斷的基本條件、試劑、步驟。主要內(nèi)容第四節(jié)特異性DNA片段的PCR擴(kuò)增一、PCR基本原理PCR擴(kuò)增的定義聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction簡(jiǎn)稱PCR）又稱無(wú)細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新?？蓪O微量的靶DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬(wàn)倍，從而大大提高對(duì)DNA分子的分析和檢測(cè)能力，能檢測(cè)單分子DNA或?qū)γ?0萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中僅含1個(gè)靶DNA分子的樣品，因而此方法立即在分子生物學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及遺傳學(xué)等多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展。PCR擴(kuò)增的基本原理PCR擴(kuò)增DNA的原理是：先將含有所需擴(kuò)增分析序列的靶DNA雙鏈經(jīng)熱變性處理解開為兩個(gè)寡聚核苷酸單鏈，然后加入一對(duì)根據(jù)已知DNA序列由人工合成的與所擴(kuò)增的DNA兩端鄰近序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引物。此引物范圍就在包括所欲擴(kuò)增的DNA片段，一般需20-30個(gè)堿基對(duì)，過(guò)少則難保持與DNA單鏈的結(jié)合。引物與互補(bǔ)DNA結(jié)合后，以靶DNA單鏈為模板，經(jīng)反鏈雜交復(fù)性（退火），在TaqDNA聚合酶的作用下以4種三磷酸脫氧核苷（dNTP）為原料按5'到3'方向?qū)⒁镅由?、自?dòng)合成新的DNA鏈、使DNA重新復(fù)制成雙鏈。然后又開始第二次循環(huán)擴(kuò)增。引物在反應(yīng)中不僅起引導(dǎo)作用，而且起著特異性的限制擴(kuò)增DNA片段范圍大小的作用。新合成的DNA鏈含有引物的互補(bǔ)序列，并又可作為下一輪聚合反應(yīng)的模板。如此重復(fù)上述DNA模板加熱變性雙鏈解開—引物退火復(fù)性—在DNA聚合酶作用下的引物延伸的循環(huán)過(guò)程，使每次循環(huán)延伸的模板又增加1倍，亦即擴(kuò)增DNA產(chǎn)物增加1倍，經(jīng)反復(fù)循環(huán)，使靶DNA片段指數(shù)性擴(kuò)增。二、PCR擴(kuò)增特異性DNA片段的主要條件1．模板核酸：不過(guò)RNA的擴(kuò)增首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進(jìn)行PCR循環(huán)。2．引物：PCR結(jié)果的特異性取決于引物的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小也是由特異引物限定的。3．緩沖液：PCR反應(yīng)的緩沖液的目的是給TaqDNA聚合酶提供一個(gè)最適酶催反應(yīng)條件。4．Mg2+：Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實(shí)性，這是TaqDNA聚合酶活性所必需的。5．三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反應(yīng)中dNTP含量太低，PCR擴(kuò)增產(chǎn)量太少、易出現(xiàn)假陰性。6．耐熱DNA聚合酶：PCR之所以能得到廣泛應(yīng)用，主要是因?yàn)門aqDNA聚合酶取代了大腸桿菌DNA聚合酶I大片段。7．溫度循環(huán)參數(shù)1）變性溫度與時(shí)間：PCR反應(yīng)中模板DNA的變性十分重要。只有完全性的模板DNA和PCR產(chǎn)物雙鏈完全解開，才能有效的和引物結(jié)合。這種結(jié)合是PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ)。2）復(fù)性溫度與時(shí)間：變性溫度是PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵，復(fù)性溫度決定著PCR的特異性。3）延伸溫度與時(shí)間：引物延伸溫度一般為72℃4）循環(huán)數(shù)：循環(huán)數(shù)決定著擴(kuò)增的產(chǎn)量。在其它參數(shù)都已優(yōu)化條件下，最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列初始濃度。三、PCR擴(kuò)增DNA片段的方法1．試劑1）引物：決定擴(kuò)增的特異性。根據(jù)檢測(cè)的DNA不同，選用不同引物，每種病原微生物都有自己特異的引物。2）耐熱的DNA聚合酶：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來(lái)的，能耐受高溫90℃3）10×PCR緩沖液：此酶是從耐熱細(xì)菌中分離出來(lái)的，能耐受高溫90℃4）5mmol/LdNTP貯備液：將dATP、dCTP、dGTP和dTTP鈉鹽各100mg合并，加入滅菌去離子水溶解，用NaOH調(diào)pH至中性，分裝每份300μl，-20℃5）DNA模板：用處理液將待測(cè)標(biāo)本處理，不同處理方法、操作各異，但目的是暴露標(biāo)本中被檢測(cè)的DNA。2．基本反應(yīng)步驟PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成1）模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃2）模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃3）引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。(Plateau)。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。四、常用的DNA片段PCR擴(kuò)增系統(tǒng)1．兼并引物（DegeneratePrimer）PCR密碼子具有兼并性，單以氨基酸順序推測(cè)編碼的DNA序列是不精確的，但可以設(shè)計(jì)成對(duì)兼并引物，擴(kuò)增所有編碼已知順序的核酸序列。用兼并引物時(shí)寡核苷酸中核苷酸序列可以改變，但核苷酸的數(shù)量應(yīng)相同。兼并度越低，產(chǎn)物特異性越強(qiáng)，設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)盡量選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3’2．套式引物（NestedPrimer）PCR用第一套引物擴(kuò)增15～30個(gè)循環(huán)，再用擴(kuò)增DNA片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增15～30個(gè)循環(huán)，這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增，而次級(jí)結(jié)構(gòu)卻很少擴(kuò)增。用起始引物限量方法或Centricon30(Amicon)分子濾過(guò)器離心，在第二套引物加入前去除第一引物。此方法已成功地用來(lái)分析中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞AS52的分子突變。AS52細(xì)胞含有單拷貝的細(xì)胞gpt（guaninephos－phribosytransferase）基因，與哺乳動(dòng)物具有同源性。套式引物PCR減少了引物非特異性退火，從而增加了特異性擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增效率。對(duì)環(huán)境樣品中微生物檢測(cè)和單拷貝的基因靶DNA的擴(kuò)增是非常有效的。3．復(fù)合PCR（MultiplexPCR）用多對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增幾條DNA片段的方法稱為復(fù)合PCR。兩種不同的軍團(tuán)菌（legionella）基因，一為特異嗜肺L基因（mip），另一種為L(zhǎng)-5SrRNA基因，通過(guò)引物搖擺（staggered）添加進(jìn)行復(fù)合PCR。首先mip引物PCR擴(kuò)增7個(gè)循環(huán)，然后加入5SrRNA引物PCR擴(kuò)增38個(gè)循環(huán)。加入不同量的LacZ和LacB基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增可以檢測(cè)大腸桿菌和與人類糞便污染有關(guān)的細(xì)菌包括E.coli大腸菌、腸源致病沙門氏菌和志賀氏菌。4．反向PCR（InversePCR或ReversePCR）反向PCR的目的在于擴(kuò)增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說(shuō)這一反應(yīng)體系不是在一對(duì)引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時(shí)選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補(bǔ)，但兩引物3’5．不對(duì)稱PCR（AsymmetricPCR）不對(duì)稱PCR的基本原理是采用不等量的一對(duì)引物產(chǎn)生大量的單鏈DNA（ss-DNA）。這兩種引物分別稱為限制性引物與非限制性引物；其最佳比例一般為1：50～1：100，關(guān)鍵是限制引物的絕對(duì)量。限制性引物太多太少，均不利于制備ss-DNA。也可用普通PCR制備靶DNA雙鏈DNA（ds-DNA），再以ds-DNA為模板，只用其中一種過(guò)量引物進(jìn)行單引物PCR制備ss-DNA。產(chǎn)生的ds-DNA與ss-DNA由于分子量不同可以在電泳中分開，而得到純ss-DNA。不對(duì)稱PCR主要為測(cè)序制備ss-DNA，尤為用cD－NA經(jīng)不對(duì)稱PCR進(jìn)行DNA序列分析是研究真核DNA外顯子的好方法。6．標(biāo)記PCR（LP-PCR）和彩色PCRLP-PCR（LabelledPrimersPCR）是利用同位素、熒光素等對(duì)PCR引物5’7．加端PCR加端PCR（add-PCR）是使擴(kuò)增產(chǎn)物的5’8．錨定PCR或固定PCR在聚丙烯管中可以對(duì)多種含膜板材料進(jìn)行PCR，而在顯微玻片上用組織細(xì)胞涂片或切片直接進(jìn)行DNA擴(kuò)增的方法就稱為玻片PCR（Slide-PCR）。課目第五講DNA片段的化學(xué)合成及凝膠電泳檢測(cè)目的要求要求學(xué)生掌握核苷酸片段的合成方法，DNA片段的化學(xué)合成的原理、方法和原料；了解凝膠電泳檢測(cè)DNA片段的技術(shù)參數(shù)，深刻理解DNA重組的概念、連接酶和重組類型。重點(diǎn)難點(diǎn)DNA片段的化學(xué)合成的原理、方法和原料；DNA重組的概念、連接酶和重組類型。主要內(nèi)容DNA片段的化學(xué)合成一、核苷酸片段的化學(xué)合成方法1．原位合成：原位合成適用于寡核苷酸寡聚核苷酸原位合成技術(shù)是由Affymetrix公司開發(fā)的，采用的技術(shù)原理是在合成堿基單體的5＇羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用光照射使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè)5＇端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過(guò)程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長(zhǎng)。2．直接點(diǎn)樣：直接點(diǎn)樣既適用于大片段DNA，也適用于寡核苷酸，甚至mRNA。點(diǎn)樣法是將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過(guò)特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。采用的機(jī)器人有一套計(jì)算機(jī)控制三維移動(dòng)裝置；多個(gè)打印/噴印頭；一個(gè)減震底座，上面可放內(nèi)盛探針的多孔板和多個(gè)芯片。根據(jù)需要還可以有溫度和濕度控制裝置；針洗滌裝置。打印/噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印于芯片上。真接打印時(shí)針頭與芯片接觸，而在噴印時(shí)針頭與芯片保持一定距離。打印法的優(yōu)點(diǎn)是探針密度高，通常1平方厘米可打印2,500個(gè)探針。缺點(diǎn)是定量準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使用壽命有限。噴印法的優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，使用壽命長(zhǎng)。缺點(diǎn)是噴印的斑點(diǎn)大，因此探針密度低，通常只有1平方厘米400點(diǎn)。國(guó)外有多家實(shí)驗(yàn)室和公司研究開發(fā)打印/噴印設(shè)備。二、化學(xué)方法合成的DNA片段1．歷史1）寡核苷酸的化學(xué)合成起步于20世紀(jì)四十年代末。2）1955年，劍橋大學(xué)的Todd實(shí)驗(yàn)室成功合成了具有磷酸二酯鍵結(jié)構(gòu)的TpT,并獲得1957年諾貝爾獎(jiǎng)。3）1965年，Khorana等利用化學(xué)方法大量合成脫氧核苷的單一聚合物或二種、三種脫氧核苷的重復(fù)序列，和人工合成的六十四種核糖三糖苷，研究蛋白質(zhì)的生物合成過(guò)程，從而確定了氨基酸的三聯(lián)密碼子，因此而獲得1968年諾貝爾獎(jiǎng)。4）六十至七十年代，寡核苷酸的化學(xué)合成方法不斷完善，逐漸形成了今天被廣泛應(yīng)用的固相亞磷酸三酯法并實(shí)現(xiàn)了合成的自動(dòng)化。5）八十年代中后期，隨著PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，寡核苷酸的化學(xué)合成的應(yīng)用幾乎進(jìn)入了每一個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。是化學(xué)合成的寡核苷酸為PCR這一分子生物學(xué)及醫(yī)學(xué)工作者的利器提供了刀鋒。2．基本原理核酸分子的基本骨架是相鄰核苷酸間的3’→5’磷酸二酯鍵，一個(gè)矛盾便是核苷酸為一個(gè)多官能基團(tuán)的分子，且人工化學(xué)合成核酸分子必定是一個(gè)多步連續(xù)的反應(yīng)，因此要求副反應(yīng)盡可能的少，否則目的產(chǎn)物的產(chǎn)率以及純化的難度會(huì)使合成失敗。所以化學(xué)合成的基本過(guò)程便是在合成過(guò)程中盡可能的將不需要的基團(tuán)暫時(shí)保護(hù)起來(lái)，在一輪縮合反應(yīng)之后，再將上一輪基團(tuán)上的保護(hù)基選擇性的脫下來(lái)，以形成專一的磷酸二酯鍵。目前，一般DNA合成都采用固相亞磷酰胺三酯法。對(duì)此法的最簡(jiǎn)單描述是：溶液中的單體通過(guò)縮合反應(yīng)形成3’3．基本原料1）支持物：固相合成是將核酸固定在固相載體上完成合成反應(yīng)的，最常用的固相載體為可控微孔玻璃珠（CPG，controlledporeglass），CPG的孔徑根據(jù)所合成的寡核苷酸的長(zhǎng)度而定，一般合成鏈長(zhǎng)小于60nt時(shí)，選擇孔徑500埃，鏈長(zhǎng)大于60nt時(shí)，使用1000埃CPG，使用CPG的縮合效率高達(dá)98%-99.9%，可以滿足合成長(zhǎng)達(dá)175nt的寡核苷酸的條件。2）單體：合成所用單體為核苷亞磷酰胺，是經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的核苷酸，含下面幾個(gè)功能基團(tuán)。a.3’b.3’c.5’d.A和C的雜環(huán)氨基上的苯甲酸保護(hù)基，合成完畢后脫去；e.G上嘌呤環(huán)氨基上的異丙酰保護(hù)基，合成完畢后脫去。4.合成步驟第一步----去封閉（Deblocking）,用三氯乙酸去除CPG所連核苷上的DMT,以暴露5’第二步----活化（Activation）,在縮合之前，單體與四唑混合并進(jìn)入合成柱，此時(shí)四唑提供一個(gè)質(zhì)子給3’第三步----連接（Coupling），亞磷酰胺四唑與CPG所連的核苷酸碰撞時(shí)，與其5’第四步----蓋帽（Capping）,為了防止未反應(yīng)的與CPG相連的5’第五步----氧化（Oxidation），連接反應(yīng)后新加上的核苷酸通過(guò)亞磷酯鍵（磷為三價(jià)）與CPG上相連的寡核苷酸鏈連接，此亞磷酯鍵不穩(wěn)定，易被酸、堿水解，因此需將此處三價(jià)磷氧化為五價(jià)的磷。常用的氧化劑為碘的四氫呋喃溶液。此步反應(yīng)速度亦很快。應(yīng)注意最后一個(gè)循環(huán)時(shí)，氧化步驟不可省略。此外亦可用其他氧化劑來(lái)完成氧化，從而得到各種符合實(shí)驗(yàn)需要的寡核苷酸。循環(huán)上述一至五步，寡核苷酸鏈即可延伸至所需長(zhǎng)度時(shí)即可完成。第六節(jié)DNA片段大小的凝膠電泳檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)室中常用的電泳參數(shù)1.瓊脂糖凝膠電泳參數(shù)2.非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳參數(shù)3.脈沖場(chǎng)凝膠電泳參數(shù)二、DNA片段的連接及重組類型1．DNA重組的概念及作用1）概念：本質(zhì)上是一個(gè)酶促生化過(guò)程，是指將外源目的基因片段通過(guò)DNA連接酶的的作用插入到質(zhì)粒載體中的過(guò)程。DNA片段只有與載體重組并轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞中才能進(jìn)行復(fù)制。2）此方法可以對(duì)單個(gè)基因的功能進(jìn)行研究。結(jié)合PCR技術(shù)還可以應(yīng)用于疾病診斷、合成具有商業(yè)意義的產(chǎn)品，如胰島素、干擾素等。2．DNA片段的連接重組DNA的連接主要有粘性末端和平端連接法，這些主要根據(jù)外源片段的末端性質(zhì)、質(zhì)粒性質(zhì)以及兩者的酶切位點(diǎn)來(lái)確定。3．DNA連接酶主要有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。E.coliDNA連接酶催化DNA分子連接的機(jī)理與T4噬菌體DNA連接酶基本相同，只是輔助因子不是ATP而是NAD+。T4噬茵體DNA連接酶催4．DNA片段之間的連接1）連接:連接反應(yīng)的一項(xiàng)重要參數(shù)是溫度。理論上講連接反應(yīng)的最佳溫度是37℃，此時(shí)連接酶的活性最高。但37℃時(shí)粘性末端分子形成的配對(duì)結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，因此人們找到了一個(gè)既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又有助于短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的最適溫度即12～5．DNA重組類型課目第六講分子克隆的載體及質(zhì)粒克隆的載體目的要求要求學(xué)生理解載體的概念和載體具備的條件，掌握質(zhì)粒的定義，構(gòu)型與特性，重點(diǎn)掌握質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)預(yù)處理的主要問(wèn)題和基本策略；同時(shí)要求學(xué)生以pBR322為例掌握質(zhì)粒構(gòu)建的方法。重點(diǎn)難點(diǎn)載體的概念和載體具備的條件，質(zhì)粒的定義，構(gòu)型與特性，質(zhì)粒構(gòu)建時(shí)預(yù)處理的主要問(wèn)題和基本策略。主要內(nèi)容引言一、分子克隆的載體1．載體的定義載體（vector）是指運(yùn)載外源DNA有效進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)的工具。載體同外源DNA在體外重組成DNA重組分子，在進(jìn)入受體后形成一個(gè)復(fù)制子，即形成在細(xì)胞內(nèi)能獨(dú)自進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳因子。2．作為載體應(yīng)該具備的基本條件作為載體應(yīng)該滿足以下幾方面的要求：①有某種限制酶的一個(gè)切點(diǎn)，最好是有許多種限制酶的切點(diǎn)，而且每種酶的切點(diǎn)只有一個(gè)；②外源DNA插入后不影響載體在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，載體應(yīng)對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害，以及載體能接納盡可能大的外源DNA片段；③有利于選擇的標(biāo)記基因，可以很方便地知道外源DNA已經(jīng)插入，以及把接受了載體的受體細(xì)胞選出；④具有促進(jìn)外源DNA表達(dá)的調(diào)控區(qū)。第一節(jié)質(zhì)粒克隆載體一、質(zhì)粒定義與構(gòu)型1．定義：質(zhì)粒（plasmid）是一種寓于宿主細(xì)胞中染色體外裸露的雙鏈DNA分子，一個(gè)質(zhì)粒就是一個(gè)DNA分子。2．構(gòu)型：在宿主細(xì)胞內(nèi)，質(zhì)粒一般以超螺旋共價(jià)閉環(huán)DNA分于（ccc-DNA）的形式存在。體外在理化因子作用下，質(zhì)粒可以成為開環(huán)DNA分子（oc-DNA）和線形DNA分子(1－DNA)。在變性條件下，質(zhì)?？沙蔀閱捂淒NA分子（ssDNA）。二、質(zhì)?？寺≥d體的特性1．具有獨(dú)立復(fù)制起點(diǎn)：這是質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增的必要條件。2．具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量：質(zhì)粒是染色體外DNA，通常由環(huán)形雙鏈DNA構(gòu)成，其分子大小約為1~200kb（注：1.5Kb≈1MD兆道爾頓，或：小：103KD；大：105KD；即具有相對(duì)較小的分子質(zhì)量）。相對(duì)分子量小有利于DNA的分離和操作，但也限制其克隆外源DNA片段的大小，一般不超過(guò)15kb。3．具有較高拷貝數(shù)：每個(gè)細(xì)胞可含有10~200個(gè)拷貝的松弛型復(fù)制質(zhì)粒。當(dāng)加入蛋白質(zhì)合成抑制劑(如氯霉素等)，還可大大增加細(xì)胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)，每個(gè)細(xì)胞可含有高達(dá)數(shù)千個(gè)拷貝的質(zhì)粒，使外源DNA得以大量擴(kuò)增。4．具有選擇性標(biāo)記：如抗生素的抗性基因，便于對(duì)克隆基因的檢測(cè)和篩選。5．易于導(dǎo)入細(xì)胞：質(zhì)粒可通過(guò)轉(zhuǎn)化或電穿孔等方法極易被導(dǎo)入細(xì)胞。6．具有安全性：作為載體的質(zhì)粒不具有轉(zhuǎn)移功能，防止帶有外源DNA的重組質(zhì)粒擴(kuò)散至實(shí)驗(yàn)室外，以免造成危害。三、構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的基本策略1．構(gòu)建一種質(zhì)粒載體時(shí)預(yù)先考慮的主要問(wèn)題1）應(yīng)該了解載體上的基因位置、限制性內(nèi)切酶的作用位點(diǎn)；2）在理想寄主中，載體應(yīng)該容易繁殖，因而可以得到大理載體和DNA重組分子；3）載體應(yīng)該包括一個(gè)可供選擇的標(biāo)記性狀，從而可以區(qū)別含有載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞和不具有載體的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。4）質(zhì)粒的分子量應(yīng)盡可能的??；5）理想的載體還應(yīng)該有另一個(gè)遺傳標(biāo)記基因，這個(gè)標(biāo)記基因可以因一段外源DNA片斷的插入而被鈍化，導(dǎo)致表現(xiàn)型的改變，以區(qū)別具有DNA重組分子的細(xì)胞和不具有DNA重組體分子的細(xì)胞。6）在載體的上述兩個(gè)標(biāo)記基因中，應(yīng)該最大限度的具有各種限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)，而且這些酶的識(shí)別序列僅在載體上出現(xiàn)一次，以保證酶處理后，環(huán)狀DNA只在一處被打開，為克隆不同種的限制性片斷提供了最大的可能性。2．質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建的基本策略1)構(gòu)建的質(zhì)粒克隆載體應(yīng)該是能在轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞中進(jìn)行有效的復(fù)制．并且作為質(zhì)?？寺≥d體，希望在受體細(xì)胞中有較多的拷貝數(shù)。2)構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體必須含有允許外源DNA片段克隆的位點(diǎn)，并且這樣的克隆位點(diǎn)應(yīng)盡可能多。3）構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體必須含有供選擇克隆子的標(biāo)記基因。一個(gè)質(zhì)?？寺≥d體最好有兩種選擇標(biāo)記基因，并且在選擇標(biāo)記基因區(qū)內(nèi)有合適的克隆位點(diǎn)。4）構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體DNA分子應(yīng)盡可能小。5）根據(jù)特殊需耍．使構(gòu)建的質(zhì)?？寺≥d體中組裝各種“元件”（小DNA片斷），構(gòu)建成不同用途的質(zhì)?？寺≥d體。3．以常用的pBR322為例說(shuō)明載體構(gòu)建的步驟1）pBR322的定義pBR322是應(yīng)用最廣泛的質(zhì)粒載體，它屬松弛型質(zhì)粒，有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素兩個(gè)抗性基因可作為標(biāo)記基因，有許多種常用的限制酶的切點(diǎn)。它全長(zhǎng)4352個(gè)核苷酸，排列順序已全部測(cè)定。2)pBR322質(zhì)粒載體的特點(diǎn)①可插入外源DNA大小為5kb左右，外源DNA若超過(guò)10kb，質(zhì)粒在復(fù)制時(shí)就會(huì)變得不穩(wěn)定。②它具有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，是松弛型質(zhì)粒，故細(xì)胞中具有較高的拷貝數(shù)，每個(gè)細(xì)胞含有20～30個(gè)拷貝。③pBR322還具有兩種抗生素的抗性基因，一個(gè)是四環(huán)素抗性基因(Tetr)另一個(gè)是氨芐青霉素抗性基因(Ampr)。④外源DNA的插入而導(dǎo)致基因失活的現(xiàn)象，稱為插入失活(insertionalinactivation)。插入失活常被用于檢測(cè)含有外源DNA的重組體，例如若在質(zhì)粒pBR322的BamHI的位點(diǎn)插入外源DNA，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Tets、Amps)。有重組質(zhì)粒(即帶有外源DNA的質(zhì)粒)的宿主細(xì)胞失去對(duì)四環(huán)素的抗性，所以不能在含有四環(huán)素培養(yǎng)基的平板上生長(zhǎng)，但仍能在含有氨芐青霉素培養(yǎng)基的平板上生長(zhǎng)。而那些含有不帶外源基因的質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，則可以在含有四環(huán)素或氨芐青霉素培養(yǎng)基的平板上生長(zhǎng)，這樣就很容易篩選到含有目的基因的細(xì)菌，從而淘汰不含目的基因的細(xì)菌。3）pBR322質(zhì)粒載體構(gòu)建的步驟4）pBR322質(zhì)粒載體的特點(diǎn)課目第七講病毒（噬菌體）克隆載體及染色體定位整合克隆載體目的要求要求學(xué)生掌握λ噬菌體克隆載體、反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體的定義；重點(diǎn)掌握λ噬菌體、cosmid克隆載體、M13噬菌體克隆載體、SV40克隆載體、反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體的構(gòu)建策略和途徑；同時(shí)要求學(xué)生了解性掌握定位整合克隆載體的4種模式與兩種主要類型。重點(diǎn)難點(diǎn)λ噬菌體克隆載體、反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體的定義，λ噬菌體、cosmid克隆載體、M13噬菌體克隆載體、SV40克隆載體、反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體的構(gòu)建策略和途徑。主要內(nèi)容第二節(jié)病毒（噬菌體）克隆載體一、λ噬菌體克隆載體1．關(guān)于λ噬菌體的簡(jiǎn)介2．λ噬菌體的構(gòu)建二、cosmid克隆載體1．cosmid克隆載體的特征2．cosmid克隆載體的構(gòu)建三、M13噬菌體克隆載體1．M13DNA2．M13DNA的復(fù)制和M13噬菌體的增殖3．構(gòu)建M13噬茵體克隆載體的策略和途徑4．M13克隆載體的應(yīng)用四、SV40克隆載體1．SV40－DNA的復(fù)制和SV40的增殖2．構(gòu)建SV40克隆載體的基本策略和途徑1）取代型克隆載體2）病毒－質(zhì)粒重組克隆載體。五、反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體1．定義2．勞斯肉瘤病毒的生物學(xué)特性3．構(gòu)建RSV反轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體的策略和途徑第三節(jié)染色體定位整合克隆載體一、定位整合克隆載體的幾種模式1．內(nèi)源平臺(tái)雙交換置換克隆載體2．外源平臺(tái)雙交換置換克隆載體3．內(nèi)源平臺(tái)雙交換插入克隆載體4．內(nèi)源平臺(tái)單交換插入克隆載體二、定位整合克隆載體1．植物染色體定位整合克隆載體2．動(dòng)物染色體定位整合克隆載休課目第八講人工染色體克隆載體及特殊用途克隆載體目的要求要求學(xué)生重點(diǎn)掌握人工染色體克隆載體的含義、特點(diǎn)、構(gòu)建和應(yīng)用，一般性掌握啟動(dòng)子探針型克隆載體、誘導(dǎo)型表達(dá)克隆載體、反義表達(dá)克隆載體的含義，類型及相應(yīng)內(nèi)含簡(jiǎn)介。重點(diǎn)難點(diǎn)人工染色體克隆載體的含義、特點(diǎn)、構(gòu)建和應(yīng)用，啟動(dòng)子探針型克隆載體、誘導(dǎo)型表達(dá)克隆載體、反義表達(dá)克隆載體的含義，類型。主要內(nèi)容第四節(jié)人工染色體克隆載體一、人工染色體克隆載體的含義和特點(diǎn)含義特點(diǎn)二、人工染色體克隆載體的構(gòu)建三、人工染色體克隆載體的應(yīng)用1．構(gòu)建基因組文庫(kù)2．基因治療3．基因功能的鑒定第五節(jié)特殊用途克隆載體一、啟動(dòng)子探針型克隆載體1．啟動(dòng)子探針型克隆載體的定義2．類型和相應(yīng)內(nèi)含簡(jiǎn)介1）Kanr標(biāo)記的啟動(dòng)子探針克隆載體。2）gfp標(biāo)記的啟動(dòng)子探針克隆載體。3）hPh標(biāo)記的啟動(dòng)于探針克隆載體。4）Kanr標(biāo)記的自動(dòng)子探針克隆載體。二、誘導(dǎo)型表達(dá)克隆載體1．誘導(dǎo)型表達(dá)克隆載體的定義2．類型和相應(yīng)內(nèi)含簡(jiǎn)介1）二價(jià)金屬離子誘導(dǎo)表達(dá)克隆載體。2）干旱誘導(dǎo)表達(dá)克隆載體。3）紅光誘導(dǎo)表達(dá)克降載體。三、反義表達(dá)克隆載體1．反義表達(dá)克隆載體2．類型及相應(yīng)內(nèi)含簡(jiǎn)介1）SOD基因反義表達(dá)更隆載體．2）NHE1基因反義表達(dá)克隆載體。課目第九講目的基因、目的基因的制備及目的基因的分離目的要求了解原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的基因組成；一般性掌握目的基因的概念和基因的化學(xué)合成；理解基因組文庫(kù)和