DB21T 3278-2020 飼用微生物制劑中凝結(jié)芽孢桿菌的檢測(cè)　

備案號(hào)：73359-2020DB21MethodfordeterminationofBacilluscoagulansinfeeds遼寧省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布 慶、劉恩、翟宏旭、曹艷子、顧艷麗、張英雪、楊喬喬、李晶晶、陸繼爽、劉星、冷寒冰、曾楠。標(biāo)準(zhǔn)起草單位通訊地址：遼寧省大連市甘井子區(qū)營(yíng)城子鎮(zhèn)營(yíng)旭路9號(hào)，聯(lián)系電話：0411-66881飼用微生物制劑中凝結(jié)芽孢桿菌的檢測(cè)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼用微生物制劑中凝結(jié)芽孢桿菌的檢本標(biāo)準(zhǔn)適用于含有益微生物凝結(jié)芽孢桿菌的各種飼料添加劑中凝結(jié)芽孢桿菌的檢凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法（GB/T6682-2008/ISO3696：1987，GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表GB/T14699.1飼料采樣（GB/T14699.1-2005/ISO649GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備（GB/T20195-2006/ISO6498：1998，實(shí)驗(yàn)用水參照標(biāo)準(zhǔn)：分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法（GB/T6682-2008/ISO36964主要儀器設(shè)備和玻璃器皿4.1恒溫培養(yǎng)箱：50℃±1℃4.2恒溫水浴鍋：80℃±1℃4.3普通冰箱4.5振蕩器或漩渦混合器4.6顯微鏡：1000倍24.8無(wú)菌玻璃或塑料培養(yǎng)皿Φ=90mm、無(wú)菌錐型瓶、無(wú)菌玻璃或塑料涂布棒4.9量筒：250mL4.10PCR儀4.12凝膠成像儀3器皿。樣品采集后置于4℃~8℃環(huán)境內(nèi)保存，并應(yīng)及時(shí)送到微生物檢驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。采樣數(shù)量和方式按按照GB/T20195進(jìn)行試樣的制備，樣品制備后應(yīng)10的初始懸浮液1mL，加入9mL0.85%滅菌生理鹽水，培養(yǎng)后，選取菌落數(shù)在30個(gè)～300個(gè)之間的平板計(jì)數(shù)。若平板中有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2以代表全皿菌落數(shù)。典型的凝結(jié)芽孢桿菌菌落形狀不規(guī)則，無(wú)隆起，呈灰白色，不透明。然后從中選出5個(gè)特劑盒或常用方法以進(jìn)行該項(xiàng)確證試驗(yàn)。養(yǎng)基(NA)（A.1）上，50℃±1℃培養(yǎng)24h±1h。從每一平板中選取至少1個(gè)良好分離的特征菌落，轉(zhuǎn)接4將挑選純化的菌落做革蘭氏染色(A.2)鏡檢。凝結(jié)芽孢桿菌細(xì)胞應(yīng)B.coagulansB.subtilisB.licheniformisB.laterosporusB.pumilus﹢ ﹢﹢ d﹢﹢+ ﹢﹢﹢ ﹢﹢+﹢ ﹢ d﹢﹢ ﹢d﹢﹢ ﹢d﹢﹢ ﹢d﹢﹢+﹢ ﹢﹢﹢5使用量(μL）513樣。用DNA分子量標(biāo)記物做參照。3V/被檢樣品出現(xiàn)555bp擴(kuò)增帶，凝結(jié)芽孢桿菌陽(yáng)性9結(jié)果與報(bào)告9.1計(jì)算每塊平板上凝結(jié)芽孢桿菌菌落數(shù)計(jì)數(shù)每塊平板上的凝結(jié)芽孢桿菌菌落數(shù)a，6按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則得a為62。9.2樣品中凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)的計(jì)算方法與報(bào)告d——第一個(gè)稀釋度的稀釋因子(未經(jīng)稀釋的液體樣品的d值為1)。若第一個(gè)稀釋度（10-4）經(jīng)確證后的菌落數(shù)為170、166和238，第二個(gè)稀釋度（10-5）經(jīng)確證后的菌落數(shù)為50、75和按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則得出每mL或每g樣品中含凝結(jié)芽孢桿菌估計(jì)數(shù)為2按照GB/T8170數(shù)值修約規(guī)則得出每mL或每g樣品中含凝結(jié)芽孢桿菌估計(jì)數(shù)為160000000CFU/g（mL）或1.6×108CFU/g7培養(yǎng)基和試劑A.1.1成分乙酸鈉MgSO4MnSO4A.1.2制法溶解各成分于水中，必要時(shí)加熱。調(diào)整pH值，使培養(yǎng)基pH值在室溫時(shí)為5.5，121℃滅菌A.2革蘭氏染色A.2.1結(jié)晶紫染色液A.2.1.1成分A.2.1.2制法A.2.2革蘭氏碘液8A.2.2.1成分碘A.2.2.2制法將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加人蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。A.2.3沙黃復(fù)染液A.2.3.1成分A.2.3.2制法A.2.4染色法滴加95%乙醇脫色，約30s，水洗；滴加沙黃復(fù)染液，復(fù)A.3細(xì)菌DNA提