2025屆高三生物一輪復(fù)習(xí)課件：基因工程

基因工程基因表達(dá)載體一輪復(fù)習(xí)課件一、基因工程及基因工程的基本工具1．基因工程的概念基因工程的別名____________技術(shù)操作環(huán)境____________操作對(duì)象基因重組DNA

生物體外操作水平____________水平基本過(guò)程剪切→________→________→表達(dá)結(jié)果人類(lèi)需要的新的生物類(lèi)型或____________優(yōu)點(diǎn)①可_____________生物的遺傳性狀；②可克服遠(yuǎn)緣雜交不親和DNA分子拼接導(dǎo)入生物產(chǎn)物定向改造原理：基因重組2．基因工程的基本操作工具原核生物磷酸二酯鍵黏性末端磷酸二酯鍵黏性末端平末端目的基因質(zhì)粒自我復(fù)制切割后產(chǎn)生末端的種類(lèi)——黏性末端和平末端。①黏性末端：是限制酶在它識(shí)別序列的中軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開(kāi)時(shí)形成的(錯(cuò)位切)，如下圖所示：②平末端：是限制酶在識(shí)別序列的中軸線切開(kāi)時(shí)形成的(平切)，如下圖所示：思考：1.在切割目的基因和載體時(shí)要求用

限制酶，目的是產(chǎn)生相同的

。同一種黏性末端2.將一個(gè)基因從DNA分子上切割下來(lái)，需要切

處，同時(shí)產(chǎn)生

個(gè)黏性末端。兩4思考：限制酶與DNA連接酶的關(guān)系(1)限制酶和DNA連接酶的作用部位都是：(2)限制酶不切割自身DNA的原因：原核生物中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾。磷酸二酯鍵項(xiàng)目種類(lèi)限制酶DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解酶)解旋酶作用底物DNA分子DNA分子

片段脫氧核苷酸

DNA分子DNA分子作用部位3.與DNA分子相關(guān)的幾種酶的比較磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵堿基對(duì)間的氫鍵磷酸二酯鍵項(xiàng)目種類(lèi)限制酶DNA連接酶DNA聚合酶解旋酶作用特點(diǎn)切割目的基因及載體，能專(zhuān)一性識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)了的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵只能將單個(gè)脫氧核苷酸添加到脫氧核苷酸鏈上將DNA兩條鏈之間的氫鍵打開(kāi)作用結(jié)果形成黏性末端或平末端形成重組DNA分子形成新的DNA分子形成單鏈DNA分子4.選擇限制酶的注意事項(xiàng)(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)。①應(yīng)選擇切割位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶。②不能選擇切割位點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶。③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖甲也可選擇用

和

兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點(diǎn))。如圖甲可選擇

。如圖甲不能選擇

。PstⅠSmaⅠPstⅠEcoRⅠ(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類(lèi)。①切割質(zhì)粒的限制酶要與切割目的基因的限制酶一致，以確保產(chǎn)生相同的黏性末端。②目的基因的表達(dá)需要調(diào)控序列，質(zhì)粒插入目的基因部位之前有啟動(dòng)子，之后需有終止子。③質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中限制酶SmaⅠ會(huì)破壞標(biāo)記基因。[考向預(yù)測(cè)]圖1表示含有目的基因D的DNA片段長(zhǎng)度(bp即堿基對(duì))和部分堿基序列，圖2表示一種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)和部分堿基序列?，F(xiàn)有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ四種限制性?xún)?nèi)切核酸酶，它們識(shí)別的堿基序列和酶切位點(diǎn)分別為C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)圖1的一條脫氧核苷酸鏈中相鄰兩個(gè)堿基之間依a次由____________________________連接。(2)若用限制酶SmaⅠ完全切割圖1中DNA片段，產(chǎn)生的末端是______末端，其產(chǎn)物長(zhǎng)度為_(kāi)_____________________________。脫氧核糖—磷酸—脫氧核糖平537bp、790bp、661bpMspⅠBamHⅠMboⅠSmaⅠC↓CGGG↓GATCC↓GATCCCC↓GGG(3)若圖1中虛線方框內(nèi)的堿基對(duì)被T—A堿基對(duì)替換，那么基因D就突變?yōu)榛騞。從雜合子中分離出圖1及其對(duì)應(yīng)的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，產(chǎn)物中共有____種不同長(zhǎng)度的DNA片段。4MspⅠBamHⅠMboⅠSmaⅠC↓CGGG↓GATCC↓GATCCCC↓GGG(4)若將圖2中質(zhì)粒和目的基因D通過(guò)同種限制酶處理后進(jìn)行連接，形成重組質(zhì)粒，那么應(yīng)選用的限制酶是______。在導(dǎo)入重組質(zhì)粒后，為了篩選出含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，一般需要用添加_______的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)檢測(cè)，部分含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株中目的基因D不能正確表達(dá)，其最可能的原因是_________

______________________________________。

BamHⅠ抗生素B向連接同種限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D與質(zhì)粒反MspⅠBamHⅠMboⅠSmaⅠC↓CGGG↓GATCC↓GATCCCC↓GGG【解析】(1)兩條脫氧核苷酸鏈之間的堿基通過(guò)氫鍵相連，一條脫氧核苷酸鏈中相鄰的堿基通過(guò)“脫氧核糖—磷酸—脫氧核糖”連接。(2)根據(jù)限制酶SmaⅠ識(shí)別的堿基序列可知，限制酶SmaⅠ切割產(chǎn)生的末端為平末端。在圖1序列中共有2個(gè)SmaⅠ的切割位點(diǎn)，切割后形成3種不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物，分別為537bp、790bp、661bp。(3)圖1中有SmaⅠ的兩個(gè)識(shí)別序列，完全切割后產(chǎn)生3個(gè)不同長(zhǎng)度的DNA片段，若虛線方框中的堿基對(duì)被T—A堿基對(duì)替換，再經(jīng)SmaⅠ識(shí)別并完全切割后會(huì)產(chǎn)生2個(gè)DNA片段，其中1個(gè)DNA片段與未替換前完全切割的相同，因此經(jīng)完全切割后共產(chǎn)生4種不同長(zhǎng)度的DNA片段。(4)切割目的基因可選用限制酶BamHⅠ和限制酶MboⅠ，但限制酶MboⅠ可將質(zhì)粒中的抗生素A抗性基因和抗生素B抗性基因都破壞，而限制酶BamHⅠ只破壞抗生素A抗性基因，因此只能選用限制酶BamHⅠ；重組質(zhì)粒中含有抗生素B抗性基因，因此可在含抗生素B的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。二、基因工程的基本操作程序及應(yīng)用1．基因工程的基本操作程序基因文庫(kù)PCR啟動(dòng)子標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化顯微注射PCR抗原—抗體雜交（我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)）2．利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因DNA半保留復(fù)制

PCR擴(kuò)增儀(PCR儀)耐高溫的DNA聚合酶4種脫氧核苷酸（2種）（DNA聚合酶需要Mg2+激活）PCR技術(shù)基本過(guò)程3’5’3’5’3’5’3’5’A.變性

當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈B.復(fù)性（退火）當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合C.延伸當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’變性復(fù)性延伸PCR技術(shù)第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪循環(huán)的產(chǎn)物完成后，常采用

來(lái)鑒定PCR的產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳（1）引物是一小段能與

的短單鏈核酸，通常為20-30個(gè)核苷酸。DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)（2）在DNA聚合酶的作用下，兩條子鏈的延伸方向都是

。引物與目的基因模板鏈的

端結(jié)合。從子鏈的5′端向3′端延伸3′【拓展練習(xí)】3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物3’5’DNA母鏈（3）PCR過(guò)程中需要加入兩種引物，原因是？（4）兩種引物的要求？（理解）DNA聚合酶只能從3′端延伸DNA鏈，不能從頭合成，用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時(shí)被擴(kuò)增。①引物自身不能環(huán)化②兩種引物之間不能互補(bǔ)配對(duì)③引物長(zhǎng)度不宜過(guò)短，防止引物隨機(jī)結(jié)合

3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——最核心步驟啟動(dòng)子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游,是

識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出

，最終獲得蛋白質(zhì)。終止子：一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的下游，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用：RNA聚合酶啟動(dòng)子、目的基因、終止子、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)mRNA

和

出含有目的基因的受體細(xì)胞。使目的基因在受體細(xì)胞中

存在,并可以

給下一代,并使目的基因能夠

和

作用。

①目的:②基因表達(dá)載體的組成：穩(wěn)定遺傳表達(dá)發(fā)揮鑒別篩選構(gòu)建過(guò)程(1)利用大腸桿菌可以生產(chǎn)出人的胰島素，聯(lián)系細(xì)胞器知識(shí)，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路，可以用大腸桿菌生產(chǎn)人的糖蛋白嗎？(2)啟動(dòng)子＝起始密碼子嗎？終止子＝終止密碼子嗎？(3)目的基因的插入位點(diǎn)是隨意的嗎？不可以。糖蛋白上有共價(jià)結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈?zhǔn)窃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成的，大腸桿菌中不存在這兩種細(xì)胞器。啟動(dòng)子是位于基因首端的一段特殊序列，它是RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合的部位。終止子是位于基因尾端的一段特殊序列，作用是使轉(zhuǎn)錄過(guò)程停止。②起始密碼子和終止密碼子位于mRNA上，分別控制翻譯過(guò)程的啟動(dòng)和終止。不是?；虮磉_(dá)需要啟動(dòng)子與終止子的調(diào)控，所以目的基因應(yīng)插入啟動(dòng)子與終止子之間深挖教材4．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程，稱(chēng)為轉(zhuǎn)化。Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體的DNA上。P81原理：花粉管通道法（我國(guó)獨(dú)創(chuàng)）②在植物授粉后一定時(shí)間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液(含目的基因）滴在花柱切面，使目的基因通過(guò)花粉管通道進(jìn)入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過(guò)花柱直通胚囊。方法：實(shí)例：我國(guó)“轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉”5．目的基因的檢測(cè)與鑒定例：逆轉(zhuǎn)錄耐高溫的

DNA聚合對(duì)位練習(xí)：為確定轉(zhuǎn)基因耐鹽堿水稻是否培育成功，可用

方法從個(gè)體水平鑒定水稻植株的耐鹽堿性。經(jīng)檢測(cè)，科研人員發(fā)現(xiàn)部分獲得耐鹽堿基因OsMYB56的水稻幼菌不具有耐鹽堿能力，原因可能是_________________。一定濃度的鹽水澆灌雖然獲得了相應(yīng)的基因，但耐鹽基因OsMYB56轉(zhuǎn)錄或翻譯異常(或耐鹽基因OsMYB56表達(dá)異常)[考向預(yù)測(cè)]1.某動(dòng)物體內(nèi)含有研究者感興趣的目的基因，研究者欲將該基因?qū)氪竽c桿菌的質(zhì)粒中保存和表達(dá)。該質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因及一些酶切位點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)和簡(jiǎn)單的操作步驟如圖所示。注：普通大腸桿菌菌落為乳白色，LacZ基因編碼產(chǎn)生的β－半乳糖苷酶可以分解X－gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。請(qǐng)根據(jù)以上信息回答下列問(wèn)題：(1)從動(dòng)物體內(nèi)獲取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，除了細(xì)胞需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適宜的溫度、pH和滲透壓外，還需要滿足的環(huán)境條件有_____________________、________________。

(2)利用PCR可以在體外擴(kuò)增含該目的基因的DNA片段，其擴(kuò)增循環(huán)一般可以分為_(kāi)________、_________、__________三步。(3)為了確保目的基因與載體的連接發(fā)生定向連接重組，以便定向克隆和成功表達(dá)，可以采用________________________的方法。

無(wú)毒、無(wú)菌的環(huán)境適宜的氣體環(huán)境變性復(fù)性延伸(用不同的酶)雙酶切切割目的基因和載體(4)在完成第④步操作后，菌液中大腸桿菌分為未轉(zhuǎn)化、導(dǎo)入空白質(zhì)粒、導(dǎo)入重組質(zhì)粒三種，它們?cè)趫D中培養(yǎng)基中培養(yǎng)后觀察到的結(jié)果分別是___________、_____________、______________。

沒(méi)有菌落藍(lán)色菌落乳白色菌落某動(dòng)物體內(nèi)含有研究者感興趣的目的基因，研究者欲將該基因?qū)氪竽c桿菌的質(zhì)粒中保存和表達(dá)。該質(zhì)粒含有氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ基因及一些酶切位點(diǎn)，其結(jié)構(gòu)和簡(jiǎn)單的操作步驟如圖所示。注：普通大腸桿菌菌落為乳白色，LacZ基因編碼產(chǎn)生的β－半乳糖苷酶可以分解X－gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)。【解析】(1)結(jié)合分析可知，從動(dòng)物體內(nèi)獲取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，除了細(xì)胞需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和適宜的溫度、pH和滲透壓外，還需要滿足無(wú)毒、無(wú)菌的環(huán)境和適宜的氣體環(huán)境(95%空氣+5%CO2)。(2)PCR可以在體外完成目的基因的DNA片段的擴(kuò)增，其擴(kuò)增循環(huán)一般可以分為變性、復(fù)性、延伸三步，需要的溫度條件依次為高溫、低溫和中溫。(3)為了確保目的基因與載體的連接發(fā)生定向連接，防止發(fā)生自身環(huán)化和插入方向錯(cuò)誤，導(dǎo)致無(wú)法定向克隆和成功表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)用兩種不同的酶切割出具有不同末端的運(yùn)載體和含有目的基因的DNA片段，而后通過(guò)DNA連接酶的作用實(shí)現(xiàn)目的基因和運(yùn)載體的正向連接。(4)未轉(zhuǎn)化的大腸桿菌不含AmpR，不能在含有青霉素的培養(yǎng)基中形成菌落，空白質(zhì)粒含有完整的LacZ基因，其編碼產(chǎn)生的β－半乳糖苷酶可以分解X－gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，導(dǎo)致該大腸桿菌菌落呈現(xiàn)為藍(lán)色；目的基因插入到LacZ基因中產(chǎn)生的重組質(zhì)粒，沒(méi)有完整的LacZ基因，不能發(fā)生顏色變化，大腸桿菌菌落表現(xiàn)為正常的乳白色。1．概念理解(1)基礎(chǔ)：蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系。(2)操作：________或合成基因。(3)結(jié)果：改造了現(xiàn)有蛋白質(zhì)或制造出____________。(4)目的：根據(jù)人們對(duì)蛋白質(zhì)功能的特定需求，對(duì)______________進(jìn)行設(shè)計(jì)改造。改造新的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)三、蛋白質(zhì)工程

功能蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)氨基酸序列脫氧核苷酸序列(基因)2．蛋白質(zhì)工程的設(shè)計(jì)流程蛋白質(zhì)工程為什么通過(guò)對(duì)基因操作來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)天然蛋白質(zhì)的改造？蛋白質(zhì)具有十分復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，基因的結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，容易改造；改造后的基因可以遺傳給下一代，被改造的蛋白質(zhì)無(wú)法遺傳深挖教材(2024年廣東校聯(lián)考模擬預(yù)測(cè))1965年中國(guó)科學(xué)家人工合成了具有生物活性的結(jié)晶牛胰島素，摘取了人工合成蛋白質(zhì)的桂冠。人胰島素基因表達(dá)的最初產(chǎn)物是一條肽鏈構(gòu)成的前胰島素原，經(jīng)下圖1所示的過(guò)程形成具生物活性的胰島素。此后科學(xué)家又提出了利用基因工程改造大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素的兩種方法：AB法是根據(jù)胰島素A、B兩條肽鏈的氨基酸序列人工合成兩種DNA片段，利用工程菌分別合成兩條肽鏈后將其混合自然形成胰島素；BCA法是利用胰島B細(xì)胞中的mRNA得到胰島素基因，表達(dá)出胰島素原后再用特定酶切掉C肽段。這兩種方法使用同一種質(zhì)粒作為載體。請(qǐng)據(jù)下圖分析并回答下列問(wèn)題：(1)由于密碼子具有

，AB法中人工合成的兩種DNA片段均有多種可能的序列。

(填“AB”、“BCA”或“AB和BCA”)法獲取的目的基因中不含人胰島素基因啟動(dòng)子。

簡(jiǎn)并性AB和BCA

(2)圖2是利用基因工程生產(chǎn)人胰島素過(guò)程中使用的質(zhì)粒及目的基因的部分結(jié)構(gòu)。為使目的基因與載體正確連接，在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)可添加限制酶

的識(shí)別序列。通過(guò)上述方法獲得人的胰島素基因后，需要通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，已知胰島素基因左端①處的堿基序列為-CCTTTCAGCTCA-，則其中一種引物設(shè)計(jì)的序列是5‘________________________3'。

-CTCGAG

XhoⅠ和MunⅠCCTTTCAGCTCA-(3)β-半乳糖苷酶可以分解無(wú)色的X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落為白色。經(jīng)

(處理方法)，大腸桿菌與重組質(zhì)?；旌吓囵B(yǎng)一段時(shí)間后，將大腸桿菌接種到添加了氨芐青霉素和X-gal的培養(yǎng)基上篩選出

色的菌落即為工程菌種。

Ca2+處理法白

(4)科學(xué)家利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)，研制出了賴(lài)脯胰島素，與天然胰島素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。獲得賴(lài)脯胰島素基因的途徑是：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→

→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列。

設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)【解析】(1)AB法是根據(jù)胰島素A、B兩條肽鏈的氨基酸序列人工合成兩種DNA片段，由于密碼子具有簡(jiǎn)并性，所以AB法中人工合成的兩種DNA片段均有多種可能的序列。胰島素基因存在于所有細(xì)胞中，但只能在胰島B細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)合題意“BCA法是利用胰島B細(xì)胞的mRNA得到胰島素基因，表達(dá)出胰島素原后再用特定酶切掉C肽段”可知，BCA法是從人體胰島B細(xì)胞中獲取mRNA；在基因的結(jié)構(gòu)中，啟動(dòng)子在非編碼區(qū)，是不會(huì)被轉(zhuǎn)錄和翻譯的，根據(jù)題干信息“AB法是根據(jù)胰島素A、B兩條肽鏈的氨基酸序列人工合成兩種DNA片段，利用工程菌分別合成兩條肽鏈后將其混合自然形成胰島素”，故由AB法中的“胰島素A、B兩條肽鏈的氨基酸序列”，和BCA法中的“胰島B細(xì)胞中的mRNA”得到的目的基因中均不含人胰島素基因啟動(dòng)子。(2)根據(jù)圖2，對(duì)于目的基因，SalⅠ和NheⅠ的作用位點(diǎn)在目的基因的中間，會(huì)破壞目的基因，則在引物設(shè)計(jì)時(shí)不能選用這兩種限制酶，那么只能在XhoⅠ和MunⅠ和EcoRⅠ中選擇；同時(shí)質(zhì)粒上EcoRⅠ的其中一個(gè)作用位點(diǎn)是在標(biāo)記基因上，所以只能選擇XhoⅠ和MunⅠ兩種限制酶，則需要在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)可添加限制酶XhoⅠ和MunⅠ的識(shí)別序列。已知胰島素基因左端①處的堿基序列為-CCTTTCAGCTCA-，在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)需要添加限制酶XhoⅠ和MunⅠ的識(shí)別序列，根據(jù)兩種酶在質(zhì)粒上的位置上可知，XhoⅠ的識(shí)別序列需要添加在目的基因左側(cè)、MunⅠ的識(shí)別序列需要添加在目的基因右側(cè)，已知胰島素基因左端①處的堿基序列為-CCTTTCAGCTCA-，由于DNA合成時(shí)，新鏈的延伸方向是：5'→3'，即其中一種引物與模板鏈3'端(①處互補(bǔ)的位置)堿基互補(bǔ)配對(duì)，同時(shí)該引物序列需要包含XhoⅠ的識(shí)別序列，所以其中一種引物設(shè)計(jì)的序列是5'-CTCGAGCCTTTCAGCTCA-3'。(3)將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞常用的方法是鈣離子處理法，使其處于感受態(tài)，目的基因的插入位置是在lacZ基因中，會(huì)破壞lacZ基因的結(jié)構(gòu)，不能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，根據(jù)題干信息“β-半乳糖苷酶可以分解無(wú)色的X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)”，故目的基因的插入破壞了lacZ基因的結(jié)構(gòu)，使其不能正常表達(dá)產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，底物X-gal不會(huì)被分解，所以篩選導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌時(shí)，在添加了氨芐青霉素和X-gal的培養(yǎng)基上應(yīng)選擇白色的菌落。(4)蛋白質(zhì)工程的途徑：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)→設(shè)計(jì)預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列→找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列。節(jié)選（2022·湖南·高考真題）水蛭是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥材，主要藥理成分水蛭素為水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。擬通過(guò)蛋白質(zhì)工程改造水蛭素結(jié)構(gòu)，提高其抗凝血活性?；卮鹣铝袉?wèn)題:(1)蛋白質(zhì)工程流程如圖所示，物質(zhì)a是______________________，物質(zhì)b是_______。在生產(chǎn)過(guò)程中，物質(zhì)b可能不同，合成的蛋白質(zhì)空間構(gòu)象卻相同，原因是_______________________。

氨基酸序列多肽鏈mRNA

密碼子的簡(jiǎn)并性(3)將提取的水蛭蛋白經(jīng)甲、乙兩種蛋白酶水解后，分析水解產(chǎn)物中的肽含量及其抗凝血活性，結(jié)果如圖所示。推測(cè)兩種處理后酶解產(chǎn)物的抗凝血活性差異主要與肽的______（填“種類(lèi)”或“含量”）有關(guān)，導(dǎo)致其活性不同的原因是_________________。種類(lèi)

和處理的酶的種類(lèi)不同，導(dǎo)致水蛭蛋白空間結(jié)構(gòu)有不同程度破壞提取的水蛭蛋白的酶解時(shí)間酒精溶液藍(lán)四、DNA的粗提取和鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理：2．操作流程新鮮洋蔥酒精二苯胺(溶解并提取DNA)[考向預(yù)測(cè)]考查DNA的粗提取和鑒定(素養(yǎng)目標(biāo)：科學(xué)探究)如圖為“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的相關(guān)操作。(1)圖中實(shí)驗(yàn)材料A可以是______________等，研磨前加入的B應(yīng)該是__________。

(2)通過(guò)上述所示步驟得到濾液C后，再向?yàn)V液中加入2mol/L的NaCl溶液的目的是____________________。

洋蔥(或菜花)研磨液使DNA溶解(4)DNA鑒定的原理是________________________________。在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑會(huì)被染成藍(lán)色(3)在該實(shí)驗(yàn)中，將含有一定雜質(zhì)的DNA絲狀物分別放入體積為2mL的4種溶液中，經(jīng)攪拌后過(guò)濾，獲得如下表所示的4種濾液，其中含DNA最少的是濾液________。

1B液中攪拌研磨后過(guò)濾濾液E22mol/L的NaCl溶液中攪拌后過(guò)濾濾液F30.14mol/L的NaCl溶液中攪拌后過(guò)濾濾液G4冷卻的95%的酒精溶液中攪拌后過(guò)濾濾液HH【解析】(1)選用洋蔥、菜花等植物材料提取DNA時(shí)，要在切碎的材料中加入研磨液，進(jìn)行充分的攪拌和研磨。(2)DNA在2

mol/L的NaCl溶液中的溶解度較高，而在0.14

mol/L的NaCl溶液中的溶解度最小。向?yàn)V液中加入2

mol/L的NaCl溶液可以使DNA溶解，過(guò)濾除去不溶的雜質(zhì)。(3)DNA不溶于冷酒精，可利用這一原理進(jìn)一步提純DNA?！纠坑肞CR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株是否成功導(dǎo)入目的基因時(shí)，得到以下電泳圖譜，其中1號(hào)為DNA標(biāo)準(zhǔn)樣液（Marker），10號(hào)為蒸餾水，PCR時(shí)加入的模板DNA如圖所示。據(jù)此分析，不合理的是

（

）A．PCR產(chǎn)物的分子大小在250～500bp之間B．3號(hào)樣品為不含目的基因的載體DNAC．9號(hào)樣品對(duì)應(yīng)植株不是所需的轉(zhuǎn)基因植株D．10號(hào)確定反應(yīng)體系等對(duì)結(jié)果沒(méi)有干擾B[自主學(xué)習(xí)]五、生物技術(shù)的安全性和倫理問(wèn)題經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平安全性生殖不贊成不支持基因檢測(cè)基因歧視致病菌不生產(chǎn)試管嬰兒和設(shè)計(jì)試管嬰兒的比較

(1)不同點(diǎn)①所用技術(shù)手段：設(shè)計(jì)試管嬰兒胚胎移植前______(填“需要”或“不需要”)進(jìn)行遺傳學(xué)診斷或基因診斷，試管嬰兒______(填“需要”或“不需要”)進(jìn)行遺傳學(xué)診斷或基因診斷。

②應(yīng)用：試管嬰兒主要是解決不孕夫婦的生育問(wèn)題，設(shè)計(jì)試管嬰兒主要用于白血病、貧血癥的治療。(2)相同點(diǎn)：_________________________________________________________________________________________________。

需要不需要

都是體外受精，并進(jìn)行體外早期胚胎培養(yǎng)，都要經(jīng)過(guò)胚胎移植，都是有性生殖深挖教材（2021年福建高考真題）微生物吸附是重金屬?gòu)U水的處理方法之一。金屬硫蛋白（MT）是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)植物中的金屬結(jié)合蛋白，具有吸附重金屬的作用?？蒲腥藛T將棗樹(shù)的MT基因?qū)氪竽c桿菌構(gòu)建工程菌?；卮鹣铝袉?wèn)題：(1)根據(jù)棗樹(shù)的MTcDNA的核苷酸序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的引物（圖1甲），通過(guò)PCR擴(kuò)增MT基因。已知A位點(diǎn)和B位點(diǎn)分別是起始密碼子和終止密碼子對(duì)應(yīng)的基因位置。選用的引物組合應(yīng)為_(kāi)__________。引物1和引物4(2)本實(shí)驗(yàn)中，PCR所用的DNA聚合酶擴(kuò)增出的MT基因的末端為平末端。由于載體E只有能產(chǎn)生黏性末端的酶切位點(diǎn)，需借助中間載體P將MT基因接入載體E。載體P和載體E的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的酶切序列如圖乙所示。①選用_______酶將載體P切開(kāi)，再用_________（填“T4DNA或“E·coliDNA”）連接酶將MT基因與載體P相連，構(gòu)成重組載體P′。EcoRVT4DNA②載體P′不具有表達(dá)MT基因的___________和___________。選用___________酶組合對(duì)載體P′和載體E進(jìn)行酶切，將切下的MT基因和載體E用DNA連接酶進(jìn)行連接，將得到的混合物導(dǎo)入到用___________離子處理的大腸桿菌，篩出MT工程菌。Ca2+啟動(dòng)子

終止子X(jué)hoI和PstI(3)MT基因在工程菌的表達(dá)量如圖2所示。結(jié)果仍無(wú)法說(shuō)明已經(jīng)成功構(gòu)建能較強(qiáng)吸附廢水中重金屬的MT工程菌，理由是___________________________________________________。尚未在個(gè)體生物學(xué)水平上對(duì)MT工程菌吸附重金屬的能力進(jìn)行鑒定考題重現(xiàn)1.(2024年廣東卷)駒形桿菌可合成細(xì)菌纖維素（BC）并將其分泌到胞外組裝成膜。作為一種性能優(yōu)異的生物材料，BC膜應(yīng)用廣泛。研究者設(shè)計(jì)了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)入駒形桿菌后構(gòu)建出一株能合成BC膜并可實(shí)現(xiàn)光控染色的工程菌株，為新型紡織原料的綠色制造及印染工藝升級(jí)提供了新思路（圖一）。(1)研究者優(yōu)化了培養(yǎng)基的

（答兩點(diǎn)）等營(yíng)養(yǎng)條件，并控制環(huán)境條件，大規(guī)模培養(yǎng)工程菌株后可在氣液界面處獲得BC菌膜（菌體和BC膜的復(fù)合物）。碳源、氮源(2)研究者利用T7噬菌體來(lái)源的RNA聚合酶（T7RNAP）及藍(lán)光光敏蛋白標(biāo)簽，構(gòu)建了一種可被藍(lán)光調(diào)控的基因表達(dá)載體（光控原理見(jiàn)圖二a，載體的部分結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖二b）。構(gòu)建載體時(shí)，選用了通用型啟動(dòng)子PBAD（被工程菌RNA聚合酶識(shí)別）和特異型啟動(dòng)子PT7（僅被T7RNAP識(shí)別）。為實(shí)現(xiàn)藍(lán)光控制染色，啟動(dòng)子①②及③依次為

，理由是

。PT7、PBAD和PBAD

無(wú)活性物質(zhì)(無(wú)活性T7RNAP)，藍(lán)光照射時(shí)再激活基因1表達(dá)基因2、3可正常表達(dá)出(3)光控表達(dá)載體攜帶大觀霉素（抗生素）抗性基因。長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)在培養(yǎng)液中加入大觀霉素，其作用為

（答兩點(diǎn)）。(4)根據(jù)預(yù)設(shè)的圖案用藍(lán)光照射已長(zhǎng)出的BC菌膜并繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間，隨后將其轉(zhuǎn)至染色池處理，發(fā)現(xiàn)只有經(jīng)藍(lán)光照射的區(qū)域被染成黑色，其原因是

。(5)有企業(yè)希望生產(chǎn)其他顏色圖案的BC膜。按照上述菌株的構(gòu)建模式提出一個(gè)簡(jiǎn)單思路

抑制雜菌；去除丟失質(zhì)粒的菌株處細(xì)胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表達(dá)并合成黑色素將酪氨酸酶替換成合或其他色素的酶或?qū)⒗野彼崦柑鎿Q成合其他顏色蛋白。2.(2023年山東卷)科研人員構(gòu)建了可表達(dá)J-V5融合蛋白的重組質(zhì)粒并進(jìn)行了檢測(cè)，該質(zhì)粒的部分結(jié)構(gòu)如圖甲所示，其中V5編碼序列表達(dá)標(biāo)簽短肽V5。(1)與圖甲中啟動(dòng)子結(jié)合的酶是

。除圖甲中標(biāo)出的結(jié)構(gòu)外，作為載體，質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有___________________

______(答出2個(gè)結(jié)構(gòu)即可)。(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒后，為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，需進(jìn)行PCR檢測(cè)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物

。已知J基因轉(zhuǎn)錄的模板鏈位于b鏈，由此可知引物F1與圖甲中J基因的

(填“a鏈”或“b鏈”)相應(yīng)部分的序列相同。

RNA聚合酶限制酶切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)等F2和R1或F1與R2a鏈(3)重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)后，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)相應(yīng)蛋白是否表達(dá)以及表達(dá)水平，結(jié)果如圖乙所示。其中，出現(xiàn)條帶1證明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)了

，條帶2所檢出的蛋白

(填“是”或“不是”)由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。

J-V5融合蛋白不是【解析】(1)啟動(dòng)子是為了啟動(dòng)下游基因的“表達(dá)”，表達(dá)首先需要轉(zhuǎn)錄，因此RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位才是轉(zhuǎn)錄的起始。作為載體必須具備的條件：①要具有限制酶的切割位點(diǎn)；②要有標(biāo)記基因(如抗性基因)，以便于重組后的篩選；③能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在并復(fù)制；④是安全的，對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害，而且要易從供體細(xì)胞分離出來(lái)。圖甲中有啟動(dòng)子和終止子等，因此質(zhì)粒還需具備的結(jié)構(gòu)有限制酶的切割位點(diǎn)、標(biāo)記基因、復(fù)制原點(diǎn)等。(2)據(jù)圖甲可知，引物F2與R1或F1與R2結(jié)合部位包含J基因的堿基序列，因此推測(cè)為了確定J基因連接到質(zhì)粒中且插入方向正確，進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，若僅用一對(duì)引物，應(yīng)選擇圖甲中的引物F2和R1或F1與R2。b是模板鏈，而根據(jù)圖上啟動(dòng)子和終止子的位置可知轉(zhuǎn)錄方向是圖上從左向右，對(duì)應(yīng)的模板鏈方向應(yīng)該是3'-5'，非模板鏈(也就是a鏈)是5'-3'；考慮到DNA復(fù)制的方向是子鏈的5'-3'，引物基礎(chǔ)上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物結(jié)合的單鏈其方向是3'-5'；圖中F1是前引物，在左側(cè)，所以其配對(duì)的單鏈?zhǔn)?'-5'的b鏈，故其序列應(yīng)該與a鏈相應(yīng)部分的序列相同。(3)據(jù)圖乙可知，用抗J蛋白抗體和抗V5抗體分別檢測(cè)，均出現(xiàn)條帶1，說(shuō)明條帶1是J-V5融合蛋白?？笿蛋白抗體檢測(cè)出現(xiàn)條帶2，抗V5抗體檢測(cè)沒(méi)有條帶2，說(shuō)明條帶2所檢出的蛋白不是由重組質(zhì)粒上的J基因表達(dá)的。3.(2022年山東卷)某種類(lèi)型的白血病由蛋白P引發(fā)，蛋白UBC可使P被蛋白酶識(shí)別并降解，藥物A可通過(guò)影響這一過(guò)程對(duì)該病起到治療作用。為探索藥物A治療該病的機(jī)理，需構(gòu)建重組載體以獲得融合蛋白FLAG－P和FLAG－P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，F(xiàn)LAG是一種短肽，連接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能與含有FLAG抗體的介質(zhì)結(jié)合，但不影響P或P△的功能。(1)為構(gòu)建重組載體，需先設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR特異性擴(kuò)增P基因。用于擴(kuò)增P基因的引物需滿足的條件是_______________________________________________，為使PCR產(chǎn)物能被限