蘋果樹腐爛病抗病性鑒定技術(shù)規(guī)范

1蘋果樹腐爛病抗性鑒定技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了蘋果樹腐爛病抗病性鑒定的術(shù)語(yǔ)和定義、接種體制備、鑒定條件和設(shè)計(jì)、鑒定接種、病情調(diào)查、抗性結(jié)果、鑒定結(jié)果、檔案記錄。本文件適用于蘋果生產(chǎn)過(guò)程中腐爛病的抗病性鑒定。2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1接種體用于接種以引起病害的任何病原物或病原物的一部分。3.2接種懸浮液用于接種的含有定量接種體的液體。3.3接種室指在無(wú)菌的環(huán)境下進(jìn)行病原菌種擴(kuò)繁、轉(zhuǎn)接、接種的房間。4接種體制備4.1病原菌分離從病斑邊緣病健交界處剪取0.5cmx0.5cm大小的病組織，用75%乙醇消毒90s，然后用無(wú)菌水沖洗3次，用滅菌濾紙將水吸干，置于PDA培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4℃下保存?zhèn)溆?。蘋果腐爛病菌的學(xué)名、形態(tài)特征和分子生物學(xué)特征見(jiàn)附錄A。4.2接種體繁殖將保存的病原菌在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)10d～15d，待菌落表面形成分生孢子器。其中，PDA培養(yǎng)基配方為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。4.3接種體懸浮液制備2用滅菌移植針挑取菌落表面形成的分生孢子器并破碎收集分生孢子，將分生孢子并用無(wú)菌水稀釋配制成濃度約為1×106個(gè)孢子/mL的接種體懸浮液。5鑒定條件和設(shè)計(jì)5.1接種室接種室為可人工調(diào)節(jié)濕度、溫度和光照等條件，具體室溫為25℃、光周期12h光照/12h黑暗、相對(duì)濕度35%～40%。5.2鑒定設(shè)計(jì)鑒定材料隨機(jī)排列，每份鑒定材料重復(fù)3次，每重不低于10個(gè)枝條，以紅富士健康樹枝條接種腐爛病菌為對(duì)照。5.3鑒定材料田間采集用于抗性鑒定蘋果品種的健康、長(zhǎng)勢(shì)一致、無(wú)側(cè)枝2年生枝條，截取長(zhǎng)度為150cm并兩端蠟封。用自來(lái)水沖洗2次，75%酒精沖洗1次，無(wú)菌水沖洗1次，自然風(fēng)干備用。6鑒定接種采用燙傷法接種，用直徑5mm的釘帽在在備用鑒定材料上燙傷5個(gè)傷口，傷口間距25cm。每個(gè)傷口接種10μL接種懸浮液，完成后用保鮮膜包扎燙傷部位，接種4個(gè)傷口，1個(gè)傷口為對(duì)照。將完成接種的枝條扦插在裝有細(xì)沙的花盆中，置于鑒定室培養(yǎng)。7病情調(diào)查7.1調(diào)查時(shí)間與方法接種后5d調(diào)查發(fā)病情況，用刀片刮除枝條接種點(diǎn)周圍樹皮，測(cè)量病斑長(zhǎng)度。接種蘋果腐爛病菌的發(fā)病癥狀描述見(jiàn)附錄A。7.2病情級(jí)別蘋果離體枝條腐爛病病情級(jí)別見(jiàn)表1。表1蘋果離體枝條腐爛病病情級(jí)別0135797.3病情指數(shù)計(jì)算3病情指數(shù)（DI）按式（1）計(jì)算。Σ(各病情級(jí)別數(shù)值×各病情級(jí)別的病斑數(shù))調(diào)查的總病斑數(shù)×病情級(jí)別的最高數(shù)值Σ(各病情級(jí)別數(shù)值×各病情級(jí)別的病斑數(shù))調(diào)查的總病斑數(shù)×病情級(jí)別的最高數(shù)值8抗性結(jié)果依據(jù)病情指數(shù)(DI)的平均值確定不同品種對(duì)腐爛病的抗性水平，抗性結(jié)果見(jiàn)表2。表2蘋果樹腐爛病抗性結(jié)果病情指數(shù)（DI）注：對(duì)照感病品種的病情指數(shù)DI＞70作為9鑒定結(jié)果鑒定結(jié)果原始記錄表見(jiàn)附錄B，鑒定結(jié)果報(bào)告單按附錄C執(zhí)行。10檔案記錄將鑒定品種、接種方法、接種日期、調(diào)查日期、操作員等內(nèi)容填表記錄，歸檔并保存2年?？共⌒澡b定檔案記錄表見(jiàn)附錄D。4蘋果樹腐爛病病原菌A.1學(xué)名和形態(tài)描述A.1.1學(xué)名蘋果樹腐爛病病原學(xué)名為蘋果殼囊孢（CytosporamaliGrove）、屬子囊菌門（Ascomycota）、糞Ehrenb.）。A.1.2形態(tài)描述蘋果殼囊孢（CytosporamaliGrove）在PDA菌落白色至黃褐色、平展、邊緣呈放射狀，中央可產(chǎn)生乳白色分生孢子器。分生孢子器扁瓶形，直徑為480μm～1600μm。分生孢子單孢、香蕉形、兩端圓、微彎曲，大?。?.6μm～6μm）×（0.8μm～1.7μm）。（a）蘋果殼囊孢在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖A.1蘋果殼囊孢的形態(tài)特征A.2分子生物學(xué)特征將待提DNA的蘋果殼囊孢接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃下，光暗交替培養(yǎng)5d，后用滅菌牙簽刮取培養(yǎng)基表面菌絲，收集到滅菌的1.5mL離心管中，采用CTAB法提取菌株基因組DNA。以上述基因組DNA為模板，分別以引物對(duì)ITS1/ITS4、Bt2a/Bt2b和EF1-728F/EF1-986R（序列見(jiàn)表A1）擴(kuò)增ITS、β-tubulin和EF1-α基因。ITS引物對(duì)ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），β-tubulin引物對(duì)Bt2a（5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’）和Bt2b（5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’）EF1-α引物對(duì)EF1-728F（5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’）和EF1-986R（5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’）。PCR反應(yīng)總體系為25μl，各組分如下：10×PCRreactionbuffer2.5μl，10mMdNTP0.5μL，正反引物（濃度為10mM）各0.5μl，1UExTaqDNA聚合酶（TaKaRa，Japan）0.25μL，模板DNA10-20ng，用ddH2O補(bǔ)至25μl。ITS和β-tubulin基因PCR的反應(yīng)條件一致，為94℃2min預(yù)變性；94℃變性60s，退火58℃60s，72℃90s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。EF1-α的擴(kuò)增條件為95℃3min5預(yù)變性；95℃變性30s，退火55℃30s，72℃60s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用濃度為0.8%的瓊脂糖凝膠電泳并用凝膠成像儀觀察，切膠回收目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物，片段連入PMD18-T載體，進(jìn)行序列測(cè)定，獲得序列后中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。A.3發(fā)病癥狀描述接種蘋果殼囊孢后5d后，接種處呈現(xiàn)褐色壞死病斑、病健交界明顯、斑易剝離、內(nèi)部紅褐色、酒糟氣味，部分品種在接種處出現(xiàn)分生孢子器和分生孢子角。蘋果品種抗腐爛病鑒定結(jié)果記錄蘋果品種抗腐爛病鑒定結(jié)果記錄表見(jiàn)表B.1。表B.1蘋果品種抗腐爛病鑒定結(jié)果記錄表（DI）013579）：