固相膜免疫分析技術(shù)技術(shù)

臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)固相膜免疫分析技術(shù)北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科劉平固相膜免疫分析技術(shù)掌握膠體金免疫技術(shù)原理、技術(shù)要點(diǎn)掌握不同膜載體免疫技術(shù)的原理熟悉金免疫檢測的臨床應(yīng)用了解膠體金和免疫金的制備了解固相膜及其技術(shù)要求概述：

隨著免疫學(xué)技術(shù)和相關(guān)生物化學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測方法上派生出了多種類型的固相膜免疫快速檢測試驗(yàn)。該類試驗(yàn)的最大特點(diǎn)是不需要大型設(shè)備，對檢測人員稍加培訓(xùn)即能掌握操作要求和判定標(biāo)準(zhǔn)。固相膜免疫分析技術(shù)：

是以微孔膜作為固相載體，利用液體可以流過微孔膜也可通過毛細(xì)管作用在膜上向前移行的特性，以酶標(biāo)記或者各種有色顆粒（如彩色膠乳、膠體金、或膠體硒等）標(biāo)記抗原或抗體作為標(biāo)記物，通過抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行抗原或抗體檢測的快速檢驗(yàn)方法。常用的固相膜玻璃纖維素(fiberglass)膜尼龍(nylon)膜聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜固相膜的特點(diǎn)多孔性濾紙毛細(xì)管作用非共價(jià)鍵高度吸附抗體或抗原高度敏感性易于漂洗操作簡便固相膜的技術(shù)要求孔徑：穿流法的膜一般選擇0.4μm左右；橫流法的膜可選擇5μm?10μm流速：孔徑和分布結(jié)構(gòu)影響膜的流動(dòng)速率，孔徑大，流速快。以ml/cm2/min表示蛋白質(zhì)結(jié)合力：吸附力很強(qiáng)，以μg/cm2表示均一性優(yōu)質(zhì)的膜具有良好的均一性。固相NC膜固相膜免疫測定的特點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)不足之處簡便，快速敏感度略低，價(jià)格略高（與ELISA比）單份測定精密度較差，質(zhì)控困難保存期長（優(yōu)質(zhì)試劑）穩(wěn)定性較差（普通試劑）可測定物范圍廣（主要為定性試驗(yàn)）不易制備定量、半定量試劑感染性疾病的診斷妊娠、排卵的診斷腫瘤標(biāo)志心肌標(biāo)志濫用藥物固相微孔膜測定種類斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)（dotimmunogoldchromatographicassay,DICA）斑點(diǎn)ELISA(dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)

免疫印跡法(immunoblottingtest,IBT)

放射免疫沉淀試驗(yàn)(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)

常用的標(biāo)志物酶和有色微粒子彩色膠乳熒光素膠體金和膠體硒等其中以膠體金和熒光素最為常用膠體金免疫技術(shù)（免疫金標(biāo)記技術(shù)或金免疫技術(shù)）膠體金免疫技術(shù)（colloidalgoldimmunoassay）是以膠體金作為標(biāo)記物（示蹤劑或顯色劑），應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)的一種標(biāo)記免疫測定技術(shù)。1971年由Faulk和Taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術(shù)。目前得以廣泛應(yīng)用。膠體金免疫技術(shù)

金免疫測定技術(shù)：斑點(diǎn)免疫金滲濾試驗(yàn)斑點(diǎn)免疫金層析試驗(yàn)金免疫組織化學(xué)染色技術(shù)：

金免疫電鏡染色技術(shù)金（銀）免疫光鏡染色技術(shù)膠體金與免疫金的制備1.膠體金的特性及制備2.免疫金的制備膠體金與免疫金的制備1.膠體金的特性及制備膠體金的結(jié)構(gòu)膠體金特性膠體金的制備膠體金鑒定和保存注意事項(xiàng)膠體金的結(jié)構(gòu)膠體金（colloidalgold）也稱金溶膠（goldsolution），是由金鹽被還原成金原子后形成的金顆粒懸液。膠體金顆粒由一個(gè)基礎(chǔ)金核（原子金Au）及包圍在外的雙離子層構(gòu)成，緊連在金核表面的是內(nèi)層負(fù)離子（AuC12－），外層離子層H+則分散在膠體間溶液中金顆粒間靜電相互排斥而懸浮形成一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。膠體金顆粒的基礎(chǔ)金核并非是理想的圓球核，較小的膠體金顆?；臼菆A球形的，較大的膠體金顆粒（一般指大于30nm以上的）多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態(tài)。膠體金特性（1）膠體金一般性質(zhì)：膠體金顆粒大小多在1～100nm，微小金顆粒穩(wěn)定地、均勻地、呈單一分散狀態(tài)懸浮在液體中，成為膠體金溶液。膠體金因而具有膠體的多種特性，特別是對電解質(zhì)的敏感性。（2）呈色性和光吸收性：對同一種物質(zhì)的水溶膠金顆粒來說，粒子大小不同，顏色亦不同：膠體金顆粒在5～20nm之間，吸收波長520nm，呈葡萄酒紅色。膠體金顆粒20～40nm之間吸收波長530nm，液體為深紅色，60nm的金溶液主要吸收波長600nm，金溶液呈蘭紫色，若離心去掉較大的金顆粒，溶膠呈紅色。根據(jù)這一特點(diǎn)，用肉眼觀察膠體金的顏色或吸收峰波長大小可粗略估計(jì)金顆粒的大小。

呈色和光吸收性粒子大小不同，光吸收性不同，顏色亦不同：10～20nm，吸收峰530nm，呈橙色。20～80nm，吸收峰600nm，呈紫紅色。根據(jù)這一特點(diǎn)，可用肉眼觀察膠體金的顏色或吸收峰波長大小可粗略估計(jì)金顆粒的大小。穩(wěn)定性穩(wěn)定:顆粒做布朗運(yùn)動(dòng)不易受重力影響而下沉.又不穩(wěn)定:自身因素與外部因素.自身因素:相互碰撞而合并為較大顆粒而下沉。外部因素:電解質(zhì)、濃度、溫度、穩(wěn)定劑。膠體金的制備

制備原理向一定濃度的氯金酸溶液內(nèi)加入一定量的還原劑，使金離子變成金原子，形成金顆粒懸液。常用的還原劑：白磷、硼氫化鈉、抗壞血酸、檸檬酸鈉、鞣酸等。技術(shù)要點(diǎn)最常用的制備方法為檸檬酸三鈉還原法檸檬酸鹽還原法：①先配制HAuCl4水溶液，加熱至沸②攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入一定量的檸檬酸三鈉水溶液③繼續(xù)加熱煮沸一定時(shí)間。此時(shí)可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快便灰色，繼而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)成紅色④冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積

四種粒徑膠體金的制備及特性膠體金粒徑（nm）1％檸檬酸三鈉加入量（ml）*膠體金特性呈色λmax16.002.00橙色518nm24.501.50橙紅522nm41.001.00紅色525nm71.500.70紫色535nm鑒定和保存指標(biāo)：粒徑大小，均一度，有無凝集粗略：日光；分光光度計(jì)電鏡：統(tǒng)計(jì)膠體金的平均粒徑。良好的膠體金應(yīng)該是清亮透明的。若混濁或表面有漂浮物，提示有較多的凝集顆粒。膠體金（15~60nm）優(yōu)質(zhì)劣質(zhì)室溫、避光、無塵、潔凈器皿：3個(gè)月。

加入少許防腐劑（如0.02％NaN3）可有利于保存。4℃,半年。-20℃×盡快標(biāo)記

鑒定和保存注意事項(xiàng)（1）氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。（2）氯金酸對金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水溶液時(shí)，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。（3）用于制備膠體金的蒸餾水應(yīng)是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水。（4）用以制備膠體金的玻璃容器必須是絕對清潔的，用前應(yīng)先經(jīng)酸洗并用蒸餾水沖凈。最好是經(jīng)硅化處理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數(shù)分鐘，用蒸餾水沖凈后干燥備用。免疫金的制備概念：免疫金（immunogold）是指膠體金與Ag或Ab的結(jié)合物,有時(shí)稱之為金探針。原理：不明，物理吸附，靠靜電力相互吸引而牢固結(jié)合。不影響蛋白質(zhì)的生物活性。目前多認(rèn)為：當(dāng)溶液的pH值等于或略高于蛋白質(zhì)的PI時(shí)，蛋白質(zhì)分子的表面張力最大，易于吸附在金顆粒的表面。由于蛋白質(zhì)分子牢固地結(jié)合在金的表面，形成一個(gè)蛋白層，阻止了膠體金顆粒的相互接觸，從而使金溶膠處于穩(wěn)定狀態(tài)。技術(shù)要點(diǎn)(1)膠體金溶液的pH值調(diào)整：調(diào)節(jié)至PI或偏堿。(2)蛋白質(zhì)最適標(biāo)記量的確定：系列稀釋蛋白，加一定量膠體金，NaCl,以紅色保持不變而蛋白含量最低的一管為最適標(biāo)記量。(3)標(biāo)記過程；攪拌、加一定量穩(wěn)定劑（BSA/PEG）。(4)標(biāo)記物純化:超速離心法、

凝膠過濾法。

免疫金的保存免疫金復(fù)合物最終用稀釋液配制成工作濃度保存。稀釋液通、常是加入含穩(wěn)定劑的緩沖液。緩沖溶液常用中性的PBS或Tris緩沖液。PEG和BSA是最常用的穩(wěn)定劑。穩(wěn)定劑有兩大作用：①為保護(hù)膠體金的穩(wěn)定性，使之便于長期保存；②為防止或減少免疫金復(fù)合物的非特異性吸附反應(yīng)。膠體金免疫測定技術(shù)一、斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)(dotimmunogoldfiltrationassayDIGFA)二、斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)(dotimmunogoldchromatographicassayDICA)一、斑點(diǎn)金免疫滲濾測定法

（dotimmuno-goldfiltrationassay）雙抗體夾心法為例：將Ab點(diǎn)加在固相載體NC膜上(滲濾裝置）。當(dāng)?shù)渭釉谀ど系臉?biāo)本液體滲濾過膜時(shí)，標(biāo)本中含Ag被膜上Ab捕獲。其后加入的免疫金與已結(jié)合在膜上的Ag相結(jié)合。因膠體金本身呈紅色，陽性反應(yīng)即在膜中央顯示紅色斑點(diǎn)斑點(diǎn)金免疫滲濾試劑盒組成斑點(diǎn)金免疫滲濾試劑盒組成主要由滲濾裝置、膠體金標(biāo)記物、洗滌液、抗原參照品或抗體陽性對照品四部分組成。其中滲濾裝置是由塑料小盒、吸水墊料和已點(diǎn)加抗原或抗體的硝酸纖維素膜片三部分組成。試劑盒一般都設(shè)有質(zhì)控點(diǎn)，質(zhì)控點(diǎn)的大小或形狀都不同于檢測點(diǎn)，有的用大小點(diǎn)區(qū)分、有的用點(diǎn)橫線區(qū)分，有的用橫豎線區(qū)分

（二）方法類型1．雙抗體夾心法2．間接法DIGFA—雙抗體夾心法測抗原AB操作：加樣A；加金標(biāo)記物；洗滌B，觀察陽性陰性間接法測抗體陽性陰性固相膜固相抗原待測抗體金標(biāo)二抗人人IgG快速檢測（滲濾法）原理圖二、斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)

（dotimmunogoldchromatographicassay)

原理：滴加在膜一端的標(biāo)本受膜的毛細(xì)管作用向另一端移動(dòng)，猶如層析一般，被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的Ab或Ag結(jié)合，無關(guān)物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過膠體金的呈色條帶來判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。試紙條組成結(jié)構(gòu)測試線（T線）控制線（C線）膠體金墊吸水濾紙樣品墊NC膜（硝酸纖維素膜）層析方向PVC底板有4個(gè)組分：⑴、吸水紙（樣品墊）。⑵、玻璃纖維膜（膠體金墊）。膜上吸附著干燥的金標(biāo)抗體（流動(dòng)帶）。⑶、硝酸纖維素膜，膜上包被著抗原或抗體條帶和能與標(biāo)記物直接起反應(yīng)的質(zhì)控物條帶（檢測帶）。⑷、吸水紙。以上各組份首尾互相銜接。

斑點(diǎn)金免疫層析：以NC膜為載體，結(jié)合抗原抗體反應(yīng)、金標(biāo)技術(shù)與蛋白質(zhì)層析技術(shù)的快速固相膜免疫分析技術(shù)。DIGFA穿流（flowthrough）DICA橫流（lateralflow）(二)方法類型1.雙抗體夾心法2.競爭法/抑制法3.間接法1.雙抗體夾心法測抗原標(biāo)本Goldtestcontrol

結(jié)果觀察

陽性陰性無效Goldtestcontrol2.競爭法測抗原標(biāo)本陽性結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)抗原Goldtestcontrol標(biāo)本陰性結(jié)果2.競爭法測抗原Goldtestcontrol結(jié)果觀察

陽性陰性無效3.間接法測抗體待測血清標(biāo)本中含有大量的非特異性IgG，降低了試驗(yàn)敏感性.為消除其影響，間接法常設(shè)計(jì)成：反流免疫層析法。與特異性IgG競爭結(jié)合金標(biāo)抗人IgG，缺點(diǎn)：間接法(反流免疫層析)？？AGoldB觀察窗EFMarkerCTCT非特異性抗體待測抗體金標(biāo)抗體羊抗兔IgG膠體金免疫組化技術(shù)一、免疫金電鏡染色技術(shù)二、免疫金（銀）光鏡染色技術(shù)免疫金電鏡染色技術(shù)

金標(biāo)記物與待檢標(biāo)本的相應(yīng)蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合反應(yīng),由于膠體金顆粒具有高電子密度的特性。原理

電鏡下觀察，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處可見黑褐色顆粒，從而對細(xì)胞膜上或胞內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性與定位。原理：金標(biāo)記物與鎳網(wǎng)上待檢Ag/Ab發(fā)生結(jié)合反應(yīng)

結(jié)合的金標(biāo)蛋白黑褐色顆粒(電鏡下)膠體金顆粒的高電子密度的特性對細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)的Ag/Ab進(jìn)行定性與定位

原理

通過免疫反應(yīng)，沉積在抗原位置的膠體金顆粒起著一種催化劑作用，用還原劑將銀離子(Ag+)還原成銀原子(Ag)，被還原的Ag圍繞金顆粒形成一個(gè)“銀殼”，“銀殼”一旦形成本身亦具有催化作用，從而使更多銀離子還原并促使“銀殼”越長越大“，最終使抗原位置得到清楚放大。免疫金（銀）光鏡染色技術(shù)

原理：

免疫反應(yīng)膠體金顆粒(CG)沉積在Ag位置

CG催化，對苯二酚還原劑銀離子(Ag+)還原成

銀原子(Ag)

銀原子圍繞金顆粒形成一個(gè)“銀殼”

“銀殼”催化，還原更多銀離子“銀殼”越長越大,抗原位置得到清楚放大小結(jié)1

金免疫測定技術(shù)斑點(diǎn)金免疫滲濾試驗(yàn)：原理、技術(shù)類型、技術(shù)要點(diǎn)斑點(diǎn)金免疫層析試驗(yàn)：原理、技術(shù)類型、技術(shù)要點(diǎn)2金免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫金(銀)光鏡染色技術(shù)免疫金電鏡染色技術(shù)3臨床應(yīng)用及評價(jià)：優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)影響固相膜免疫試驗(yàn)的主要因素

影響因素：試劑試劑的選擇：注意試劑的注冊號、批號、有效期和檢驗(yàn)合格證等；不同批號的試劑不能混用；不能使用過期的試劑。試劑的準(zhǔn)備：試劑在開封前應(yīng)檢查是否漏液、漏氣；使用前要在室溫（18℃～25℃）下平衡20min～30min。影響固相膜免疫試驗(yàn)的主要因素

影響因素：標(biāo)本標(biāo)本處理：臨床檢測的標(biāo)本有痰液、尿液、糞便、棉拭子、血清和血漿等。檢測前，需進(jìn)行相應(yīng)的前處理，如痰液或糞便，需用緩沖液或生理鹽水稀釋后，低速離心，取上清進(jìn)行檢測。標(biāo)本保存：對于采集的標(biāo)本如不能立即檢測，需要保存在2℃～8℃，不超過24小時(shí)，超過24小時(shí)以上，需保存在-20℃以下，忌反復(fù)凍融。影響固相膜免疫試驗(yàn)的主要因素

影響因素：實(shí)驗(yàn)過程溫度及時(shí)間結(jié)果判定檢測前要平衡至室溫（18～25℃）后再開袋使用。無特殊說明，檢測的溫度為18～25℃，時(shí)間在3Omin以內(nèi)。一些膠體金診斷試劑條只用于初步診斷，確診需采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。試劑條平衡

層析法技術(shù)優(yōu)勢:簡單\現(xiàn)場\快速1.打開包裝取出試紙條2.直接插入待測樣品中3.目測讀出結(jié)果（3-10分鐘內(nèi)）

與常規(guī)診斷方法相比

優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)快速：全部檢測過程僅需3-10分鐘。簡便：不需其它任何儀器設(shè)備，操作也極其簡單，無需專業(yè)人員，攜帶方便，可隨時(shí)隨地進(jìn)行。廉價(jià)：單個(gè)測試條成本極低

可單份檢測：對標(biāo)本既能成批檢測，又可單份檢測，可立刻拿到結(jié)果，不必等待。

穩(wěn)定性好：金標(biāo)試劑穩(wěn)定，可長期保存。

檢測標(biāo)本種類多：既可用于查血，又可用于檢尿或唾液，因而適合各種檢查定量問題靈敏度問題臨床應(yīng)用及評價(jià)1.免疫金技術(shù)具有操作簡便、快捷以及操作人員不需技術(shù)培訓(xùn)，無需特殊儀器設(shè)備，試劑穩(wěn)定，便于保存等特點(diǎn)，因此特別符合“床邊檢驗(yàn)”

(pointofcaretest,POCT)項(xiàng)目要求。2.本法靈敏度不及酶標(biāo)法和酶發(fā)光免疫測定法，在臨床應(yīng)用中應(yīng)引起高度重視。3.該技術(shù)不能準(zhǔn)確定量，只能作為定性或半定量試驗(yàn)，目前主要應(yīng)用于正常體液中不存在的物質(zhì)（如傳染病抗原和抗體以及毒品類藥物等）和正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)（如HCG等）的檢測。

技術(shù)應(yīng)用類別應(yīng)用領(lǐng)域檢測的物質(zhì)人類醫(yī)學(xué)各級醫(yī)院,血站,CDC,防疫站,診斷中心；家庭自檢；商檢系統(tǒng)；邊檢口岸；公安系統(tǒng).傳染病（乙肝五項(xiàng),HIV,SARS等）標(biāo)志物（AFP、肌鈣蛋白、糞便血紅蛋白等）女性妊娠（hCG(早孕),LH,FSH)毒品（嗎啡,K粉,搖頭丸,冰毒）農(nóng)牧業(yè)畜牧獸醫(yī)站,商檢系統(tǒng),邊檢口岸,農(nóng)牧類院系和研究所傳染病（禽流感,獸瘟疫等）環(huán)境環(huán)保監(jiān)測部門,研究機(jī)構(gòu)有害物質(zhì)超標(biāo)食品安全食品安全檢測中心,各監(jiān)管部門農(nóng)獸藥殘留（磺胺類、瘦肉精等）,大腸桿菌,黃曲霉素快速檢測流程結(jié)果判定OraQuickPositiveNegativeReactiveControlPositiveHIV-1/2Readresultsin20–40minutes不同廠家的試劑操作要求廠家樣品要求血量(ul)樣品稀釋是否加緩沖液最小反應(yīng)時(shí)間(分鐘)最大反應(yīng)時(shí)間(分鐘)試劑儲存要求明膠顆粒法(PA)血清/血漿251:32N120/2-10℃DETERMINE血清/血漿/全血50N用全血時(shí)加1滴15602-30℃SD血清10NN5201-30℃,不能置冰箱保存杭州艾康血清/血漿/全血25NY10202-30℃,勿凍存上海科華血清/血漿40NY/304-30℃廈門新創(chuàng)血清/血漿/全血60NY1304-30℃廣州萬孚血清/血漿/全血80-100N用全血時(shí)加2滴10304-30℃,勿凍存北京萬泰血清/血漿80N用全血時(shí)加1滴/30室溫儲存，可置2-8℃檢測質(zhì)控

檢測前要求實(shí)驗(yàn)室人員要熟讀試劑說明書，嚴(yán)格按照說明書要求操作執(zhí)行。一般彝族老鄉(xiāng)只接受采集指尖血，不愿意采集靜脈血，所以在使用試劑時(shí)要注意，有些試劑只能查血清和血漿，檢測時(shí)就不能用全血（如中新科技、SD）。加入樣品一定要嚴(yán)格按照說明書加樣，如：科華加40ul,新創(chuàng)加50ul,雅培加50ul,萬泰80ul,SD10UI,中新科技70-100UI,艾康50UI.萬浮80UI.加入的樣本量不符合要求，會嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定。實(shí)驗(yàn)條件質(zhì)控

實(shí)驗(yàn)條板反應(yīng)時(shí)間，一定要在15-30分鐘內(nèi)觀察結(jié)果，在督導(dǎo)過程中曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)，個(gè)別檢測點(diǎn)人員沒有手表，時(shí)間靠估計(jì)，在不到15分鐘就判讀結(jié)果，影響結(jié)果的正確判斷。為此，我們已經(jīng)向涼山州艾滋病防治局提出申請，每個(gè)檢測點(diǎn)配置一個(gè)定時(shí)鐘。實(shí)驗(yàn)溫度控制

涼山州屬于高寒山區(qū)，冬天部份地區(qū)氣溫都在-0℃以下，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，目前，在沒有條件的情況下，檢測點(diǎn)依靠電爐將室溫升高。但是，這不能從根本上解決問題，我們已經(jīng)向州艾滋病防治局提出申請，每個(gè)檢測點(diǎn)配置一臺小型桓溫孵箱。斑點(diǎn)酶免疫吸附試驗(yàn)——Dot-ELISA

實(shí)驗(yàn)原理與常規(guī)的ELISA相同，不同之處在于Dot-ELISA所用載體為NC膜。其原理為樣品中的抗體或抗原與預(yù)先包被在NC膜上的抗原或抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，然后再加入相應(yīng)的酶標(biāo)二抗進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，通過酶催化底物，形成有色的沉淀物，產(chǎn)生顯色反應(yīng)，根據(jù)染色條帶或斑點(diǎn)的有無或深淺，對抗體或抗原進(jìn)行檢測。陽性者即可在膜上出現(xiàn)肉眼可見的染色條帶或斑點(diǎn)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)免疫印跡試驗(yàn)（immunoblottest，IBT）又稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡法（enzyme

lingkedimmunoelectrotransferblot，EIBT），通常又稱Westernblot，是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)，具有分析容量大、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是檢測蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用的方法。免疫印跡實(shí)驗(yàn)蛋白免疫印跡試驗(yàn)

重組免疫印跡試驗(yàn)（recombinantimmunoblotassay，RIBA）利用基因重組的方法，將各種抗原表達(dá)、純化后（也可直接合成抗原多肽）以橫線條的形式吸附或包被在NC膜條上，用于疾病的診斷和檢測。特異性較ELISA高，敏感性稍差。臨床常用于病原體的確認(rèn)試驗(yàn)和含復(fù)雜抗原成分的病原體抗體的分析。發(fā)展歷程印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法Towbin,H.,etal.(1979).Electrophoretictransferofproteinsfrompolyacrylamidegelstonitrocellulosesheets:procedureandsomeapplications.Proc.Natl.Acad.Sci.USA76,4350-4354.

Westernblot原理蛋白質(zhì)(病毒、細(xì)菌蛋白)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS），根據(jù)相對分子量的大小分成區(qū)帶，然后通過轉(zhuǎn)移電泳將SDS上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維濾膜上加上相應(yīng)的標(biāo)記抗體（如酶標(biāo)抗體、膠體金標(biāo)記抗體、熒光抗體、放射性同位素標(biāo)記抗體），也可先加抗體反應(yīng)，再加標(biāo)記的抗抗體，通過對抗體的標(biāo)記物的檢測，以分析特異性抗原蛋白區(qū)帶。為什么要作蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)？

研究一些體外的蛋白質(zhì)分子，尋找目的蛋白是否存在樣品當(dāng)中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，在不同的樣品中，如疾病和正常的樣品之間的表達(dá)差異性。免疫印跡法—Westernblot法原理Westernblot——抗原表位可能被破壞而漏檢

Westernblot基本步驟（一）SDS（目的蛋白的分離）1、收集蛋白樣品裂解液裂解細(xì)胞、或組織樣品，通過有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白水溶液提取法針對水、稀鹽、稀酸或堿溶液中的蛋白質(zhì)。稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑。有機(jī)溶劑提取法對于分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)可用有機(jī)溶劑提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。2、蛋白質(zhì)濃度測定目前常用比色法測定樣品蛋白的含量3、電泳4、電泳結(jié)果檢查

StakinggelSeparatinggelWesternblot

（二）電轉(zhuǎn)移（或轉(zhuǎn)印、轉(zhuǎn)膜）轉(zhuǎn)印就是將蛋白質(zhì)由SDS凝膠上轉(zhuǎn)移到固相支持物上。首選的固相支撐物是硝酸纖維濾膜（NC膜）通常有兩種方法：毛細(xì)管印跡法和電泳印跡法。常用的電泳轉(zhuǎn)移方法有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機(jī)械裝置不同。原料是基礎(chǔ)--膜選擇種類NCPVDF尼龍膜選擇標(biāo)準(zhǔn)a.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。?；b.不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；c.后繼實(shí)驗(yàn)有其他要求，比如要做蛋白測序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜膜的特點(diǎn)Westernblotting（三）（酶）免疫定位1.膜的封閉為防止NC膜的非特異性背景著色，用封閉液對NC膜進(jìn)行封閉。常用的封閉液為加有脫脂奶粉、小牛血清或牛血清白蛋白的緩沖液。2.靶蛋白與特異性抗體（一抗）反應(yīng)

將可識別靶蛋白的McAb或PcAb與NC膜一同溫育。3.靶蛋白與標(biāo)記的二抗反應(yīng)

待上步反應(yīng)結(jié)束后，洗滌NC膜，使之與標(biāo)記的二抗反應(yīng)，二抗可用放射性同位素、酶、生物素、膠體金等標(biāo)記。4.指示反應(yīng)

根據(jù)標(biāo)記物的不同，可采用放射自顯影、底物顯色等，在NC膜上顯示相應(yīng)的檢測蛋白帶Westernblot

Westernblot中應(yīng)該注意的問題（一）首先應(yīng)該確定檢測蛋白經(jīng)SDS和還原劑處理后，其抗原決定簇仍然可與相應(yīng)的抗體結(jié)合。特別是在用單克隆抗體作為第1抗體時(shí)應(yīng)考慮這一點(diǎn)。（二）要保證檢測所用抗體的特異性，尤其是一抗的特異性更為重要。另外，對一抗和標(biāo)記體的使用濃度，通常要根據(jù)實(shí)際情況作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。（三）實(shí)驗(yàn)操作過程中，拿取凝膠、濾紙和NC膜的時(shí)候，必須戴手套，因?yàn)槠つw上的油脂和分泌物會阻止蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到濾膜上。Westernblot

（四）轉(zhuǎn)印時(shí)要注意電流的大小，過高的電流產(chǎn)生的熱量會在凝膠和NC膜之間形成氣泡，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)印的失敗。有報(bào)道，在轉(zhuǎn)印緩沖液中加入20%的甲醇，雖然降低蛋白質(zhì)的洗脫效率，但可以提高其與硝酸纖維素結(jié)合的能力?；蛘呖梢栽诰彌_液中加入終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS,也可以提高轉(zhuǎn)印效率。WesternBlot優(yōu)點(diǎn)

高分辨率的電泳技術(shù)特異敏感的抗原-抗體反應(yīng)

1-5ng中等大小的靶蛋白Westernblot

方法學(xué)評價(jià)：1.抗體的性質(zhì)2.IBT的靈敏度3.IBT法在臨床應(yīng)用中的局限性

Westernblot

應(yīng)用免疫印跡技術(shù)是蛋白質(zhì)組分分析和蛋白多肽相對分子質(zhì)量分析的主要方法，已廣泛用于病毒蛋白和基因表達(dá)重組蛋白多肽的分析，是基因工中不可缺少的方法之一梅毒螺旋體抗體免疫印跡試驗(yàn)（IgG）不同分子量的梅毒螺旋體抗原經(jīng)電泳分開，電轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素