OPA-FMOC聯(lián)用柱前衍生化法氨基酸類成分測(cè)定原理及其在藥物分析中的應(yīng)用

OPA-FMOC聯(lián)用柱前衍生化法氨基酸類成分測(cè)定原理及其在藥物分析中的應(yīng)用氨基酸類成分分析方法——柱前衍生化法介紹Contents衍生化反應(yīng)概述及原理1流動(dòng)相及衍生試劑的配制2自動(dòng)化衍生過(guò)程3應(yīng)用實(shí)例4試驗(yàn)注意事項(xiàng)5衍生化反應(yīng)概述及原理由于大多數(shù)氨基酸缺乏天然的紫外或熒光吸收，因此通常的做法是進(jìn)行衍生化處理。柱后衍生化該方法多用于離子交換色譜，先通過(guò)陽(yáng)離子交換樹脂分離，然后再用茚三酮衍生化，在可見(jiàn)光區(qū)檢測(cè)。衍生化法柱前衍生化該方法多用于液相色譜，先用衍生試劑與氨基酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)，然后再用紫外或熒光檢測(cè)器檢測(cè)。柱后衍生化法1951年Moore和Stein研制出了第一臺(tái)氨基酸分析儀，將未衍生的氨基酸用離子交換色譜分離后，用茚三酮進(jìn)行柱后衍生，在可見(jiàn)光區(qū)檢測(cè)。1958年由Beckman開發(fā)并推出了全自動(dòng)分析儀。新一代的氨基酸分析儀已將分析時(shí)間縮短到大約110分鐘。但是，因?yàn)樾枰獙ｉT的儀器，且儀器價(jià)格昂貴，這大大限制了該方法的推廣應(yīng)用。德國(guó)曼默博爾公司A300全自動(dòng)氨基酸分析儀參考價(jià)：約100萬(wàn)RMB柱前衍生化法2,4-二硝基氟苯(FDNB)法6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC)法鄰苯二甲醛(OPA)法異硫氰酸苯酯(PITC)衍生法丹酰氯(Dan-Cl)法氯甲酸芴甲酯(FMOC)法柱前衍生試劑種類較多，且各方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)，還沒(méi)有一種很完善的柱前衍生試劑?，F(xiàn)在大多以O(shè)PA法、FMOC法和AQC法為主。柱前衍生化法OPA柱前衍生化法原理：OPA在3-巰基丙酸的存在下與氨基酸反應(yīng)優(yōu)點(diǎn)：過(guò)量衍生試劑不干擾檢測(cè)

缺點(diǎn)：1、不能與二級(jí)氨基酸（如脯氨酸）反應(yīng)2、衍生試劑本身不穩(wěn)定，易氧化變質(zhì)338nm處無(wú)吸收在338nm處有吸收1971年由Roth首次提出用OPA對(duì)氨基酸進(jìn)行柱前衍生FMOC柱前衍生化法原理：優(yōu)點(diǎn)：可同時(shí)與一級(jí)和二級(jí)氨基酸反應(yīng)

缺點(diǎn)：衍生試劑本身（FMOC-Cl）及其水解產(chǎn)物（FMOC-OH）對(duì)檢測(cè)有干擾

266nm處有吸收262nm處有吸收OPA-FMOC聯(lián)用柱前衍生化法讓樣品先與OPA試劑充分反應(yīng)，將一級(jí)氨基酸全部反應(yīng)完全，接著樣品中剩余的二級(jí)氨基酸再與FMOC反應(yīng)。由于FMOC、FMOC衍生物和反應(yīng)副產(chǎn)物比任何OPA衍生物的疏水性都強(qiáng)，所以它們不會(huì)干擾任何一級(jí)氨基酸的檢測(cè)。因?yàn)橹挥袔追NFMOC衍生物，所以可以使用簡(jiǎn)單的梯度將這些氨基酸與反應(yīng)副產(chǎn)物和FMOC分離。1986年惠普/安捷倫將OPA和FMOC衍生反應(yīng)依次結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了氨基酸的全自動(dòng)衍生、色譜分離和檢測(cè)。OPA-FMOC聯(lián)用柱前衍生化法流動(dòng)相及衍生試劑的配制流動(dòng)相的配制

衍生試劑的配置

衍生試劑可以從安捷倫公司直接購(gòu)買，1mL安瓿瓶包裝，即開即用，不需要做其他處理，但價(jià)格較為昂貴；自行配制時(shí)，因衍生反應(yīng)純度要求較高，需購(gòu)買Sigma原裝試劑，包括OPA(鄰苯二甲醛)、FMOC-Cl(芴甲氧酰氯)和MPA(3-巰基丙酸)。流動(dòng)相的配制流動(dòng)相用HAc調(diào)節(jié)PH值至7.20±0.05

0.02MNaAc2LTHF7mLTEA400uL0.02MNaAc200mLACN400mLMeOH400mLA相B相PH值是試驗(yàn)最關(guān)鍵的影響因素試劑配制試劑配制OPA：20mg硼酸緩沖液：1.75mLACN：0.25mLMPA：32uLText0.4M硼酸緩沖鹽取一定量硼酸，用水溶解，再用40%NaOH溶液調(diào)PH值至10.2OPA試劑FMOC試劑FMOC：20mgACN：4mL柱前自動(dòng)衍生過(guò)程從1號(hào)瓶中吸取0uL水純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動(dòng)衍生過(guò)程從3號(hào)瓶中吸取5uL硼酸鈉-氫氧化鈉緩沖液衍生反應(yīng)所需的環(huán)境，PH值在10.5左右純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動(dòng)衍生過(guò)程從1號(hào)瓶中吸取0uL水純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動(dòng)衍生過(guò)程從4號(hào)瓶吸取1uLOPA試劑純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動(dòng)衍生過(guò)程從1號(hào)瓶中吸取0uL水純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動(dòng)衍生過(guò)程從6號(hào)瓶吸取樣品1uL，充分混合約2min純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動(dòng)衍生過(guò)程從1號(hào)瓶中吸取0uL水純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動(dòng)衍生過(guò)程從5號(hào)瓶抽取FMOC試劑1uL，充分混合約2min純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動(dòng)衍生過(guò)程從1號(hào)瓶中吸取0uL水純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品柱前自動(dòng)衍生過(guò)程從2號(hào)瓶吸取水32uL，以最大速度充分混合3次，然后進(jìn)樣純水純水硼酸鹽OPAFMOC樣品應(yīng)用實(shí)例注射液中氨基酸含量的測(cè)定清開靈參麥得力生丹紅色譜柱及流動(dòng)相梯度色譜柱：AgilentSB-C18柱（4.6mm×250mm,5um）時(shí)間(min)流動(dòng)相B（%）流速（ml·min-1）0.001.012.0221.015.0221.030.0701.035.0701.038.01001.549.01001.552.001.0流動(dòng)相梯度：每次實(shí)驗(yàn)前要根據(jù)實(shí)際情況，對(duì)梯度進(jìn)行微調(diào)樣品配制氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

精密稱取各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品5-10mg，一起置入容量瓶中，用1%鹽酸溶液溶解，并定容至100mL。用0.45um針頭濾器濾過(guò)，即得。游離氨基酸供試液的配制

取各注射劑原液，直接用0.45um針頭濾器濾過(guò)，即得。水解氨基酸供試液的配制

取各注射液1mL于帶蓋試管中，加入6mol/L鹽酸溶液9mL，充氮?dú)夥饪?，蓋緊瓶蓋，置于110℃恒溫干燥箱中水解24h，取出后將樣品倒入蒸發(fā)皿中，70℃水浴中蒸干，然后加入1%鹽酸溶液2mL，超聲10min，用0.45um針頭濾器濾過(guò)，即得。標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖注：1ASP天冬氨酸；2GLU谷氨酸；3ASN天冬酰胺；4SER絲氨酸；5GLY甘氨酸；6THR蘇氨酸；7CYS胱氨酸；8ALA丙氨酸；9ARG精氨酸；10TYR酪氨酸；11MET蛋氨酸；12VAL纈氨酸；13TRY色氨酸；14PHE苯丙氨酸；15ILE異亮氨酸；16LEU亮氨酸；17LYS賴氨酸；18PRO脯氨酸精密度考察結(jié)果顯示混合標(biāo)準(zhǔn)品精密度良好穩(wěn)定性考察分別測(cè)定了放置0h、2h、4h、8h、12h、24h后混合標(biāo)準(zhǔn)品樣品，結(jié)果顯示混合標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性良好線性關(guān)系考察圖：ASP標(biāo)準(zhǔn)曲線（濃度范圍：0.0036～0.1078mg/ml）考察了從混合標(biāo)準(zhǔn)品母液一直到稀釋30倍的一系列樣品，結(jié)果顯示，各氨基酸在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。廠家一清開靈樣品色譜圖游離氨基酸水解氨基酸廠家清開靈樣品色譜圖游離氨基酸水解氨基酸得力生樣品色譜圖游離氨基酸水解氨基酸丹紅樣品色譜圖游離氨基酸水解氨基酸參麥樣品色譜圖游離氨基酸水解氨基酸各注射液氨基酸樣品測(cè)定結(jié)果比較單位：mg/mL試驗(yàn)注意事項(xiàng)