飼料中嗜酸乳桿菌的微生物學(xué)檢驗(yàn) 征求意見(jiàn)稿

2飼料中嗜酸乳桿菌的微生物學(xué)檢驗(yàn)本文件描述了飼料中嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）活菌總數(shù)的測(cè)定方法。本文件適用于含有嗜酸乳桿菌的配合飼料（含寵物飼料）、濃縮飼料、精料補(bǔ)充料、添加劑預(yù)混合飼料和飼料添加劑中嗜酸乳桿菌活菌總數(shù)計(jì)數(shù)及其鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T42959飼料微生物檢驗(yàn)采樣3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4試劑和培養(yǎng)基除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.1水：GB/T6682，3級(jí)。4.20.85%滅菌生理鹽水：稱取8.5g氯化鈉加入水中，攪拌至完全溶解后，倒入容量瓶中定容至1000mL。分裝后，121℃滅菌15min，備用。4.3MRS瓊脂培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A.1。4.4乳酸桿菌糖發(fā)酵管：見(jiàn)附錄A.2。4.5七葉苷培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A.3。4.6革蘭氏染色液：見(jiàn)附錄A.4。5設(shè)備和材料5.1培養(yǎng)箱：溫度可控精度±1℃。5.2天平：精度0.1g。5.3振蕩器。5.4旋渦混合器。5.5無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。5.6厭氧培養(yǎng)裝置：厭氧培養(yǎng)箱、厭氧罐、厭氧袋或能提供同等厭氧效果的裝置。5.7無(wú)菌吸管：容量為0.1mL、1mL或相當(dāng)規(guī)格的移液器以及配套的無(wú)菌吸頭。35.8三角瓶:容量為500mL。5.9顯微鏡：1000倍。6樣品按照GB/T42959執(zhí)行。7試驗(yàn)步驟7.1樣品制備、稀釋和涂布7.1.1稱取25g樣品或以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品，置于裝有225mL0.85%滅菌生理鹽水的500mL無(wú)菌三角瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，在振蕩器上振搖30min，制成1：10樣品稀釋勻液。注：經(jīng)特殊技術(shù)（如包埋技術(shù)）處理的樣品在相應(yīng)技術(shù)/工藝要7.1.2取1mL1:10樣品稀釋勻液注入含有9mL0.85%滅菌生理鹽水的試管中，在旋渦混合器上混勻，此液為1:100的樣品勻液。7.1.3按7.1.2操作，制備10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。7.1.4選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品稀釋勻液，吸取0.1mL該樣品稀釋勻液于已提前滅菌并充分干燥的MRS瓊脂平板上，使用無(wú)菌涂布棒快速地涂布均勻。每個(gè)稀釋度涂布2個(gè)平板。同時(shí)吸取0.1mL0.85%滅菌生理鹽水進(jìn)行同樣涂布，作為空白對(duì)照。從樣品稀釋到平板涂布要在15min內(nèi)完成。7.2培養(yǎng)涂布結(jié)束后水平放置10min，將平板倒置放入?yún)捬豕蘩铮?6℃±1℃培養(yǎng)。一般選擇培養(yǎng)48h±2h，若菌落無(wú)生長(zhǎng)或生長(zhǎng)較小可選擇培養(yǎng)至72h。7.3觀察菌落形態(tài)典型的嗜酸乳桿菌菌落呈圓形，中等大小，凸起，微白色，濕潤(rùn)，邊緣整齊，菌落背面為黃色。7.4菌落計(jì)數(shù)選取嗜酸乳桿菌疑似菌落數(shù)在30個(gè)～300個(gè)之間的平板計(jì)數(shù)。7.5確證7.5.1菌種純化在同一稀釋度內(nèi)，挑取5個(gè)嗜酸乳桿菌疑似菌落，分別劃線轉(zhuǎn)接至MRS瓊脂培養(yǎng)基平板上，36℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，獲得單菌落培養(yǎng)物。7.5.2菌體鏡檢觀察挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，嗜酸乳桿菌為革蘭氏陽(yáng)性、無(wú)芽孢桿菌。7.5.3碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn)將挑選純化的菌落進(jìn)行碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn)，見(jiàn)附錄B.1。7.5.4分子生物學(xué)鑒定如有必要按附錄B.2進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。8試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果和證實(shí)為嗜酸乳桿菌的菌落數(shù)，計(jì)算出平板內(nèi)的菌數(shù)，然后乘其稀釋倍數(shù)即得每克（或每毫升）樣品中嗜酸乳桿菌活菌總數(shù)N(CFU/g或CFU/mL),按公式(1)計(jì)算。4式中:N——每克或每毫升樣品中活菌數(shù)的數(shù)值,單位為菌落形成單位每克(CFU/g)或每毫升（CFU/mLA——嗜酸乳桿菌疑似菌落數(shù)的數(shù)值,單位為菌落形成單位(CFU)；B——5個(gè)鑒定的菌落中確認(rèn)為嗜酸乳桿菌菌落數(shù)的數(shù)值,單位為菌落形成單位(CFU)；f——稀釋倍數(shù)的數(shù)值,單位為每克（g-1）或每毫升（mL-15——選出的嗜酸乳桿菌疑似菌落的數(shù)值,單位為菌落形成單位(CFU)。5附錄A（規(guī)范性）培養(yǎng)基及試劑A.1MRS瓊脂培養(yǎng)基2O）2O）2O）在121℃滅菌15min。制備的MRS瓊脂可以在黑暗處于1℃~5℃下儲(chǔ)存6個(gè)月。液A.2.2按0.5%加入所需糖類，分裝于有倒置小管的小試管內(nèi)。121℃滅菌15A.3.2稱取各組分放入瓶中，加入蒸餾水，加熱，玻璃棒攪拌溶解，調(diào)整pH值至7.2，分6先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘7附錄B菌種鑒定+++-+棉籽糖d-蔗糖+注：“+”表示90%以上菌株陽(yáng)性；“-”表示90%以上菌株陰性；“d”表示11%～89%菌株陽(yáng)性。B.2.116SrDNA的鑒定B.2.1.1儀器冰箱：含4℃和-20℃微波爐PCR儀：可設(shè)定反應(yīng)程序商業(yè)化細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱法或磁珠法）或核酸自動(dòng)提取儀離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速應(yīng)不低于12000RPM（15000g）千分天平移液器和配套槍頭：應(yīng)無(wú)菌無(wú)酶恒溫水浴鍋：RT-100℃±1℃,溫度波動(dòng)≤0.5℃渦旋震蕩儀：可調(diào)速電泳儀及配套電泳槽、制膠設(shè)備超微量分光光度計(jì)紫外凝膠成像儀或藍(lán)光切膠儀B.2.1.2試劑瓊脂糖：純度>99.5%商業(yè)化瓊脂糖凝膠電泳緩沖液TAE，按說(shuō)明書(shū)使用商業(yè)化上樣緩沖液核酸凝膠染色劑：溴化乙錠或吖啶橙DNAMarker：DL2000B.2.1.3方法B.DNA模板制備取純化培養(yǎng)24h~48h后的平板，刮取1~2接種環(huán)菌苔加入200μLddH2O，渦旋震蕩充分混勻。推薦使用商業(yè)化細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒或核酸自動(dòng)提取儀，按配套說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取。將8提取后的基因組DNA使用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和OD260/OD280值測(cè)定，放于-20℃條件下保存?zhèn)銪.PCR擴(kuò)增使用細(xì)菌16S核糖體通用引物擴(kuò)增，序列和條件如下：引物名稱序列（5’->3’）27FAGAGTTTGATCCTGGCTCAG1492RGGTTACCTTGTTACGACTTPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：PCR試劑實(shí)驗(yàn)體系陰性對(duì)照體系陽(yáng)性對(duì)照體系基因組DNA(100ng/μL)-10×Buffer(含2.5mMMg2+）5.0μL5.0μL5.0μLTaq酶（5U/μL）0.25μL0.25μL0.25μLdNTP(10mM)2.0μL2.0μL2.0μL27F引物(10μM)1492R引物(10μM)ddH2O39.75μL40.75μL39.75μL總體積50.0μL50.0μL50.0μL向離心管內(nèi)依次加入各組分，渦旋震蕩后瞬時(shí)離心，以收集管壁上的液滴至管底，在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)流程為：95℃預(yù)變性30s，之后95℃變性10s——55℃退火30s——72℃延伸1.5min，以上共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。B.PCR產(chǎn)物觀察抽取PCR產(chǎn)物2μL、上樣緩沖液1μL，混勻后上樣。之后在90V~150V電壓下，使用1.0%~1.5%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)染料帶跑至膠板超過(guò)1/2處結(jié)束電泳，紫外凝膠成像或藍(lán)光切角板下觀察，待測(cè)樣本和陽(yáng)性對(duì)照樣本的目的片段均應(yīng)出現(xiàn)在約1480bp處，同時(shí)陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)條帶。對(duì)符合要求的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物，進(jìn)行Sanger法一代測(cè)序。B.序列分析拼接后的16SrDNA序列，應(yīng)滿足峰圖清晰，無(wú)重疊峰區(qū)域堿基數(shù)應(yīng)不低于1200bp，使用在線或離線BLASTn程序進(jìn)行序列相似度比對(duì)。其中NCBI網(wǎng)站提供的在線BLAST程序，鏈接為：/Blast.cgi；離線版NCBI16S數(shù)據(jù)庫(kù)文件鏈接為：/blast/db/16S_ribosomal_RNA.tar.gz比對(duì)結(jié)果應(yīng)與Lactobacillusacidophilus16SrDNA序列一致性（identity）值>99%。否則為存疑菌種，需要補(bǔ)充基于二代高通量測(cè)序技術(shù)的rMLST方法，進(jìn)一步進(jìn)行基因組水平鑒定。B.2.2基于二代高通量測(cè)序技術(shù)的rMLST方法鑒定提取細(xì)菌對(duì)數(shù)期或平臺(tái)期的基因組總DNA（提取方法使用離心柱法、磁珠法或酚氯仿手提法均可進(jìn)行二代高通量測(cè)序（商業(yè)化測(cè)序儀均可），建議測(cè)序堿基總數(shù)據(jù)量>1Gbase，測(cè)序堿基Q20>80%。原始數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控和組裝后（軟件和算法只要采用公開(kāi)發(fā)表的方法均可以使用），得到基因組草圖。9要求組裝結(jié)果平均基因組測(cè)序深度>100x，測(cè)序覆蓋度>95%，污染率<10%。將獲得的基因組草圖，提交至PubMLST網(wǎng)站，與其公布的rMLST等位基因在線數(shù)據(jù)庫(kù)做檢索。其參考鏈接為：/bigsdb?db=pubmlst_rmlst_seqd