《干細胞體內(nèi)近紅外二區(qū)示蹤成像操作規(guī)程》

ICS11.100

CCSC27

團體標(biāo)準(zhǔn)

T/XXXXX00XX—2023

干細胞體內(nèi)近紅外二區(qū)示蹤成像操作規(guī)程

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（征求意見稿）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

發(fā)布

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干細胞體內(nèi)近紅外二區(qū)示蹤成像操作規(guī)程

1范圍

本文件確立了干細胞體內(nèi)近紅外二區(qū)示蹤成像的操作程序，規(guī)定了操作中使用的試劑材料與儀器設(shè)

備，干細胞體內(nèi)近紅外二區(qū)示蹤成像操作程序的構(gòu)成，以及各步驟的操作指示和各步驟之間的轉(zhuǎn)換條件，

描述了干細胞體內(nèi)近紅外二區(qū)示蹤成像的追溯方法。

本文件適用于干細胞小鼠體內(nèi)近紅外二區(qū)示蹤成像試驗。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489—2008實驗室生物安全通用要求

HJ421醫(yī)療廢物專用包裝袋、容器和警示標(biāo)志標(biāo)準(zhǔn)

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4符號和縮略語

下列符號和縮略語適用于本文件。

CAS：美國化學(xué)文摘服務(wù)社（ChemicalAbstractsService）

CCK-8：細胞試劑（CellCountingKit-8）

DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)

FLI：熒光成像（fluorescenceimaging）

FBS：胎牛血清（fetalcalfserum）

PBS：磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebufferedsaline）

PbS：硫化鉛（leadsulfide）

Rnase—A：核糖核酸酶A(RibonucleaseA)

Sulfo—SMCC：4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽

（4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylicacid3-sulfo-N-hydroxysuccinimideester

sodiumsalt）

α-MEM：α最低必須培養(yǎng)基（alphaminimalessentialmedium）

5試劑材料與儀器設(shè)備

1

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5.1試劑材料

5.1.1除非另有說明，本試驗所有試劑應(yīng)符合制造商認(rèn)證的細胞培養(yǎng)等級。其他試劑應(yīng)選盡可能高的

純度。

5.1.2本試驗所用的水應(yīng)為電阻率大于5MΩ?cm的純水。其他試劑材料應(yīng)符合表1的要求。

表1試劑材料清單

序號試劑材料名稱用途濃度配比要求調(diào)配方法

1Ⅱ型膠原酶細胞培養(yǎng)0.03g/mlCASNo:9001-12-1

1000mg/LD-葡萄糖，

292mg/LL-谷氨酰胺，

2α—MEM培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)/110mg/L丙酮酸鈉，

2200mg/L碳酸氫鈉，

pH值7.0～7.4

3胎牛血清細胞培養(yǎng)0.02g/ml

4青霉素（PNC）細胞培養(yǎng)100U/ml

5鏈霉素（SM）細胞培養(yǎng)100U/ml

6胰蛋白酶細胞培養(yǎng)2mg/ml

7地塞米松細胞培養(yǎng)0.1μmol/L

維生素C磷酸細胞培養(yǎng)50μmol/L

8

鹽

9β--磷酸甘油細胞培養(yǎng)10mmol/L

3--異丁基--1--細胞培養(yǎng)0.5mmol/L

10

甲基黃嘌呤

11胰島素細胞培養(yǎng)10μmol/L

12鈣黃綠素細胞活性檢測2μmmol/L

13碘化丙啶細胞周期測試8μmmol/L

14油紅O染液染色5mg/ml

15硫代硫酸鈉量子點合成10mmol/L

16醋酸鉛Pb（ACO2）量子點合成10mmol/L

17硫化鈉（Na2S）量子點合成10mmol/L

18氫氧化鈉（NaOH）量子點合成1/6mol/L

19Rnase--A酶細胞標(biāo)記50mg/ml

20穿膜肽Tat化學(xué)交聯(lián)10mg/ml

21Sulfo--SMCC染色1mg

22DAPI染液穩(wěn)定性試驗5mg/ml

23酒精消毒75%醫(yī)用酒精

24CCK--8試劑盒細胞增值能力測試/

堿性磷酸酶檢測細胞成骨誘導(dǎo)分化測試/

25

試劑盒

26小鼠細胞提取與動物模型建立/近交系，6周齡以上

5.2儀器設(shè)備

2

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儀器設(shè)備的用途及要求應(yīng)符合表2的規(guī)定。

表2儀器設(shè)備清單

序號儀器設(shè)備名稱用途要求

1制冰機細胞試驗雪花樣冰

2自動酶標(biāo)儀細胞試驗200nm～1000nm全波長

3常溫離心機量子點合成3000rpm/min

4電子天平量子點合成精度0.0001g

5脫色搖床細胞標(biāo)記轉(zhuǎn)速0rpm～240rpm，定時范圍＞24h

6高壓蒸汽滅菌器細胞培養(yǎng)、動物試驗121℃，103.4kPa

7細胞培養(yǎng)箱細胞培養(yǎng)培養(yǎng)條件：37℃，CO25%

8流式細胞儀細胞試驗熒光分辨率2%

9熒光倒置顯微鏡細胞試驗配備汞燈

近紅外熒光倒置顯微鏡細胞試驗配備808nm激發(fā)光源、1250nm長通或1300nm帶通濾

10

光片

環(huán)形聚焦單模微波合成系統(tǒng)量子點合成反應(yīng)參數(shù)：70℃，30s

11

微波反應(yīng)器

小動物近紅外活體成像系統(tǒng)小動物活體成像配備808nm激發(fā)光源、1250nm長通或1300nm帶通濾

12

光片

電感耦合等離子體發(fā)射光譜量子點理化特性測量波長：200nm～1500nm

13

儀

6干細胞體內(nèi)近紅外二區(qū)示蹤成像程序的構(gòu)成

干細胞體內(nèi)近紅外二區(qū)示蹤成像程序包括間充質(zhì)干細胞提取、間充質(zhì)干細胞檢驗、近紅外PbS量子

點的制備（以下簡稱“量子點制備”）、曝光觀察、近紅外PbS量子點標(biāo)記間充質(zhì)干細胞（以下簡稱“細

胞標(biāo)記”）、近紅外PbS量子點標(biāo)記后間充質(zhì)干細胞體外成像（以下簡稱“體外成像”）、近紅外PbS

量子點與間充質(zhì)干細胞的生物相容性測試（以下簡稱“生物相容性測試”）、近紅外PbS量子點標(biāo)記間

充質(zhì)干細胞的穩(wěn)定性和靈敏性（以下簡稱“穩(wěn)定性和靈敏性測試”）、制作小鼠岡上肌腱撕裂模型（以

下簡稱“動物模型建立”）、活體成像10個階段。程序流程圖如圖1所示。

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圖1干細胞體內(nèi)近紅外二區(qū)示蹤成像程序流程圖

7干細胞體內(nèi)近紅外二區(qū)示蹤成像

7.1間充質(zhì)干細胞的提取

7.1.1近紅外二區(qū)示蹤成像體內(nèi)觀測使用的間充質(zhì)干細胞可為商用間充質(zhì)干細胞或自行提取的間充質(zhì)

干細胞。

7.1.2自行從小鼠四肢長骨骨實質(zhì)中提取間充質(zhì)干細胞的操作方法如下：

a)取6周齡至8周齡的BALB/c小鼠，頸椎脫臼處死小鼠后，完全浸泡在75%酒精中消毒5min；

b)分離出小鼠肱骨、股骨和脛骨，去除長骨上的肌肉及其附著組織；

c)保留肱骨、股骨和脛骨的骨干，去除干骺端，用含有2%FBS的α—MEM培養(yǎng)基（以下簡稱培

養(yǎng)基）反復(fù)沖洗骨髓腔三遍以上去除造血干細胞；

33

d)沖洗后的骨干剪碎成1mm～3mm細小骨片，用3%的Ⅱ型膠原酶消化60min；

2

e)用含有2%FBS的α—MEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗細小骨片去除Ⅱ型膠原酶，然后將骨片種植到25cm

培養(yǎng)瓶中，加入間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)體系；

f)所有細胞在37℃，5%CO2和飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長至70%～80%匯合時，

0.25%胰酶消化傳代。留取第三代細胞（P3）備用。

7.1.3只準(zhǔn)許符合下列要求的間充質(zhì)干細胞用于量子點標(biāo)記。

a)為自然貼壁生長，形態(tài)為梭形，-80℃冷凍保存的細胞需復(fù)蘇使用。

b)活力良好（95%以上），增值能力，分化能力（成脂、成骨）正常。

7.1.4提取的間充質(zhì)干細胞若不滿足7.1.3要求，應(yīng)按7.1.2步驟重新提取或重新購買商用間充質(zhì)干

細胞

7.2量子點的制備

近紅外二區(qū)PbS量子點制備的操作方法如下：

4

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a)將500μl的10mmol/LPb(ACO2)2溶液加入10ml可微波試管中，隨后加入50mg/mlRnase

—A溶液500μl，吹打混勻。再加入1/6mol/LNaOH溶液30μl～33μl（確保體系的pH在9～

11的范圍內(nèi)），吹打混勻，得到澄清的反應(yīng)母液；

c)在反應(yīng)母液中加入50μl的10mmol/LNa2S溶液后，放入功率為30W、動態(tài)模式（dynamic

model），溫度為70℃的微波反應(yīng)器中30s；

7.3曝光觀察

7.3.1將合成的PbS量子點放入小動物近紅外活體成像系統(tǒng)中，采用808nm激光光源激發(fā)，1100nm

長通濾光片，曝光時間為30ms觀察樣品熒光。

7.3.2當(dāng)樣品熒光在曝光時間小于30ms時達到過曝狀態(tài)，即可進行細胞標(biāo)記。

7.3.3若不滿足7.3.2要求，應(yīng)返回7.2重新進行PbS量子點制備。

7.4細胞標(biāo)記

7.4.1進行PbS量子點標(biāo)記間充質(zhì)干細胞操作方法如下：

a)將1mg的Sulfo—SMCC和1mg的PbS量子點加入到1mlPBS緩沖液（PH7.4）中，使用脫

色搖床在室溫下以小于等于60rpm的轉(zhuǎn)速反應(yīng)2h后，用常溫離心機在室溫下，3500rpm透

析離心10min，去除多余的Sulfo—SMCC；

b)PbS量子點與穿膜肽Tat以1:1000比例混合，使用脫色搖床在室溫下以小于等于60rpm的轉(zhuǎn)

速反應(yīng)1.5h后，在4℃保存10h以上；

c)過夜后經(jīng)3500rpm室溫透析離心10min，去除多余的穿膜肽Tat；

d)收集P3間充質(zhì)干細胞；

e)穿膜肽Tat連接的PbS量子點（10μg/ml）加入到間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基中，37℃孵育12h；

f)棄去原培養(yǎng)基，PBS反復(fù)清洗細胞，去除未結(jié)合的PbS量子點，直至在清洗液中檢測不到近紅

外二區(qū)熒光信號。

g)細胞懸液在37℃，5%CO2和飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細胞12h后方可進行體外成像。

7.4.2Pb(ACO2)2、Na2S和Rnase-A酶在微波作用下合成的PbS量子點，應(yīng)在808nm激光光源激發(fā)和

1100nm長通濾光片的條件下發(fā)出明亮熒光，該熒光位于近紅外二區(qū)波段（見圖2）。

圖2PbS量子點的白光和近紅外二區(qū)熒光圖像示意圖

7.5體外成像

5

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7.5.1進行近紅外二區(qū)PbS量子點標(biāo)記后的間充質(zhì)干細胞體外成像的操作方法如下：

a)吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，向PbS量子點標(biāo)記的間充質(zhì)干細胞中加入4%多聚甲醛，室溫下固定

10min；

b)吸去多聚甲醛，用PBS反復(fù)清洗三遍去除剩余多聚甲醛，加入DAPI染色液，室溫等待10min。

c)PBS反復(fù)清洗三遍，去除多余DAPI染色液，在配有近紅外二區(qū)波段的熒光顯微鏡下觀察細胞

質(zhì)的熒光；

7.5.2被標(biāo)記的間充質(zhì)干細胞的白光、近紅外二區(qū)熒光、DAPI熒光和疊加的顯微圖像參見圖3，標(biāo)尺

為20μm。

圖3被標(biāo)記的間充質(zhì)干細胞的顯微圖像示意圖

7.5.3只準(zhǔn)許在細胞質(zhì)中觀察到均勻的近紅外二區(qū)熒光信號才能進行生物相容性測試，否則按7.4重

新進行細胞標(biāo)記。

7.6生物相容性測試

7.6.1按照7.4至7.5的方法分別用0與10μg/ml的PbS量子點標(biāo)記間充質(zhì)干細胞后，應(yīng)按以下步

驟進行近紅外二區(qū)PbS量子點與間充質(zhì)干細胞的生物相容性測試。

a)細胞活力測試：

1)吸去培養(yǎng)基，PBS清洗3次貼壁間充質(zhì)干細胞，去除多余培養(yǎng)基；

2)向培養(yǎng)皿加入2μmmol/l的鈣黃綠素和8μmmol/l的碘化丙啶。染液沒過單層細胞，37℃

孵育30min；

3)PBS反復(fù)清洗三遍，熒光顯微鏡下觀察間充質(zhì)干細胞，記錄活細胞比例，綠染為活細胞，

紅染為死細胞。

b)細胞增殖能力測試：

3

1)在24孔板中接種間充質(zhì)干細胞懸液（2×10/孔），按培養(yǎng)基與CCK-8溶液10:1的比例，

將CCK—8溶液加入至24孔板中。

2)將24孔板在細胞培養(yǎng)箱中孵育2h，測定細胞在450nm處的吸光度。在PbS量子點標(biāo)記

細胞后的第1d、3d、5d、7d、9d、11d、15d和17d重復(fù)b)操作以觀察標(biāo)記后不

同時間點的細胞增殖能力。

c)細胞周期測試：

6

1)在PbS量子點標(biāo)記細胞后的第2d收集細胞懸液，至少5×10個細胞；

2)將收集的細胞固定在冰浴預(yù)冷的70%乙醇中，在4℃的溫度下保存10h以上；

6

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3)1000g離心3min，沉淀間充質(zhì)干細胞，小心吸出上清，PBS清洗間充質(zhì)干細胞兩次；

4)每管細胞樣品中加入0.5ml碘化丙啶染色液，重懸細胞沉淀，避光溫浴30min后，用流

式細胞儀檢測細胞周期。

d)細胞自我更新能力測試：

2

1)將PbS量子點標(biāo)記的細胞用間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基稀釋，按照10個細胞/cm的密度接種在

六孔板；

2)接種14d后，PBS清洗貼壁細胞，4%多聚甲醛室溫固定10min；

3)蒸餾水清洗5次，結(jié)晶紫染液室溫染色15min，PBS清洗細胞兩次，計數(shù)每組的細胞集落

數(shù)目。

e)油紅染色細胞成脂誘導(dǎo)分化測試：

1)收集不同濃度的PbS量子點標(biāo)記的間充質(zhì)干細胞，添加成脂誘導(dǎo)體系；

2)在誘導(dǎo)培養(yǎng)第14d，PBS清清洗貼壁細胞，加入洗貼壁細胞，加入0.5%的油紅染液，避

光孵育20min；

3)吸出染液，PBS反復(fù)清洗細胞；

4)顯微鏡下拍照。

f)堿性磷酸酶染色細胞成骨誘導(dǎo)分化測試：

1)收集不同濃度的PbS量子點標(biāo)記的間充質(zhì)干細胞，添加成骨誘導(dǎo)體系；

2)在誘導(dǎo)培養(yǎng)第14d，PBS清洗貼壁細胞，4%多聚甲醛室溫固定10min；

3)吸出固定液，滴加配置好的堿性磷酸酶孵育液，避光孵育20min；

4)吸出染液，PBS反復(fù)清洗細胞，顯微鏡下拍照。

7.6.2進入穩(wěn)定性和靈敏性檢測的PbS量子點標(biāo)記的間充質(zhì)干細胞，應(yīng)符合下例條件：

a)細胞活力、增值能力、周期、自我更新能力測試與對照組之間沒有明顯差異；

b)油紅染色顯示各組細胞出現(xiàn)大量脂滴，脂滴連接成環(huán)狀，脂環(huán)大小與對照組之間沒有明顯差異；

c)各組細胞堿性磷酸酶染色均為陽性，著色率與對照組之間沒有明顯差異。

7.6.37.6.2中a）、b）、c）各項中描述的細胞指標(biāo)與對照組之間的比較應(yīng)按以下步驟進行：

a)將近紅外二區(qū)量子點標(biāo)記后的細胞各項參數(shù)與未標(biāo)記的對照組細胞各項參數(shù)用T檢

驗和秩和檢驗進行比較，包括活力，增值能力，分化能力等。

b)當(dāng)計量資料符合正態(tài)分布時，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，否則用中位數(shù)表示；計數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)表

示。多組計量資料之間的兩兩比較采用T檢驗。計數(shù)資料的總體分布未知時，采用秩和檢驗。

采用統(tǒng)計產(chǎn)品與服務(wù)解決方案（SPSS）23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，當(dāng)P＜0.05時，差異具有

統(tǒng)計學(xué)意義。

c)若SPSS軟件測定出P＞0.05，則表明標(biāo)記后細胞性能未受影響，可進行體內(nèi)成像試驗；若P

≤0.05，則需重新測量，最多進行3次測量，若3次測量P均小于等于0.05，則返回7.5重

做。

7.6.4按7.6.3比較后，細胞指標(biāo)若不滿足7.6.2各項要求，則重新進行7.6.1各步驟。7.6.1的試

驗最多重復(fù)進行三次，若三次都不滿足7.6.2要求，則應(yīng)返回到7.5重新進行體外成像。

7.7穩(wěn)定性和靈敏性測試

7.7.1PbS量子點標(biāo)記的間充質(zhì)干細胞體外穩(wěn)定性測試應(yīng)按以下步驟進行：

a)在細胞遷移小室（transwell）上室與下室之間隔一層孔徑8μm，僅允許PbS量子點穿過，間

充質(zhì)干細胞不能通過的多孔濾膜；

33

b)將PbS量子點標(biāo)記的1×10間充質(zhì)干細胞接種在transwell上室，未標(biāo)記的1×10間充質(zhì)干

細胞接種在transwell下室；

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c)接種后的第1d、3d、5d、7d收集細胞，并按7.5.1步驟進行DAPI染色與成像：

7.7.2PbS量子點標(biāo)記的間充質(zhì)干細胞體內(nèi)靈敏度和穩(wěn)定性測試應(yīng)按以下步驟進行：

33345

a)PbS量子點標(biāo)記的不同數(shù)量的間充質(zhì)干細胞（1×10、2×10、5×10、2×10和2×10）皮下

移植在裸鼠背部；

b)在移植后的第1d、7d、14d、21d和28d對裸鼠進行近紅外二區(qū)活體成像，采用808nm

激光光源激發(fā)，1100nm長通濾光片，曝光時間為100ms，觀察各組細胞熒光情況；

c)用ImageJ軟件測定熒光強度，評估移植后第1天細胞數(shù)量與近紅外二區(qū)熒光強度的相關(guān)性。

7.7.3只準(zhǔn)許體外細胞標(biāo)記穩(wěn)定性良好，下室未觀察到熒光信號，體內(nèi)成像靈敏度達1×103個細胞，

且至少7天穩(wěn)定成像后方可進行活體成像。

7.7.4PbS量子點標(biāo)記的間充質(zhì)干細胞若不滿足7.7.3的要求，則從7.7重新開始測試，若重新測試

三次仍不能滿足7.7.3的要求，則返回7.4。

7.8動物模型建立

7.8.1制備小鼠岡上肌腱撕裂動物模型步驟如下：

a)麻醉小鼠后，用碘伏消毒手術(shù)側(cè)整個前肢；

b)在小鼠肩關(guān)節(jié)外側(cè)行一個約10mm的橫形切口，暴露三角??；

c)根據(jù)肌肉上的血管辨認(rèn)肌肉邊緣（參見圖4）；

d)切開三角肌，外展外旋肩關(guān)節(jié)，暴露岡上?。▍⒁妶D5）；

圖4三角肌肌肉邊界示意圖

圖5岡上肌示意圖

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e)辨認(rèn)岡上肌腱，用5-0縫線游離岡上肌（參見圖6）；

圖65-0Prolene縫線游離岡上肌示意圖

f)8-0縫線對岡上肌腱進行改良編織縫合（參見圖7）；