農(nóng)用基質(zhì)中蕓薹根腫病菌檢測技術(shù)規(guī)程

1DB××××-××××農(nóng)用基質(zhì)中蕓薹根腫病菌檢測技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了上海地區(qū)農(nóng)用基質(zhì)中蕓薹根腫病菌檢測技術(shù)方法及流程。本文件適用于上海地區(qū)農(nóng)用基質(zhì)中攜帶蕓薹根腫病菌的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法NY/T2118蔬菜育苗基質(zhì)。NY525有機肥料3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文本。3.1基質(zhì)（substrate）基質(zhì)的定義參照NY/T2118，能夠代替土壤，為栽培作物提供適宜養(yǎng)分和pH，具備良好的保水、保肥、通氣性能和根系固著力的混合輕質(zhì)材料，組分包括草炭、蛭石、珍珠巖、木屑、作物秸稈、畜禽糞便、樹皮和菌渣等。3.2根腫病(clubroot)由蕓苔根腫菌引致的十字花科（Cruciferae）植物病害，植株受害后在根部形成大小不一、光滑或龜裂粗糙的腫瘤，而植株的地上部份生長遲緩、缺水蔫萎，嚴重時植株死亡。根腫病可以通過帶菌基質(zhì)、土壤、種苗、水流、農(nóng)事操作等方式傳播，病菌在土中可存活10年以上。蕓薹根腫菌為專性寄生菌，不能人工培養(yǎng)，病菌的檢測主要是采用PCR的分子檢測。4原理4.1分類地位蕓薹根腫菌（PlasmodiophorabrassicaeWoronin蕓薹根腫菌屬于原生動物界（Protozoa根腫菌門（Cercozoa植物寄生黏菌綱（Phytomyxea根腫菌屬4.2巢式PCR巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內(nèi)部），結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴增片段短2于第一次擴增。由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴增，從而降低了擴增多個靶位點的可能性（因為與兩套引物都互補的引物很少），增加了檢測的敏感性；又有兩對PCR引物與檢測模板的配對，增加了檢測的可靠性。由于第二套引物位于第一輪PCR產(chǎn)物內(nèi)部，而非目的片斷包含兩套引物結(jié)合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴增非目的片斷。因遇到農(nóng)用基質(zhì)中攜帶根腫病菌含量比較低的情況，故本規(guī)程規(guī)定采用巢式PCR擴增的檢測方法。5儀器和試劑5.1主要儀器5.1.1恒溫鼓風(fēng)干燥箱：滿足168℃消毒2小時的功能。5.1.2高壓濕熱滅菌鍋：滿足121℃飽和壓力蒸汽消毒15min~30min的功能。5.1.3研缽：陶瓷材質(zhì)，口徑60mm~100mm之間。5.1.4水浴鍋或干浴鍋：50℃-80℃恒溫功能。5.1.5高速冷凍離心機：離心轉(zhuǎn)速10000g以上。5.1.6PCR儀：常規(guī)PCR擴增功能。5.1.7旋渦振蕩器：具有點振和連續(xù)振蕩功能。適配1.5mL、2.0mL等規(guī)格離心管。5.1.8凝膠成像儀：常規(guī)的PCR擴增產(chǎn)物電泳拍照與記錄功能。5.1.9微量移液器：規(guī)格0.1μL~2.5μL，2μL~20μL，20μL~200μL，100μL~1000μL。5.1.10電子天平：精度0.001g以上。5.2主要試劑5.2.1除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑，實驗用水應(yīng)符合GB/T6682中二級水規(guī)格以上的雙蒸水或超純水。5.2.2DNA提取試劑盒：選擇質(zhì)量穩(wěn)定的商用產(chǎn)品，試劑盒提取總DNA質(zhì)量要達到或優(yōu)于附錄B1圖示提取總DNA質(zhì)量。5.2.3PCR擴增相關(guān)試劑，無水乙醇等常規(guī)試劑。6檢測與鑒定6.1采樣樣品抽樣和縮分方法按照NY525規(guī)定執(zhí)行。抽取樣品于-20℃或-80℃（更佳）保存?zhèn)?.2樣品制備每個樣品取2份實施平行檢測。樣品研磨和總DNA提取見附錄B.1。6.3巢式PCR檢測采用巢式PCR方法進行病菌檢測，具體操作見附錄B.2。7結(jié)果判定7.1外圈引物對的PCR擴增結(jié)果待檢測樣品為陽性，判定樣品檢出蕓薹根腫病菌。7.2外圈引物對的PCR擴增結(jié)果待檢測樣品為陰性，第一輪PCR檢測結(jié)果無法判斷，應(yīng)實施巢式PCR內(nèi)圈引物對的第二輪PCR擴增后再作判斷。7.3巢式PCR內(nèi)圈引物對PCR擴增結(jié)果待測樣品為陽性，判定樣品檢出蕓薹根腫病菌。3DB××××-××××7.4巢式PCR內(nèi)圈引物對PCR擴增結(jié)果待測樣品為陰性，判定樣品未檢出蕓薹根腫病菌。7.5二個平行檢測中只要有一個檢測出蕓薹根腫病菌，判定該批次基質(zhì)檢出蕓薹根腫病菌。8樣品留存與處理檢出蕓薹根腫病菌的基質(zhì)樣本應(yīng)至少保存6個月，同時留樣樣品于-20℃或-80℃（更佳）保存，以備復(fù)驗。保存期滿，需經(jīng)滅活后再處理。9結(jié)果記錄與資料保存完整試驗記錄和檢測報告包括樣品的來源、種類、時間，實驗的時間、地點、方法和結(jié)果，PCR凝膠電泳加檢測應(yīng)有電泳結(jié)果照片等，并要有試驗人員和審核人員簽字。妥善保管好實驗的原始記錄。4附錄A（資料性）蕓薹根腫病菌的基本信息A.1寄主范圍油菜根腫病是由專性寄生菌蕓苔根腫菌（PlasmodiophorabrassicaeWoronin.）引起的一種重要的土傳病害。蕓薹根腫病菌的寄主范圍很廣，可以侵染油菜、甘藍、蘿卜、芥菜、菜等100多種十字花科植物。A.2危害癥狀受害寄主植株感病初期地上部無明顯差異或特殊的表現(xiàn)，而在感病后期，地上部葉片由下而上逐漸發(fā)黃，出現(xiàn)持續(xù)性失水萎蔫（圖A.1）。相較于正常植株，感病株生長緩慢，株型矮小，地下部主根、側(cè)根和須根上形成數(shù)目和大小不等、呈指狀、短棒狀或球形的腫瘤（圖A.2），根腫發(fā)生初期表面光滑，后期則會出現(xiàn)龜裂、粗糙、變黃，最后整個受害根部組織出現(xiàn)腐爛，滋生各種真菌，形成白色的菌絲層或滋生多種害蟲，地上部植株枯萎死亡。A.3分布地區(qū)世界上廣為分布，在歐洲、北美、東亞等地區(qū)已成為十字花科植物上的主要病害。A.4傳播途徑蕓薹根腫病菌休眠孢子在土壤中的存活能力強，存在于土壤中15~20年仍能萌發(fā)，并且具備致病能力，同時病根腐爛后，其內(nèi)大量的休眠孢子又隨病殘體落在土壤或堆肥中，進行再侵染或休眠，根腫菌傳染性強，具低濃度致病閾值、傳播速度快。A.5病原菌形態(tài)根腫菌休眠孢子感知寄主刺激后釋放出具雙鞭毛的初級游動孢子并侵染根毛，在根毛中形成初生原質(zhì)團，初生原質(zhì)團隨后分裂形成次級游動孢子囊，從中釋放出的次級游動孢子；次級游動孢子直接侵染皮層細胞，在其中形成次生原質(zhì)團；最后次生原質(zhì)團分裂形成成熟的休眠孢子散落在土壤中，成為來年的初侵染源。休眠孢子游離分散在寄主細胞內(nèi)，不聯(lián)合形成休眠孢子堆。A.6基因組基因組從頭測序，最終通過序列拼接和組裝得到165個scaffold，組成的基因組序列大小為24M，其中scaffold序列的N50大小為473kb?；蚪MGC含量為50%。5DB××××-××××圖A.1十字花科蔬菜根腫病田間植株萎蔫癥狀圖A.2十字花科蔬菜根腫病田間植株根部腫大畸形癥狀6（規(guī)范性）巢式PCR檢測方法B.1樣品總DNA提取B.1.1樣品研磨每份樣品取3g到研缽中，加液氮后，用人工研磨方法充分研磨。B.1.2樣品總DNA提取使用試劑盒PowerSoilDNAIsolationKit試劑盒（QIAGENGmbH，已更名為DNeasyPowerSoilKit按照說明書操作。a）稱取0.25g研磨好的基質(zhì)樣品（剩余樣品粉末可裝管后放置-20℃或-80℃（更佳加入到PowerBeadTube中輕輕的渦旋混勻；b）再加入60μLSolutionC1，上下顛倒數(shù)次混勻（SolutionC1需預(yù)先在60℃水浴加熱去除沉淀把PowerBeadTube固定在渦旋儀適配器上最大轉(zhuǎn)速渦旋連續(xù)振蕩10min；c）然后10000g離心30s，吸取上清液至一個新的2mLCollectionTube（收集管）中，d）避開沉淀，吸取最多不超過600μL上清液到一個新的2mLCollectionTube中，加入200μLSolutionC3到上清液中，短暫渦旋混勻，4℃孵育5min。然后室溫10000g離心e）避開沉淀，吸取最多不超過750μL上清液到一個新的2mLCollectionTube中，加入1200μLSolutionC4（SolutionC4使用前要混勻）到上清液中（注意溶液不能滿過試管口渦旋混勻5s。吸取675μL上清液加入到SpinFilter中，室溫10000g離心1min。棄濾液，繼續(xù)加入675μL上清液，室溫10000g離心1min，重復(fù)此過程至過濾完所有上清液；f）再加入500μLSolutionC5到SpinFilter中，室溫10000g離心30s，棄上清液。室溫10000g離心1min；g）小心轉(zhuǎn)移SpinFilter到一個新的2mLCollectionTube中，盡量避免SolutionC5污染，最后加入100μLSolutionC6到白色濾膜中心，室溫10000g離心30s，棄SpinFilter，得到的DNA于-20℃保存，備用。B.1.3瓊脂糖凝膠電泳檢測B.1.3.1制備凝膠用1×TAE配制1.5%瓊脂糖凝膠，加熱溶化后冷卻至55℃左右。B.1.3.2加核酸染料將核酸染料（GELVIEW）加入到配制好的凝膠中，GELVIEW終濃度為0.1μL/mL。將凝膠倒入凝膠槽中，插上樣品梳子。冷卻凝固后拔掉梳子，在電泳槽內(nèi)加入1×TAE，緩沖液要沒過凝膠表面約1mm。B.1.3.3加樣將加樣緩沖液與樣品混合后加入樣品孔，同時設(shè)置PCR的陰性對照、陽性對照和DNA7DB××××-××××分子量標記（Marker）。B.1.3.4電泳接通電源，以3-5伏/厘米（V/CM）電場強度進行電泳，0.5h后觀察結(jié)果。B.1.4.5結(jié)果觀察電泳結(jié)束后，將整個凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察，記錄結(jié)果。B.1.4結(jié)果判定樣品出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶（圖B.1應(yīng)判定提取到樣品DNA。·圖B.1基質(zhì)樣品總DNA提取電泳圖·泳道1：Marker；泳道2：基質(zhì)；泳道3：基質(zhì)B.2巢式PCR擴增B.2.1引物序列a)外圈引物對：PbITS-1:5’ACTTGCATCGATTACGTCCC3’;PbITS-2:5’GGCATTCTCGAGGGTATCAA3’。b)內(nèi)圈引物對：PbITS-6:5’CAACGAGTCAGCTTGAATGC3’;PbITS-7:5’TGTTTCGGCTAGGATGGTTC3’。B.2.2擴增體系及條件a)第一輪PCR擴增（外圈反應(yīng)體系20μL，其中包括1μL待測樣品DNA，10μL2×PCRMix，1μL引物PbITS-1（10μmol·L-11μL引物PbITS-2（10μmol·L-17μL雙蒸水。PCR擴增反應(yīng)條件為：95℃5min，1個循環(huán)；95℃60s，60℃60s，72℃90s，共35循環(huán)；72℃10min，1個循環(huán)。b)第二輪PCR擴增（內(nèi)圈反應(yīng)體系20μL，其中包括1μL第一輪擴增產(chǎn)物（如產(chǎn)物條帶明顯，需要進行稀釋，一般在100-10000倍10μL2×PCRMix，1μL引物PbITS-6（10μmol·L-11μLPbITS-7（10μmol·L-17μL雙蒸水。PCR擴增反應(yīng)條件為：95℃5min，1個循環(huán)；95℃30s，54℃30s，72℃45s，共35個循環(huán)；72℃10min，1個循環(huán)。C)PCR擴增用含有蕓薹根腫病菌的DNA作為模板陽性對照，用雙蒸水作為空白陰性對照。B.2.3瓊脂糖凝膠電泳檢測參照附錄B.1.3。8B.2.4擴增產(chǎn)物序列測定對擴增產(chǎn)物委托第三方公司進行DNA序列的測定。B.2.5結(jié)果判定B.2.5.1外圈引物對的PCR擴增結(jié)果中待檢測樣品和陽性對照在1087bp處出現(xiàn)擴增條帶，陰性對照無擴增條帶（圖B.2且測序后得到的DNA序列經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對為蕓薹根腫病菌，判定結(jié)果為陽性。B.2.5.2外圈引物對的PCR擴增結(jié)果中陽性對照在1087bp處出現(xiàn)擴增條帶，待檢測樣品和陰性對照無擴增條帶，結(jié)果無法判斷，應(yīng)實施內(nèi)圈引物對的第二輪PCR擴增后再作判斷。B.2.5.3內(nèi)圈引物對PCR擴增結(jié)果中待測樣品和陽性對照在506bp處出現(xiàn)擴增條帶，陰性對照無擴增條帶（圖B.3且測序后得到的DNA序列經(jīng)數(shù)據(jù)庫比對為蕓薹根腫病菌，判定結(jié)果為陽性。B.2.5.4內(nèi)圈引物對PCR擴增結(jié)果中陽性對照在506bp處出現(xiàn)擴增條帶，待測樣品和陰性對照無擴增條帶，判定結(jié)果為陰性。圖B.2農(nóng)用基質(zhì)樣品中蕓薹根腫病菌巢式