2010年微生物限度檢查法修訂課件

2010年微生物限度檢查法修訂2010年版微生物限度檢查法

增修訂內容簡介——以《中國藥典》一部為例2010年微生物限度檢查法修訂一、增加的內容1、增加了貼劑的微生物檢查方法檢查方法：取規(guī)定量供試品，去掉貼劑的保護層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有滅活劑（如聚山梨酯80或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30分鐘，或以其他方法制備成供試液。貼膏劑應采用薄膜過濾法進行細菌、霉菌及酵母菌計數。2010年微生物限度檢查法修訂2、增加了計數培養(yǎng)基的適用性檢查細菌、霉菌及酵母菌計數用的培養(yǎng)基應進行培養(yǎng)基的適用性檢查，包括成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應檢查。2010年微生物限度檢查法修訂2、增加了計數培養(yǎng)基的適用性檢查適用性檢查：取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置30～35℃培養(yǎng)48hr，計數；取白色念珠菌、黑曲霉各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置20～25℃培養(yǎng)72hr，計數；取白色念珠菌50～100cfu，注入無菌平皿中，立即傾注酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個平皿，混勻，凝固，置20～25℃培養(yǎng)72hr，計數。同時，用對應的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。2010年微生物限度檢查法修訂2、增加了計數培養(yǎng)基的適用性檢查結果判定：被檢培養(yǎng)基的菌落數與對照培養(yǎng)基菌落數相比大于70%，且菌落形態(tài)大小應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。2010年微生物限度檢查法修訂3、增加了菌液使用時間的有關規(guī)定菌懸液制備后應在2小時內使用，若保存在2～8℃的菌懸液可以在24小時內使用。黑曲霉也可制成穩(wěn)定的孢子懸液保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內替代對應量的新鮮孢子懸液使用。2010年微生物限度檢查法修訂4、刪除了離心沉淀集菌法原因：由三個所組成的課題組進行了離心沉淀集菌法的標準化研究，結果表明：離心沉淀集菌法對試驗菌的損傷較大。2010年微生物限度檢查法修訂5、增加了常見干擾物的中和劑或滅活方法微生物限度檢查法.pdf2010年微生物限度檢查法修訂6、增加了沒有辦法消除供試品中的抑菌作用的情況及相關規(guī)定若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用，那么驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的，同時表明該供試品不能被試驗菌污染。然而，供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據供試品須符合的微生物限度標準和菌數報告規(guī)則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗。2010年微生物限度檢查法修訂6、增加了沒有辦法消除供試品中的抑菌作用的情況及相關規(guī)定計數方法驗證時，若采用上述計數方法總存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求，那么選擇回收情況最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢測。2010年微生物限度檢查法修訂7、細菌、霉菌及酵母菌計數檢查

增加了陽性對照陽性對照除另有規(guī)定外，抗真菌供試品以白色念珠菌為對照菌，其它供試品以金黃色葡萄球菌為對照菌，按供試品的細菌（霉菌和酵母菌）計數方法，測定試驗菌在該供試品中的回收率?；厥章蕬恍∮?0％。否則實驗結果無效，應重新確定計數方法。2010年微生物限度檢查法修訂8、增加了薄膜過濾法每張濾膜

沖洗量的規(guī)定每張濾膜每次沖洗量不超過100ml，總沖洗量不得超過1000ml濾膜直徑一般為50mm，若采用其它直徑的濾膜，沖洗量應進行相應的調整。2010年微生物限度檢查法修訂9、增加了選擇濾膜材質的原則

選擇濾膜材質時應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。2010年微生物限度檢查法修訂10、增加了控制菌檢查用培養(yǎng)基

的適用性檢查

控制菌檢查用的培養(yǎng)基應進行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應檢查。檢查項目包括培養(yǎng)基的促生長、指示和抑制特性能力。微生物限度檢查法.pdf2010年微生物限度檢查法修訂10、增加了控制菌檢查用培養(yǎng)基

的適用性檢查增菌培養(yǎng)基促生長能力檢查：分別接種不大于100cfu的試驗菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌應生長良好。2010年微生物限度檢查法修訂10、增加了控制菌檢查用培養(yǎng)基

的適用性檢查固體培養(yǎng)基促生長能力檢查：取試驗菌各0.1ml（50～100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板中，每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，計數。被檢培養(yǎng)基的菌落數與對照培養(yǎng)基菌落數相比應不小于70%，且生長的菌落形態(tài)應一致。2010年微生物限度檢查法修訂10、增加了控制菌檢查用培養(yǎng)基

的適用性檢查培養(yǎng)基抑制能力檢查：劃線接種試驗菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基平板上，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度和時間下培養(yǎng)，試驗菌應不得生長。2010年微生物限度檢查法修訂10、增加了控制菌檢查用培養(yǎng)基

的適用性檢查培養(yǎng)基指示能力檢查：分別接種少量試驗菌（見表2）于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度和時間下培養(yǎng)。被檢培2010年微生物限度檢查法修訂11、增加了白色念珠菌控制菌檢查主要針對婦女陰道用藥，為保證其安全性而增加。檢查法：取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、10cm2）直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48小時。取上述培養(yǎng)物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～48小時（必要時延長至72小時）。2010年微生物限度檢查法修訂11、增加了白色念珠菌控制菌檢查白色念珠菌在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變深、質地變硬或有皺摺。若平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如平板上生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應挑選2～3個菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24～48小時（必要時延長至72小時）。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品未檢出白色念珠菌。若平板上生長的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于1%吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48小時。取培養(yǎng)物進行染色，鏡檢及芽管試驗。2010年微生物限度檢查法修訂11、增加了白色念珠菌控制菌檢查芽管試驗挑取1%吐溫80玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內，置35～37℃、1～3h，置顯微鏡下觀察，可見到由孢子長出短小芽管。若上述疑似菌為非革蘭陽性菌，顯微鏡未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。2010年微生物限度檢查法修訂二、修訂內容1、修訂了控制菌培養(yǎng)溫度控制菌培養(yǎng)溫度由35～37℃修訂為30～35℃。此項修訂不妥，原因：2010版控制菌增加了白色念珠菌，此菌為酵母菌，培養(yǎng)溫度為23～28℃。2010年微生物限度檢查法修訂2、刪除了控制菌檢查驗證方法中

陰性菌對照組試驗試驗表明：陰性菌對照組實踐意義不大2010年微生物限度檢查法修訂3、修訂了菌數報告規(guī)則

細菌、酵母菌宜選取細菌、酵母菌平均菌落數（在30～300之間）小于300cfu、霉菌宜選取平均菌落數（在30～100之間）小于100cfu的稀釋級，作為菌數報告（取兩位有效數字）的依據。以最高的平均菌落數乘以稀釋倍數的值報告1g、1mL或10cm2供試品中所含的菌數。微生物限度檢查法.pdf

2010年微生物限度檢查法修訂4、修訂了菌落培養(yǎng)和計數時間

培養(yǎng)和計數除另有規(guī)定外，細菌培養(yǎng)48小時3天，逐日點計菌落數，一般以48小時3天的菌落數報告；霉菌、酵母菌培養(yǎng)72小時5天，逐日點計菌落數，一般以72小時5天的菌落數報告；必要時，可適當延長培養(yǎng)時間至5～7天進行菌落計數并報告。2010年微生物限度檢查法修訂5、刪除了庖肉培養(yǎng)基增加：梭菌增菌培養(yǎng)基

沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基

沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基念珠菌顯色培養(yǎng)基(CHROMAGAR)

玉米-吐溫80瓊脂培養(yǎng)基2010年微生物限度檢查法修訂6、微生物限度標準修訂內容6.1含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑修訂為含豆豉、神曲等發(fā)酵成