第六章分子生物學研究方法(上)-基因功能研究技術(shù)-

南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院分子生物學2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2第六章分子生物學研究法（下）——基因功能研究技術(shù)2024/12/42南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院3第六章分子生物學研究法（下）2024/12/43南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 從20世紀中葉開始,分子生物學研究得到高速發(fā)展,主要原因之一是研究方法,特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進步。 基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點突變和PCR擴增等,是分子生物學研究的核心技術(shù)。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院4第六章分子生物學研究法（下）內(nèi)容:基因表達研究技術(shù)基因敲除技術(shù)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)基因芯片及數(shù)據(jù)分析其他分子生物學技術(shù)2024/12/44南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院5第一節(jié)基因表達研究技術(shù)1.基因表達系列分析技術(shù)（SAGE）SAGE是以DNA序列測定為基礎(chǔ)分析全基因組表達模式的技術(shù)。任何長度超過9-10個堿基的核苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,因此,根據(jù)某個序列占總標簽數(shù)的比例可分析所對應基因的表達頻率。LongSAGE技術(shù)。標簽來自轉(zhuǎn)錄物3’端一段21bp的序列,可以進行快速分析并與基因組序列數(shù)據(jù)相匹配。其原理與ShortSAGE方法類似,只是用了不同的IIS類標簽酶（MmeI）,并將程序做了相應修改。2024/12/45南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院6常規(guī)SAGE方法（shortSAGE）基本流程2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院7第一節(jié)基因表達研究技術(shù)2RNA的選擇性剪接技術(shù)RNA的選擇性剪接是指用不同的剪接方式從一個mRNA前體產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過程?？煞譃?平衡剪切、5’選擇性剪切、3’選擇性剪切、外顯子遺漏型剪切及相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某個基因是否存在選擇性剪切。2024/12/47南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院果蠅Dscam基因可以通過可變剪接產(chǎn)生38000多種可能的mRNA異構(gòu)體2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院8選擇性剪切的不同類型RT-PCR檢測5個擬南芥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因的選擇性剪切2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院9第一節(jié)基因表達研究技術(shù)3.原位雜交技術(shù)原位雜交（ISH）是用標記的核酸探針,經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系,在組織、細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段,分為RNA和染色體原位雜交兩大類。RNA原位雜交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）標記的特異性探針與被固定的組織切片反應,若細胞中存在與探針互補的mRNA分子,兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA,可通過放射性標記或經(jīng)酶促免疫顯色,對該基因的表達產(chǎn)物做出定性定量分析。2024/12/49南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院10mRNA的互補鏈,雜交信號集中于纖維細胞中。負對照,mRNA的同義鏈,無雜交信號正對照,UBQ10雜交信號遍布于整個胚珠2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院11第一節(jié)基因表達研究技術(shù)3.原位雜交技術(shù)熒光原位雜交（FISH）首先對寡核苷酸探針做特殊的修飾和標記,然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合,再通過與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來確定該DNA序列在染色體上的位置。2024/12/411南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院12第一節(jié)基因表達研究技術(shù)4.基因定點突變技術(shù)通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列,用于研究某個（些）氨基酸殘基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響,也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達載體、引入新的酶切位點等。目前,主要采用兩種PCR方法,重疊延伸技術(shù)和大引物誘變法,在基因序列中進行定點突變。2024/12/412南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院13寡核苷酸介導的DNA突變技術(shù)2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院14重疊延伸介導的定點誘變大引物誘變法2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院15第二節(jié)基因敲除技術(shù)1.基本原理經(jīng)典遺傳學（Forwardgenetics）是從一個突變體的表型出發(fā),研究其基因型,進而找出該基因的編碼序列?，F(xiàn)代遺傳學（Reversegenetics,反向遺傳學）首先從基因序列出發(fā),推測其表現(xiàn)基因敲除（geneknock-out）又稱基因打靶,通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組,進行精確的定點修飾和基因改造,具有專一性強、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點。型,進而推導出該基因的功能。2024/12/415南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院1.基本原理基因敲除分為完全基因敲除和條件型基因敲除（又稱不完全基因敲除）兩種。完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因活性條件型基因敲除是指通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除。噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)、酵母細胞的FLP/FRT系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種定位重組系統(tǒng),尤以Cre/Loxp系統(tǒng)應用最為廣泛。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院162024/12/416南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院17用取代型（a）或插入型（b）載體進行完全基因敲除實驗2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院18正負篩選法（PNS法）篩選已發(fā)生同源重組的細胞第二節(jié)基因敲除技術(shù)2.高等動物基因敲除技術(shù)真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建重組基因載體,用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導入胚胎干細胞純系中,使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應部分發(fā)生同源重組,將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達。顯微注射命中率較高,技術(shù)難度相對大些。電穿孔法命中率比顯微注射低,操作使用方便。胚胎干細胞（ES細胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院192024/12/419南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院20模式動物小鼠中完全基因敲除的主要技術(shù)策略與應用。第二節(jié)基因敲除技術(shù)3.植物基因敲除技術(shù)T-DNA插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。利用根癌農(nóng)桿菌T-DNA介導轉(zhuǎn)化,將帶有報告基因的DNA序列整合到基因組DNA上,如果這段DNA插入到目的基因內(nèi)部或附近,就會影響該基因的表達,從而使該基因“失活”。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院212024/12/421南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院22植物基因敲除及突變體篩選a.引物設(shè)計。LP和RP分別代表插入基因兩端的引物,LB是指載體上的一段引物,目的基因片段(設(shè)為900bp)。旁鄰序列是經(jīng)測序后獲得的DNA序列。b.PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。分別代表野生型、雜合子和純合子PCR條帶。第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)1.酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)是上世紀90年代中發(fā)展起來的研究DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術(shù),可識別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上的蛋白質(zhì),在酵母細胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用,并通過篩選DNA文庫直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。將已知順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動子（Pmin）的上游,把報告基因連接到Pmin下游。將編碼待測轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）融合表達載體導入酵母細胞,該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合,就能激活Pmin啟動子,使報告基因得到表達。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院232024/12/423南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院24從擬南芥cDNA文庫中篩選與順式元件DRE結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子示意圖。

酵母單雜交的基本原理示意圖第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)2.酵母雙雜交系統(tǒng)真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有組件式結(jié)構(gòu)（modular）特征,這些蛋白往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域,其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（bindingdomain,BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain,AD）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。BD能與特定基因啟動區(qū)結(jié)合,但不能激活基因轉(zhuǎn)錄,由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和AD所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院252024/12/425南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院26

酵母雙雜交的基本原理示意圖第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)3.體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)FarWestern印跡技術(shù)用32P標記的體外表達蛋白作探針,直接檢測與該蛋白發(fā)生相互作用的蛋白或表達該蛋白的cDNA。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院272024/12/427南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)3.體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)GST融合蛋白沉降技術(shù)利用GST對谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性,從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作用蛋白。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院282024/12/428南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)3.體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片可以用來大規(guī)模篩選蛋白之間的相互作用。將熒光標記的探針蛋白與蛋白質(zhì)芯片孵育,洗脫非特異性結(jié)合的蛋白后,可以通過掃描芯片上的熒光點檢測到穩(wěn)定的相互作用蛋白點。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院292024/12/429南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)3.體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)等離子表面共振技術(shù)將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面并固定于納米級厚度的金屬膜上。當?shù)鞍踪|(zhì)混合物經(jīng)過時,如果有蛋白質(zhì)同“誘餌”蛋白發(fā)生相互作用,那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射率上升,導致共振角度的改變。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院302024/12/430南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)3.體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)免疫共沉淀技術(shù)將靶蛋白的抗體連接到固體基質(zhì)上,再將可能與靶蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白加入反應體系中,用低離心力沉淀或微膜過濾法在固體基質(zhì)和抗體的共同作用下將蛋白復合物沉淀到試管的底部或微膜上。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院312024/12/431南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)4.細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究——熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）FRET熒光能量轉(zhuǎn)移有三個基本條件:給體與受體在合適的距離（1～10nm）；給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定的重疊（這是能量匹配的條件）；給體與受體的偶極具有一定的空間取向（這是偶極-偶極耦合作用的條件）。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院322024/12/432南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)5.RNAi（RNA干涉）技術(shù)及其應用RNAi技術(shù)利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細胞內(nèi)同源mRNA從而阻斷靶基因表達,使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。RNAi的命名來源于安德魯·法爾1998年在《自然》雜志上的論文。研究發(fā)現(xiàn),雙鏈RNA是RNAi的觸發(fā)物,引發(fā)與之互補的單鏈RNA（ssRNA,single-strandedRNA）的降解。經(jīng)過Dicer（一種具有RNAaseIII活性的核酸酶）的加工,細胞中較長的雙鏈RNA（30個核苷酸以上）首先被降解形成21～25個核苷酸的小分子干擾核糖核酸（siRNA,shortinterferingRNA）,并有效定位目標mRNA。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院332024/12/433南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院34RNAi作用機制示意圖。第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)5.RNAi（RNA干涉）技術(shù)及其應用siRNA是引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默中序列特異性RNA降解的重要中間媒介,它具有特殊的結(jié)構(gòu)特征,即5’端磷酸基團和3’端的羥基,其兩條鏈的3’端各有兩個堿基突出于末端。由siRNA中的反義鏈參與指導合成被稱為RNA誘導的沉默復合體（RISC）的核蛋白體,再由RISC介導切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補的區(qū)域,從而實現(xiàn)干擾靶基因表達的功能。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院352024/12/435南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院第四節(jié)基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片（DNAchip）,又稱DNA微陣列（DNAmicroarray）技術(shù)是能同時監(jiān)測大量靶基因表達的實驗手段,從而迅速準確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院362024/12/436南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院37基因芯片及數(shù)據(jù)分析簡易基因芯片使用機械臂把DNA片段點在玻璃片或尼龍膜上,經(jīng)過物理吸附作用達到固定化。也可以直接在玻璃板表面進行化學合成,從而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的cDNA或其它樣品雜交,經(jīng)過計算機掃描和數(shù)據(jù)處理,便可以觀察到大規(guī)模的基因群在不同組織或同一組織不同發(fā)育時期或不同生理條件下的表達模式?；蛐酒捎糜谶M行基因診斷。先建立正常人特定組織、器官的基因芯片,給出標準雜交信號圖,用可疑病人的cDNA做探針與之雜交,確定哪些基因的表達受抑制或激活。2024/12/437南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院第五節(jié)其他分子生物學技術(shù)1.凝膠滯緩實驗凝膠滯緩試驗（gelretardationassay）,又叫作DNA遷移率變動試驗（DNAmobilityshiftassay）,是用于體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。在凝膠電泳中,由于電場的作用,裸露的DNA朝正電極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反比。如果此時DNA分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合,那么,由于分子量增大,它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯,在特定電壓和時間內(nèi)朝正電極移動的距離也就相應縮短了。2024/12/4南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院382024/12/438南京農(nóng)業(yè)大學生命科學學院第五節(jié)其他分子生物學技術(shù)擬南芥轉(zhuǎn)錄因子與不同DNA元件有不同的結(jié)合