科研公開課文獻(xiàn)精讀（四）

科研公開課：文獻(xiàn)精讀（第四講）醫(yī)盟講師：魏曉為南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第一醫(yī)院）本節(jié)主要內(nèi)容文獻(xiàn)精讀在課題設(shè)計(jì)的實(shí)際應(yīng)用選題設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)觀察資料數(shù)據(jù)分析總結(jié)提出假設(shè)研究結(jié)果檢驗(yàn)假設(shè)科研的基本程序文獻(xiàn)精讀選題的重要性什么是文章的第一吸引力？選題新穎性權(quán)威性領(lǐng)域性實(shí)用性可以當(dāng)你遇到一個(gè)普通的選題時(shí)？維生素C、前列腺癌（2014.09）一周給出課題初步設(shè)想1、不要抱怨課題的普通2、關(guān)鍵看你怎么想、怎么做多角度思考問題、多角度探索出路維生素C前列腺癌治療還原型氧化型放療保護(hù)無效化療文獻(xiàn)精讀尋找思路爭議由來曇花一現(xiàn)的研究：

1978年P(guān)NAS發(fā)文每日10g維生素C口服顯著改善腫瘤終末期患者生存期，評估延長約300天諾貝爾獎(jiǎng)獲得者：萊納斯·鮑林（Linus

Pauling）后續(xù)臨床研究未能復(fù)制相關(guān)結(jié)果靜脈VS口服，沉寂中的突破VitaminC

pharmacokinetics:

Implications

for

oral

and

intravenous

use.Ann.

Intern.Med.

140,533–537

(2004)

靜脈維生素C的血藥濃度顯著高于口服，這在高劑量使用時(shí)尤為明顯

維生素C的給藥方式顯著影響其藥理學(xué)功能大量研究發(fā)現(xiàn)高劑量維C的抗癌作用初步總結(jié)1、維生素C在腫瘤治療中歷史悠久，爭議明顯（有爭議就有空間）2、高劑量維生素C是目前研究的方向（

明確用藥）3、大多數(shù)研究集中于維生素C的抗癌效果，但臨床數(shù)據(jù)不佳（單純抗癌研究無新意）4、有放化療增敏性報(bào)道（臨床意義明顯，有研究空間）高劑量維生素C的放化療增敏，為什么選擇放療？1、前列腺癌放療敏感，臨床契合度高（極其重要）應(yīng)用基礎(chǔ)研究，重在實(shí)用性、可轉(zhuǎn)化性關(guān)注集中于臨床常見問題的解決課題申請的適用性、傾向性高劑量維生素C的放化療增敏，為什么選擇放療？2、放療、化療的已有研究不對等性高劑量維生素C的放化療增敏，為什么選擇放療？3、維生素C、放療、前列腺癌，僅有一篇報(bào)道，發(fā)展空間巨大選題的基本原則針對性原則：前列腺癌放療增敏，臨床意義顯著可行性原則：實(shí)驗(yàn)室條件、時(shí)間、人力符合創(chuàng)新性原則：研究極少，創(chuàng)新性好，可塑性強(qiáng)第二步、驗(yàn)證假設(shè)選題提出功能假說功能驗(yàn)證提出機(jī)制假說機(jī)制驗(yàn)證功能驗(yàn)證高劑量維生素C在前列腺癌中的放療增敏作用實(shí)驗(yàn)方法：MTT，克隆形成實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)：前列腺癌細(xì)胞株（至少兩種以上，越多越好）前列腺上皮細(xì)胞（至少一種）治療性研究強(qiáng)烈建議有正常、異常組織對照實(shí)驗(yàn)條件：細(xì)胞密度、劑量、時(shí)間等等要素化閱讀：相關(guān)文獻(xiàn)的methods精讀高劑量維C對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷高劑量維C的放射增敏及放射保護(hù)作用放射增敏放射保護(hù)？問題一：如何定性增敏及保護(hù)？Combination

Index

(CI)問題二：藥物的評價(jià)公式是否適用于放療？文獻(xiàn)的檢索與精讀提供證據(jù)支持增敏減毒的雙重效果第三步：機(jī)制假設(shè)綜述閱讀了解研究現(xiàn)狀及相關(guān)主要機(jī)制獲取信息如下1、維生素C是公認(rèn)的抗氧化劑，但在高劑量下是促氧化劑2、高劑量維生素C主要通過產(chǎn)生過量H2O2、O2-促進(jìn)ROS水平升高1、可能的機(jī)制2、潛在的實(shí)驗(yàn)檢測指標(biāo)ROS的腫瘤致死及適應(yīng)性生存理論高劑量維生素C的潛在作用機(jī)制？評估高劑量維生素C對細(xì)胞內(nèi)H2O2水平的干預(yù)結(jié)果顯示：1、腫瘤細(xì)胞環(huán)境ROS水平明顯高于正常細(xì)胞株2、高劑量維C顯著提高了腫瘤細(xì)胞環(huán)境ROS水平，而在正常細(xì)胞提升有限機(jī)制假說驗(yàn)證評估高劑量維生素C對細(xì)胞內(nèi)O2-水平的干預(yù)機(jī)制假說驗(yàn)證分子機(jī)制探索1、文獻(xiàn)檢索，關(guān)鍵詞：氧化應(yīng)激、前列腺癌、放療抵抗RelB在前列腺癌放療抵抗中發(fā)揮重要作用RelB在前列腺癌中特異性高表達(dá)研究顯示RelB參與ROS調(diào)控誘導(dǎo)放療抵抗，是前列腺癌放療抵抗的重要機(jī)制之一新機(jī)制：維生素C對RelB的選擇性抑制1、高劑量AA抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)RelB蛋白及基因水平，但對RelA水平影響較小2、高劑量AA促進(jìn)正常細(xì)胞內(nèi)RelB蛋白及基因水平，但對RelA水平影響較小問題：為什么要測RelA？證據(jù)的嚴(yán)謹(jǐn)性：蛋白家族一定要注意同類蛋白的功能交叉，避免結(jié)果的偏倚文獻(xiàn)的充分閱讀知己知彼、百戰(zhàn)不殆問題：上述結(jié)論是否完整？不完整表達(dá)功能1、蛋白的功能一定是我們需要明確的指標(biāo)2、功能的驗(yàn)證一定要有現(xiàn)象級證據(jù)的論證新機(jī)制：維生素C對RelB的選擇性抑制高劑量AA明顯抑制癌細(xì)胞內(nèi)RelB轉(zhuǎn)錄活性（圖B），抑制RelB表達(dá)明顯提高AA的抗癌敏感性，而促進(jìn)RelB表達(dá)則明顯抑制了AA的抗癌作用（圖C)思路及數(shù)據(jù)總結(jié)AARelB ROSRelBROS放療抵抗放療增敏創(chuàng)新點(diǎn)三分文章足以，5分以上文章不足故事要講完整，情節(jié)還不夠曲折、角色結(jié)局還不清晰思路及數(shù)據(jù)總結(jié)AARelBROSRelBROS放療抵抗放療增敏？？？？線粒體下一步思路方向1、了解AA通過何種機(jī)制調(diào)控RelB2、了解AA調(diào)控RelB，隨后通過何種機(jī)制影響ROS生成（線粒體）文獻(xiàn)檢索明確方向通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)RelB的調(diào)控研究極少，且與本研究無法關(guān)聯(lián)（第一條思路從可行性角度否定，并非是現(xiàn)實(shí)否定）RelB影響ROS生成（線粒體），文獻(xiàn)報(bào)道較多，常見靶點(diǎn)MnSOD新的發(fā)現(xiàn)，AA可抑制細(xì)胞能量代謝（線粒體）思路拓展線粒體是ROS生成中心，能量代謝紊亂與氧化應(yīng)激密切相關(guān)RelB與能量代謝的研究較少，RelB與線粒體的直接研究較少我們進(jìn)一步研究目標(biāo)確認(rèn)：RelB與線粒體功能的關(guān)系A(chǔ)A與線粒體能量代謝的驗(yàn)證RelB下游信號通路的探索高劑量維生素C通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子RelB參與前列腺癌放療抵抗及正常組織放療保護(hù)。但其下游信號通路是什么？RelB通過何種機(jī)制參與線粒體功能發(fā)揮ROS調(diào)控功能呢？文獻(xiàn)檢索、文獻(xiàn)精讀尋求靈感、思路、突破口文獻(xiàn)檢索的重點(diǎn)、精讀的方向主要關(guān)鍵詞：線粒體、ROS，腫瘤泛讀到精讀的逐層篩選、排除、鑒定目標(biāo)蛋白：在功能中的代表性在領(lǐng)域中的關(guān)注性

在學(xué)術(shù)中的新穎性

與RelB之間的未知性在充足的證據(jù)支撐下，發(fā)揮想象的空間、摸索與嘗試線粒體功能蛋白SIRT家族的確定新穎度、關(guān)注度、潛在前景線粒體功能蛋白SIRT3SIRT3是維持線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵去乙?；福?/p>

可對外界應(yīng)激產(chǎn)生迅速

應(yīng)答并穩(wěn)定線粒體功能。SIRT3參與線粒體多種能量代謝途徑，包括能量代謝及ROS的清除SIRT3在腫瘤發(fā)生發(fā)展及治療抵抗中發(fā)揮重要作用高劑量AA與SIRT3與RelB類似，高劑量AA選擇性調(diào)控SIRT3基因及蛋白表達(dá)基因轉(zhuǎn)染及基因沉默技術(shù)顯示，RelB表達(dá)與SIRT3密切相關(guān)Vitamin

Chigh

ROS

levelrelB

suppressionSIRT3mitochondria

disfunctionlow

glucose

levelATP

synthesis

decreasedNAD+

regeneration

suppressed潛在機(jī)制設(shè)想NAD+respiratory

electron

chainSIRT1inactivationNormalconditionNAD+

consumption

increasedNAD+depletionRelB與SIRT3的關(guān)聯(lián)RelB是轉(zhuǎn)錄因子，SIRT3是功能蛋白，我們需要證明的就是SIRT3是否受到RelB直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控或間接調(diào)控難點(diǎn)：尋找SIRT3啟動(dòng)子序列中RelB的潛在結(jié)合點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物，驗(yàn)證設(shè)想尋找RelB潛在結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的檢測方法CHIP（文獻(xiàn)的檢索確認(rèn)其技術(shù)的先進(jìn)性和認(rèn)可度）雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（Luciferase

Assay）RNA

干擾及基因過表達(dá)技術(shù)擾動(dòng)RelB

表達(dá)，RT-PCR、Western

blot

確認(rèn)RelB

差異表達(dá)對SIRT3

基因、蛋白表達(dá)的影響Mechanismstudy-

fromRelBto

SIRT3RelBbinding

site

inSIRT3promotorregion第四步、功能及機(jī)制驗(yàn)證體內(nèi)的功能及機(jī)制驗(yàn)證相比于細(xì)胞的人工環(huán)境，動(dòng)物模型的生物環(huán)境數(shù)據(jù)更有說服力體內(nèi)研究的數(shù)據(jù)是提升文章邏輯性、科學(xué)性的重要部分參考高質(zhì)量文章的動(dòng)物建模、藥物劑量、數(shù)據(jù)測定、統(tǒng)計(jì)方法、評價(jià)體系，減少工作的失誤動(dòng)物模型的借鑒數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)方法的參考動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)顯示相比單純治療組，AA聯(lián)合IR組生存期顯著延長動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證AA調(diào)控RelB-SIRT3信號通路參與腫瘤放療增敏及正常組織放療保護(hù)第五步：學(xué)習(xí)高質(zhì)量文