第7章蛋白質(zhì)分離純化

蛋白質(zhì)的分離純化與表征蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)分子的大小與形狀蛋白質(zhì)膠體與沉淀蛋白質(zhì)分離純化的一般原則蛋白質(zhì)分離純化的方法蛋白質(zhì)含量測定與純度鑒定第七章蛋白質(zhì)的分離純化與表征當前1頁，共65頁，星期日。蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)中可解離的基團蛋白質(zhì)的等電點1－蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)當前2頁，共65頁，星期日。蛋白質(zhì)中可解離的基團-NH3+pKa=7.6~8.4-COO-pKa=3~3.2NextPage1－蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)當前3頁，共65頁，星期日。蛋白質(zhì)中可解離的基團-COO-pKa=3.0~4.7-COO-pKa=4.41－蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)當前4頁，共65頁，星期日。蛋白質(zhì)中可解離的基團pKa=5.6~7.0-NH2pKa=9.4~10.61－蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)當前5頁，共65頁，星期日。蛋白質(zhì)中可解離的基團pKa=11.6~12.6pKa=9.8~10.4pKa=9.1~10.81－蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)當前6頁，共65頁，星期日。蛋白質(zhì)的等電點蛋白質(zhì)等電點蛋白質(zhì)等電點胃蛋白酶1.0-胰凝乳蛋白酶8.3卵清蛋白4.6-胰凝乳蛋白酶原9.1血清清蛋白4.7核糖核酸酶9.5-乳球蛋白5.2細胞色素C10.7胰島素5.3溶菌酶11.0血紅蛋白6.71－蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)當前7頁，共65頁，星期日。蛋白質(zhì)分子的大小與形狀根據(jù)化學(xué)組成測相對分子量滲透壓法測相對分子量擴散系數(shù)法測相對分子量沉降分析法測相對分子量凝膠過濾法測相對分子量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測相對分子量2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小當前8頁，共65頁，星期日。根據(jù)化學(xué)組成測相對分子量肌紅蛋白（Mb）M.W.=(Fe原子量)/(Mb中Fe含量)*100=55.8/0.335*100=16700血紅蛋白（Hb）一分子中含有4個Fe原子，因此：MW=4*16700=668002－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小當前9頁，共65頁，星期日。=RT(+K*c2)當前4頁，共65頁，星期日。2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小當前10頁，共65頁，星期日。Mr=10000~100000分連續(xù)和不連續(xù)體系（圓盤電泳）沉降速率與蛋白質(zhì)分子的大小和密度有關(guān)，而且與分子形狀、溶液的密度和粘度有關(guān)。Fick第一擴散定律：3溶菌酶11.分連續(xù)和不連續(xù)體系（圓盤電泳）蛋白質(zhì)Mr擴散系數(shù)（107cm2s-1)SDS-聚丙烯酰胺

凝膠電泳法測相對分子量蛋白質(zhì)分子的大小與形狀國際市場調(diào)查表明，高效液相色譜儀在分析儀器銷售市場中占有最大的份額，增長速度最快。滲透壓法測相對分子量=RT(+K*c2)cMr

c=RTMr+K*c

c~cMr=RTlimc0

cMr=10000~1000002－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小當前10頁，共65頁，星期日。擴散系數(shù)法測相對分子量Fick第一擴散定律：擴散系數(shù)D求法（Fick第二擴散定律）dmdt=-D*A*dcdxdcdt=-Dd2cdx2c2c1=exp(-)x22-x124Dt2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小當前11頁，共65頁，星期日。擴散系數(shù)法測相對分子量擴散系數(shù)D隨蛋白質(zhì)Mr的增加而降低。蛋白質(zhì)Mr擴散系數(shù)（107cm2s-1)核糖核酸酶A1260011.9細胞色素c1337011.4肌紅蛋白1690011.3凝乳蛋白酶原232409.5血紅蛋白645006.9過氧化氫酶2475004.1肌球蛋白5248001.12－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小當前12頁，共65頁，星期日。沉降分析法測相對分子量蛋白質(zhì)分子在溶液中受到強大的離心力作用時，如果蛋白質(zhì)的密度大于溶液的密度，蛋白質(zhì)分子就會沉降。沉降速率與蛋白質(zhì)分子的大小和密度有關(guān)，而且與分子形狀、溶液的密度和粘度有關(guān)。2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小當前13頁，共65頁，星期日。沉降分析法測相對分子量斯維得貝格方程：Mr=RTsD(1-

)s為沉降系數(shù):單位秒-1，通常將10-13秒作為一個單位用S表示

為偏微比容：蛋白質(zhì)溶于水為0.74cm3/g為溶劑的密度2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小當前14頁，共65頁，星期日。2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小當前15頁，共65頁，星期日。凝膠過濾法測相對分子量洗脫液體積（mL）蛋白質(zhì)含量相對分子量MrABCD待測蛋白分子量2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小當前16頁，共65頁，星期日。SDS-聚丙烯酰胺

凝膠電泳法測相對分子量電泳時的遷移率取決于蛋白的凈電荷、分子大小、形狀；SDS（十二烷基硫酸鈉）與蛋白質(zhì)結(jié)合，使全部呈負電荷，同時改變蛋白質(zhì)單體分子構(gòu)象成近似球形；巰基乙醇打開二硫鍵，使亞基分離；電泳時蛋白質(zhì)向正極移動。分連續(xù)和不連續(xù)體系（圓盤電泳）2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小當前17頁，共65頁，星期日。SDS-聚丙烯酰胺

凝膠電泳法測相對分子量2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小當前18頁，共65頁，星期日。SDS-聚丙烯酰胺

凝膠電泳法測相對分子量ABRf=A/B2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小當前19頁，共65頁，星期日。蛋白質(zhì)膠體性質(zhì)膠體穩(wěn)定性的三個要素：質(zhì)點大小1~100nm；帶相同電荷；形成溶劑化層；穩(wěn)定親水性蛋白質(zhì)膠體的因素：水化層：雙電層：3－蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)當前20頁，共65頁，星期日。蛋白質(zhì)的沉淀鹽析法：NaCl、(NH4)2SO4有機溶劑沉淀：乙醇、丙酮重金屬鹽沉淀：Hg2+、Ag+生物堿與某些酸類沉淀：單寧酸、TCA加熱變性沉淀：3－蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)當前21頁，共65頁，星期日。蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標：增加蛋白質(zhì)含量與生物活性，除去不必要的雜質(zhì)蛋白；前處理：細胞破碎粗分級分離：鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等細分級分離：層析、電泳、結(jié)晶4－蛋白質(zhì)的分離純化當前22頁，共65頁，星期日。蛋白質(zhì)的分離純化方法根據(jù)下列性質(zhì)將蛋白分離純化： 分子大小 溶解度 電荷 吸附性質(zhì) 對配體分子的親和力4－蛋白質(zhì)的分離純化當前23頁，共65頁，星期日。透析與超過濾4－蛋白質(zhì)的分離純化當前24頁，共65頁，星期日。透析通常是將濃縮液裝在一個用賽咯吩（cellophane）制造的透析袋內(nèi)，兩端都密封好，然后將透析袋懸浮在一個裝有很多緩沖液的容器內(nèi)進行透析。因為賽咯吩膜是半通透的膜，蛋白質(zhì)等大分子不能透過膜，仍然留在袋內(nèi)，但蛋白質(zhì)周圍的小分子可以與緩沖液進行交換，通過多次更換透析液，就可除去小分子（如硫酸銨）。經(jīng)硫酸銨分級純化、透析的粗分級的蛋白質(zhì)樣品可以通過以下一些常用的分離純化技術(shù)和方法進一步純化和鑒定。4－蛋白質(zhì)的分離純化當前25頁，共65頁，星期日。當前26頁，共65頁，星期日。超濾超濾是一種膜分離技術(shù)，它的特點是使用不對稱多孔膜，根據(jù)分子的大小來分離溶液中的大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)。超濾尤其適用于大分子溶液的濃縮，不同種類分子的純化以及溶劑交換等。超濾法是一種溫和的、非變性的物理分離方法。4－蛋白質(zhì)的分離純化當前27頁，共65頁，星期日。超濾離心管切向流超濾器4－蛋白質(zhì)的分離純化當前28頁，共65頁，星期日。離心技術(shù)離心技術(shù)主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉(zhuǎn)下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質(zhì)量、大小和密度。密度梯度離心技術(shù)是利用每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的密度梯度時即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成各自的區(qū)帶。常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。4－蛋白質(zhì)的分離純化當前29頁，共65頁，星期日。差

速

離

心Differentialcentrifugationasafirststepinproteinpurification4－蛋白質(zhì)的分離純化當前30頁，共65頁，星期日。密度梯度（區(qū)帶）離心4－蛋白質(zhì)的分離純化當前31頁，共65頁，星期日。密度梯度（區(qū)帶）離心4－蛋白質(zhì)的分離純化當前32頁，共65頁，星期日。凝膠過濾

凝膠過濾層析是依據(jù)分子大小這一物理性質(zhì)進行分離純化的。凝膠層析的固定相是惰性的珠狀凝膠顆粒，凝膠顆粒的內(nèi)部具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。當含有不同分子大小的組分的樣品進入凝膠層析柱后，各個組分就向固定相的孔穴內(nèi)擴散，組分的擴散程度取決于孔穴的大小和組分分子大小。分子越大的組分越先流出，分子越小的組分越后流出。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。4－蛋白質(zhì)的分離純化當前33頁，共65頁，星期日。凝膠過濾（分子排阻層析）基于分子大小4－蛋白質(zhì)的分離純化當前34頁，共65頁，星期日。利用溶解度差別的純化等電點沉淀（等電點時靜電荷為零，相鄰蛋白質(zhì)分子間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀）鹽析與鹽溶（中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，稱為鹽溶；鹽析作用主要是大量中性鹽爭奪蛋白質(zhì)疏水表面水分子）有機溶劑分級分離（有機溶劑降低蛋白質(zhì)表面可解離基團的離子化程度，促進蛋白質(zhì)的聚集和沉淀）4－蛋白質(zhì)的分離純化當前35頁，共65頁，星期日。利用溶解度差別的純化分級沉淀（鹽或有機溶劑）4－蛋白質(zhì)的分離純化當前36頁，共65頁，星期日。利用電荷差別的純化聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦離子交換層析層析聚焦4－蛋白質(zhì)的分離純化當前37頁，共65頁，星期日。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）平板電泳4－蛋白質(zhì)的分離純化當前38頁，共65頁，星期日。凝膠過濾法測相對分子量2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小可以利用基因敲除和反義技術(shù)分析基因表達產(chǎn)物-蛋白質(zhì)的功能。SDS（十二烷基硫酸鈉）與蛋白質(zhì)結(jié)合，使全部呈負電荷，同時改變蛋白質(zhì)單體分子構(gòu)象成近似球形；當前1頁，共65頁，星期日。國際市場調(diào)查表明，高效液相色譜儀在分析儀器銷售市場中占有最大的份額，增長速度最快。后來此技術(shù)一直用于原核生物和真核生物總蛋白的分離。2－蛋白質(zhì)的分子形狀與大小過氧化氫酶2475004.當前51頁，共65頁，星期日。HPLCgivesveryhighresolutionofproteincomponents蛋白質(zhì)分子的大小與形狀知道了人類的全部遺傳密碼即基因組序列，就可以任意控制人的生老病死嗎？親和層析過程示意圖（3）沉降分析法測相對分子量聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）管狀電泳圖譜平板PAGE圖譜4－蛋白質(zhì)的分離純化當前39頁，共65頁，星期日。等電聚焦電泳蛋白質(zhì)是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負電荷的數(shù)量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化。在電場存在下的一定pH溶液中，帶正電的蛋白分子將向負極移動而帶負電的蛋白分子將向正極移動，在某一pH時，蛋白分子在電場中不再移動，此時的pH值即為該蛋白質(zhì)的等電點。等電聚焦(IEF）電泳就是在凝膠中加入兩性電解質(zhì)從而構(gòu)成從正極到負極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運動，最后各自停留在其等電點的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點。4－蛋白質(zhì)的分離純化當前40頁，共65頁，星期日。等電聚焦電泳蛋白質(zhì)在具有pH梯度的介質(zhì)中電泳4－蛋白質(zhì)的分離純化當前41頁，共65頁，星期日。等電聚焦電泳4－蛋白質(zhì)的分離純化當前42頁，共65頁，星期日。二維電泳1975年，O’Farrell首先運用雙向電泳技術(shù)將大腸桿菌總蛋白分離出1100多個蛋白點。后來此技術(shù)一直用于原核生物和真核生物總蛋白的分離。目前，隨著蛋白組工程的發(fā)展，雙向電泳技術(shù)越來越廣泛的用于發(fā)現(xiàn)未知蛋白。二維電泳由第一向等電聚焦(IEF)電泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)組成，第一向使等電點不同的蛋白得到分離，第二向使分子量不同的蛋白得到分離，兩向結(jié)合便得到高分辨率的蛋白圖譜。4－蛋白質(zhì)的分離純化當前43頁，共65頁，星期日。翻譯后修飾：很多mRNA表達產(chǎn)生的蛋白質(zhì)要經(jīng)歷翻譯后修飾如磷酸化，糖基化，酶原激活等。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達到了分離的目的。有機溶劑沉淀：乙醇、丙酮知道了人類的全部遺傳密碼即基因組序列，就可以任意控制人的生老病死嗎？因為賽咯吩膜是半通透的膜，蛋白質(zhì)等大分子不能透過膜，仍然留在袋內(nèi)，但蛋白質(zhì)周圍的小分子可以與緩沖液進行交換，通過多次更換透析液，就可除去小分子（如硫酸銨）。Mr=10000~100000SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測相對分子量鹽析與鹽溶（中性鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，稱為鹽溶；凝乳蛋白酶原232409.沉降分析法測相對分子量當前14頁，共65頁，星期日。當前58頁，共65頁，星期日。親和層析過程示意圖（1）蛋白質(zhì)等電點蛋白質(zhì)等電點密度梯度離心技術(shù)是利用每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的密度梯度時即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成各自的區(qū)帶。二維電泳IsoelectricfocusingisoftencombinedwithSDStogeneratetwodimensionalgels.4－蛋白質(zhì)的分離純化當前44頁，共65頁，星期日。二維電泳的應(yīng)用示例4－蛋白質(zhì)的分離純化當前45頁，共65頁，星期日。離子交換層析陽離子交換劑：CM-纖維素：-O-CH2COOHP-纖維素：磷酸基陰離子交換劑：DEAE-纖維素：二乙基氨基乙基AE-纖維素：氨基乙基4－蛋白質(zhì)的分離純化當前46頁，共65頁，星期日。離子交換層析4－蛋白質(zhì)的分離純化當前47頁，共65頁，星期日。4－蛋白質(zhì)的分離純化當前48頁，共65頁，星期日。親和層析原理：依賴于蛋白質(zhì)和它的配體（ligand）之間的相互作用來分離。配體通常指的是能與另一個分子或原子結(jié)合（一般是非共價結(jié)合）的分子、基團、離子或原子。但在親和層析中，配體是通過共價鍵先與基質(zhì)結(jié)合。配體可以是酶結(jié)合的一個反應(yīng)物或產(chǎn)物，或是一種可以識別靶蛋白的抗體，也可以是受體、核酸、細胞器等。親和層析是分離效率最高的分離方法。4－蛋白質(zhì)的分離純化當前49頁，共65頁，星期日。親和層析過程示意圖（1）4－蛋白質(zhì)的分離純化當前50頁，共65頁，星期日。親和層析過程示意圖（2）4－蛋白質(zhì)的分離純化當前51頁，共65頁，星期日。親和層析過程示意圖（3）4－蛋白質(zhì)的分離純化當前52頁，共65頁，星期日。親和層析過程示意圖（4）4－蛋白質(zhì)的分離純化當前53頁，共65頁，星期日。4－蛋白質(zhì)的分離純化當前54頁，共65頁，星期日。高效液相層析（HPLC）高效液相色譜（HPLC：HighPerformanceLiquidChromatography）與普通的色譜技術(shù)不同的是：填料密度高，洗脫液壓力加大，分離效果更好。是化學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、商檢、藥檢、法檢等學(xué)科領(lǐng)域與專業(yè)最為重要的分離分析技術(shù)，是分析化學(xué)家、生物化學(xué)家等用以解決他們面臨的各種實際分離分析課題必不可缺少的工具。國際市場調(diào)查表明，高效液相色譜儀在分析儀器銷售市場中占有最大的份額，增長速度最快。4－蛋白質(zhì)的分離純化當前55頁，共65頁，星期日。高效液相層析（HPLC）高效液相色譜的優(yōu)點是：檢測的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復(fù)性好，定量精度高，應(yīng)用范圍廣。適用于分析高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差的化合物。其缺點是：價格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析生物大分子和無機離子困難，流動相消耗大且有毒性的居多。目前的發(fā)展趨勢是向生物化學(xué)和藥物分析及制備型傾斜。4－蛋白質(zhì)的分離純化當前56頁，共65頁，星期日。4－蛋白質(zhì)的分離純化當前57頁，共65頁，星期日。高效液相層析（HPLC）HighPressureLiquidChromatographyHighpressurelimitsdiffusionandincreasesinteractionswithchromatographymediaHPLCgivesveryhighresolutionofproteincomponents4－蛋白質(zhì)的分離純化當前58頁，共65頁，星期日。蛋白質(zhì)純化過程實例4－蛋白質(zhì)的分離純化當前59頁，共65頁，星期日。蛋白質(zhì)的含量測定凱氏定氮法雙縮脲法Folin-酚法（Lowry法，蛋白質(zhì)在堿性溶液中與銅形成復(fù)合物，此復(fù)合物及芳香族氨基酸還原磷鉬酸－磷鎢酸試劑產(chǎn)生藍色。）紫外吸收法Bradford法（考馬斯亮藍染料結(jié)合法）BCA法（bisinchonin