醫(yī)學(xué)教程 蛋白質(zhì)的變性

第六節(jié)：蛋白質(zhì)的性質(zhì)12/15/20241一、蛋白質(zhì)性質(zhì)：

膠體性質(zhì)(p299)

兩性性質(zhì)及等電點

(p291)

蛋白質(zhì)的變性、復(fù)性、沉淀和凝固

(p233,300)

蛋白質(zhì)的紫外吸收

蛋白質(zhì)的分子量

(p291)

蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)

二、蛋白質(zhì)含量測定法(p315)12/15/20242蛋白質(zhì)分子量大，它在水溶液中所形成的顆粒直徑約為1－100nm。膠體溶液具有布朗運動、丁達爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象、不能透過半透膜以及具有吸附能力等。

利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進行純化，這是提純蛋白質(zhì)的一種常用方法。(一)膠體性質(zhì)12/15/20243在溶液中能形成穩(wěn)定的膠體的因素極性不電離基團：形成水化層極性電離基團：形成雙電子層原因12/15/20244

(二)兩性性質(zhì)及等電點PrCOO-NH3+pH=pI凈電荷=0Isoelectricpoint(pI)定義：

在某一pH值溶液中，Pr酸性基團和堿性基團的解離程度相當(dāng),Pr分子所帶正負電荷相等，凈電荷為零,在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值稱為該蛋白質(zhì)的pI。pH>pI凈電荷為負PrCOO-NH2OH-H+pH<pI凈電荷為正PrCOOHNH3+OH-H+12/15/20245

蛋白質(zhì)和氨基酸一樣，是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)分子中，可解離基團除了肽鏈末端的α-氨基和α-羧基外，主要的還是肽鏈上氨基酸殘基的一些側(cè)鏈基團，如：

ε－NH2、γ－COOH、β-COOH、咪唑基、胍基、－OH等。12/15/2024612/15/20247

pH=pI時，凈電荷為零，在電場中不移動

pH＞pI時，凈電荷為負，在電場中向陽極移動

pH＜pI時，凈電荷為正，在電場中向陰極移動

在pI時，蛋白質(zhì)失去了膠體的穩(wěn)定條件，即沒有相同電荷相互排斥的作用。所以不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀.

12/15/20248（三）蛋白質(zhì)的變性、復(fù)性、沉淀和凝固2.復(fù)性1.變性3.沉淀和凝固定義變性因素變性實質(zhì)變性蛋白質(zhì)的特點

變性的分類定義沉淀類型12/15/20249吳憲教授1931年：“天然Pr分子借助次級鍵連接而成一種緊密，有規(guī)則的空間結(jié)構(gòu)，變性作用使次級鍵破壞從而使結(jié)構(gòu)松散”。1.蛋白質(zhì)的變性(denaturation)(1)定義：在某些理化因素的作用下，蛋白質(zhì)嚴格的空間結(jié)構(gòu)（不包括肽鍵）被破壞，從而引起若干理化性質(zhì)改變和生物學(xué)功能喪失的現(xiàn)象。12/15/202410變性因素物理因素高溫、高壓紫外線、X射線、電離輻射和超聲波等化學(xué)因素有機酸、生物堿有機溶劑、重金屬鹽高濃度尿素、鹽酸胍等12/15/202411變性實質(zhì)：破壞了空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)不受影響（分子組成、MW不變）。12/15/202412變性蛋白質(zhì)的特點①生物學(xué)活性喪失②理化性質(zhì)改變③易被蛋白酶水解

空間結(jié)構(gòu)改變旋光性、光吸收改變等溶解度↓，沉降率↑粘度↑擴散速度↓12/15/202413變性分類可逆變性:

Pr變性后如將變性劑除去，該Pr分子的天然構(gòu)象和生物學(xué)活性還能恢復(fù)，這一過程稱為復(fù)性（renaturation）不可逆變性：若變性條件強烈，作用時間長，構(gòu)像變化大，理化性質(zhì)難以恢復(fù)。舉例：醫(yī)療；生物制品保存；生活等。應(yīng)用：變性滅菌、消毒；變性制食品；抗衰老……12/15/202414HOCH2CH2SH

ONH2-C-NH2=

NH2+

NH2-C-NH2=UreaGuanidineHClMercaptoethanolCl-SDSSO4-

-(CH2)11CH3常見的蛋白質(zhì)變性劑JuangRH(2004)BCbasics12/15/202415極性頭部非極性尾巴SDS是一種表面活性劑sodiumdodecylsulfateStryer(1995)Biochemistry(4e)p.27512/15/202416SDS在蛋白質(zhì)表面均勻鋪上一層負電荷SDSboiling變性蛋白質(zhì)成一線狀分子自然狀態(tài)蛋白質(zhì)並且均勻帶上一層負電荷JuangRH(2004)BCbasics12/15/20241712/15/202418核糖核酸酶變性與復(fù)性作用NativeribonucleaseDenativereducedribonucleaseNativeribonuclease8Mureaand-mercapotoethanolDialysis變性復(fù)性12/15/202419去除變性因素后，變性蛋白恢復(fù)原來的空間結(jié)構(gòu)，恢復(fù)生物活性的現(xiàn)象。本質(zhì)—一級結(jié)構(gòu)決定高級結(jié)構(gòu)2.復(fù)性（renaturation）12/15/202420變性蛋白質(zhì)為什么能復(fù)性？

在一定的環(huán)境條件下，蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)能夠決定二、三、四級結(jié)構(gòu)。變性蛋白質(zhì)的二、三、四級結(jié)構(gòu)雖然遭到破壞，但是一級結(jié)構(gòu)仍然保持不變，因此除去變性劑后，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下，蛋白質(zhì)能卷曲折疊成為能量最低的構(gòu)象，一般天然蛋白質(zhì)正是具有這種能量最低的構(gòu)象。12/15/202421加熱使蛋白質(zhì)變性并凝聚成塊狀稱為凝固（coagulation）。因此，凝固的蛋白質(zhì)一定發(fā)生變性。

What’scoagulationofprotein?12/15/202422

凝固：變性后的蛋白質(zhì)由于疏水基團的暴露而易于沉淀(但沉淀的蛋白質(zhì)不一定都是變性后的蛋白質(zhì))，加熱等因素使蛋白質(zhì)變性并凝聚成塊狀?？偨Y(jié)：Pr變性、沉淀與凝固之間的關(guān)系變性Pr不一定沉淀沉淀Pr不一定變性變性Pr不一定凝固凝固的Pr一定變性3.沉淀與凝固沉淀：蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出的現(xiàn)象稱沉淀。12/15/202423

沉淀類型

①

PI法

②鹽析法

③

有機溶劑沉淀法④重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì)⑤生物堿、有機酸試劑沉淀蛋白質(zhì)⑥加熱變性沉淀法⑦抗體對蛋白質(zhì)的沉淀：12/15/202424機理：奪取蛋白質(zhì)顆粒上的水化膜，降低溶液的介電常數(shù)12/15/202425++++++++--------++++++++--------蛋白質(zhì)膠體顆粒的等電點沉淀

帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)酸酸堿堿脫水脫水脫水不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒（沉淀）帶正電荷的蛋白質(zhì)（疏水膠體）帶負電荷的蛋白質(zhì)（疏水膠體）堿酸（親水膠體）（親水膠體）（親水膠體）12/15/202426不可逆沉淀

在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀12/15/202427可逆沉淀在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。12/15/202428定義：加入大量中性鹽以破壞Pr的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理:破壞Pr兩個穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層中性鹽：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。半飽和硫酸銨沉淀球Pr

飽和硫酸銨沉淀清Pr優(yōu)點：Pr不變性，常用。鹽析法（Saltingout)(p305)叫分段鹽析法12/15/202429蛋白質(zhì)分子表面的疏水區(qū)域，聚集了許多H2O，鹽濃度高時，這些水分子被鹽抽出，暴露出的疏水區(qū)域相互結(jié)合，沉淀。鹽析（（NH4）2SO4）12/15/202430分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀，后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶12/15/202431

大部分蛋白質(zhì)均含有帶共軛雙鍵的Tyr、Phe和Trp。這三種AA在280nm

附近有特征性吸收峰。在此波長范圍，蛋白質(zhì)的A280與其濃度成正比。利用這個性質(zhì)，可以對蛋白質(zhì)進行定量測定。此外，蛋白質(zhì)的肽鍵在215nm、225nm亦有紫外吸收，可以用于蛋白質(zhì)濃度的測定(四）蛋白質(zhì)的紫外吸收12/15/202432（五）蛋白質(zhì)的分子量蛋白質(zhì)的相對分子量蛋白質(zhì)相對分子量在10000~1000000d之間。測定分子量的主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。12/15/202433測定蛋白質(zhì)分子相對質(zhì)量的方法1.根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量2.滲透壓法：

3.沉降法：超速離心4.凝膠過濾法：5.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法：12/15/2024341.根據(jù)分子組成測定最小分子量

測定某一微量元素或某一氨基酸的含量如鐵原子或色氨酸，并假設(shè)蛋白質(zhì)分子中只有一個鐵原子或一個色氨酸，即最低相對分子質(zhì)量=鐵的原子量/鐵的百分含量牛血清白蛋白含Trp0.58%

最低M=35200d，實際為69000d，含2個Trp×100=16700=最小M＝Fe分子量

Fe(%)55.80.335(實為16900馬心)如肌紅蛋白含0.335%的鐵12/15/2024352.據(jù)pr的滲透壓測蛋白質(zhì)分子量

12/15/202436用一半透膜將pr溶液與純水隔開，當(dāng)滲透壓達平衡時，測定其滲透壓，計算分子量：C：濃度（克/升）R：氣體常數(shù)（0.082升/大氣壓/克分子/K開氏溫度）T：絕對溫度（開氏溫度）

：以大氣壓表示的滲透壓ccTRMrp0lim?=12/15/202437

優(yōu)點：滲透壓法簡單、準(zhǔn)確(10000-100000d)、且不受蛋白質(zhì)分子的形狀和水化程度影響不足：但受pH的影響，不能區(qū)別溶液中蛋白質(zhì)分子是否均一

.12/15/202438

3、葡聚糖凝膠過濾法分析蛋白質(zhì)分子量p297

12/15/202439

標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（已知Mr和斯托克半徑）和待測蛋白質(zhì)必須具有相同的分子形狀（接近球體），分子形狀為線型或與凝膠發(fā)生吸附的蛋白質(zhì)不可用此法測定。12/15/2024404.SDS—PAGE（十二烷基硫酸鈉——聚丙烯酰胺凝膠電泳）12/15/202441

加入SDS和少量巰基乙醇，則電泳遷移率主要取決于其相對分子質(zhì)量，而與電荷和分子形狀無關(guān)。★影響遷移率的主要因素凝膠的分子篩效應(yīng)對長短不同的棒形分子會產(chǎn)生不同的阻力〔主要因素〕凝膠的濃度和交聯(lián)度同一電泳條件下，分子小，受阻小，游動快，遷移率大。相對分子質(zhì)量大者，遷移率小★優(yōu)點：快速，樣品用量少，可同時測幾個樣品

缺點：誤差大，約為±10％（誤差主要來源于遷移距離的測量誤差）★此方法只能測得亞基肽鏈的相對分子質(zhì)量12/15/202442（2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圓盤電泳：玻璃管中進行的凝膠電泳。2）平板電泳：鋪有凝膠的玻板上進行的電泳。+—-+12/15/202443等電聚焦電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不再移動。++－－－－+－－－－－5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－12/15/202444沉降系數(shù)（s）：單位（cm）離心場里的沉降速度。

s

=————vω2x

v=沉降速度（dx/dt）ω=離心機轉(zhuǎn)子角速度（弧度/s）

x=蛋白質(zhì)界面中點與轉(zhuǎn)子中心的距離（cm）沉降系數(shù)的單位常用S，1S=1×10-13（s）超離心法是最準(zhǔn)確可靠的確定蛋白質(zhì)分子量方法。（Svedberg于1940年設(shè)計）：蛋白質(zhì)顆粒在25~50×104g離心力作用下從溶液中沉降下來。3.超離心法12/15/202445蛋白質(zhì)分子量（M）與沉降系數(shù)（s）的關(guān)系M=——————RTsD（1－Vρ）R——氣體常數(shù)（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T——絕對溫度D——擴散常數(shù)（蛋白質(zhì)分子量很大，離心機轉(zhuǎn)速很快，則忽略不計）V——蛋白質(zhì)的微分比容（m3·g-1）ρ——溶劑密度（20℃，g·ml-1）

s——沉降系數(shù)12/15/202446

反應(yīng)試劑顏色反應(yīng)基團有此反應(yīng)的Pr及AA雙縮脲反應(yīng)

NaOH,稀CuSO4

紫或粉

2個以上肽鍵所有蛋白質(zhì)Millon反應(yīng)

Millon,硝酸，亞硝酸

紅色酚基Tyr黃色反應(yīng)

HNO3及NH3

黃、橘黃

苯基Phe,Tyr乙醛酸反應(yīng)乙醛酸H2SO4

紫紅吲哚Trp坂口反應(yīng)

次氯酸鈉,萘酚紅色

胍基

ArgFolin酚試劑反應(yīng)

CuSO4磷鎢酸-鉬酸

藍色

酚基Tyr茚三酮反應(yīng)

茚三酮

紫藍色

游離氨、羧基Pro和羥Pro呈黃色（六）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)12/15/202447二、Pr含量測定法

1.微量凱氏定氮法：2.雙縮脲法：3.福林-酚(Lowry)法

改良的Lowry法4.考馬斯亮藍法（Bradford法)5.紫外吸收法6.BCA法7.膠體金法12/15/202448

蛋白質(zhì)含有多個肽鍵，可發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，在堿性溶液中蛋白質(zhì)與銅離子形成紫紅色絡(luò)合物，可在540nm比色測定，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量及氨基酸組成無關(guān)。

快速，但不很準(zhǔn)確該法測定的蛋白質(zhì)濃度范圍是

1～10mg/ml(g/L)雙縮脲法12/15/202449Lowry法

此法是對雙縮脲法的發(fā)展，首先在堿性溶液中形成銅與蛋白質(zhì)的復(fù)合物，然后這種復(fù)合物及Tyr和Trp殘基還原磷鉬酸及磷鎢酸試劑(福林-酚試劑)，產(chǎn)生深藍色。

測定蛋白質(zhì)的含量范圍：

500nm0.05～0.5mg/ml750nm0.03～0.3mg/ml12/15/202450改良Lowry法：

在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反應(yīng)，生成藍色化合物，將其與雙縮脲法結(jié)合起來，形成兩種顏色的混合物，在650nm具有特定的吸收。靈敏度較高25

g-250g/ml.

曾經(jīng)的蛋白質(zhì)濃度測定標(biāo)準(zhǔn)方法12/15/202451

考馬斯亮藍G250是一種帶有負電荷的染料，在酸性條件下可與蛋白質(zhì)上的正電荷結(jié)合，形成藍色化物，在595nm具有特定吸收

本法反應(yīng)快，操作簡單，靈敏度高，重復(fù)性好，消耗樣品少，但不同蛋白質(zhì)之間的差異較大，且標(biāo)準(zhǔn)曲線線性較差。

測定范圍：0.01～1.0mg/ml考馬斯亮藍法（Bradford法)12/15/202452紫外吸收法

280nm和260nm吸收差法：

由于核酸在260nm具有光