04第四講-多糖的分離純化方法

一、多糖提取分離的基本方法原料→前處理→提取→濃縮→沉淀→脫蛋白→脫色、脫脂→干燥→粗多糖第四講多糖的提取方法1．前處理根據(jù)原料的特點(diǎn)，前處量方法不同，一般包括：（1）非極性溶劑處理：脫脂、脫色對(duì)植物根、莖、葉、花、果及種子中的多糖，含脂高的應(yīng)先脫脂，含色素的需進(jìn)行脫色，通常采用丙酮、乙醚、乙醇進(jìn)行預(yù)處理達(dá)到脫脂或脫色的目的。（也可將該操作放在后面）（2）80%乙醇水溶液處理有些原料中含有較多單糖和低聚糖，對(duì)多糖的純度造成影響。由于單糖和低聚糖可溶于熱的80%乙醇溶液中，而多糖則不能溶。故可用80%乙醇水溶液除原料中的單糖和低聚糖。2．提?。?）溶劑種類多糖是極性大分子化合物，大多采用不同溫度的水、稀堿溶液或氯化鈉水溶液作提取溶劑。（2）注意事項(xiàng)①盡量避免在酸性條件下提取，因?yàn)樗嵝詶l件能引起多糖中糖苷鍵的斷裂。②動(dòng)物中所含多糖多是酸性多糖，常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，因此常用堿溶液提取法、中性鹽溶液提取法和蛋白酶水解法。③當(dāng)采用堿溶液提取時(shí)，要特別注意前處理，以及溫度、pH值的控制。因?yàn)閴A性溶液中比較容易發(fā)生美拉德反應(yīng)，而美拉德反應(yīng)一旦發(fā)生，所產(chǎn)生的色素極難去除，會(huì)對(duì)進(jìn)一步的研究造成無法補(bǔ)救的影響。降低美拉德反應(yīng)產(chǎn)生程度的方法：通過前處理去除小分子糖、避免pH值處于8-10的范圍、避免提取溫度處于60-80℃。3．濃縮濃縮操作應(yīng)在盡量低的溫度下進(jìn)行，并盡量防止提取物與氧氣的接觸。目的：防止多糖被氧化，保持多糖原有結(jié)構(gòu)及生物活性。

(1)沉淀法

(2)吸附法將干葡聚糖凝膠G25（或吸水棒）加入抽提液中，兩者比例為1：5。由于凝膠吸水之故，抽提液的體積可縮小三倍左右，回收多糖約80%。(3)超濾法

超過濾即超濾，自20年代問世后，直至60年代以來發(fā)展迅速，很快由實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的分離手段發(fā)展成重要的工業(yè)單元操作技術(shù)。超濾現(xiàn)已成為一種重要的生化實(shí)驗(yàn)技術(shù)，廣泛用于含有各種小分子溶質(zhì)的各種生物大分子的濃縮、分離和純化。超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。

超濾根據(jù)所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種。微孔過濾所用的操作壓通常小于4×104Pa，膜的平均孔徑為50nm-14μm，用于分離較大的微粒、細(xì)菌和污染物等。超濾所用操作壓為4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔徑為1-10nm，用于分離大分子溶質(zhì)。反滲透所用的操作壓比超濾更大，常達(dá)到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔徑最小，一般為1nm以下，用于分離小分子溶質(zhì)，如海水脫鹽，制高純水等。

超濾技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，成本低廉，不需增加任何化學(xué)試劑，尤其是超濾技術(shù)的實(shí)驗(yàn)條件溫和，與蒸發(fā)、冰凍干燥相比沒有相的變化，而且不引起溫度、pH的變化，因而可以防止生物大分子的變性、失活和自溶。在生物大分子的制備技術(shù)中，超濾主要用于生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮等。

超濾法也有一定的局限性：它不能直接得到干粉制劑。超濾技術(shù)的關(guān)鍵是膜：膜有各種不同的類型和規(guī)格，可根據(jù)工作的需要來選用。早期的膜是各向同性的均勻膜，即現(xiàn)在常用的微孔薄膜，其孔徑通常是0.05mm-1.0mm。近幾年來生產(chǎn)了一些各向異性的不對(duì)稱超濾膜。

常用的膜一般是由乙酸纖維或硝酸纖維或此二者的混合物制成。近年來為適應(yīng)制藥和食品工業(yè)上滅菌的需要，發(fā)展了非纖維型的各向異性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。這種膜在pH1～14都是穩(wěn)定的，且能在90℃下正常工作。超濾膜通常是比較穩(wěn)定的，若使用恰當(dāng)，能連續(xù)用1～2年。暫時(shí)不用，可浸在1％甲醛溶液或0.2％疊氮化鈉NaN3中保存。

超濾膜的基本性能指標(biāo)主要有：水通量（cm3/(cm2?h)）；截留率（以百分率％表示）；化學(xué)物理穩(wěn)定性（包括機(jī)械強(qiáng)度）等。超濾裝置一般由若干超濾組件構(gòu)成。通?？煞譃榘蹇蚴?、管式、螺旋卷式和中空纖維式四種主要類型。由于超濾法處理的液體多數(shù)是含有水溶性生物大分子、有機(jī)膠體、多糖及微生物等。這些物質(zhì)極易粘附和沉積于膜表面上，造成嚴(yán)重的濃差極化和堵塞，這是超濾法最關(guān)鍵的問題，要克服濃差極化，通?？杉哟笠后w流量，加強(qiáng)湍流和加強(qiáng)攪拌。

國(guó)外生產(chǎn)超濾膜和超濾裝置最有名的廠家是美國(guó)的Milipore公司和德國(guó)的Sartorius公司。國(guó)內(nèi)主要的研究機(jī)構(gòu)和生產(chǎn)廠家是：中科院生態(tài)環(huán)境研究中心、杭州淡化和水處理開發(fā)中心、蘭州膜科學(xué)技術(shù)研究所、無錫化工研究所、上海醫(yī)藥工業(yè)研究所、天津膜分離工程研究所、北京化工廠、常熟膜分離實(shí)驗(yàn)廠、無錫市超濾設(shè)備廠、無錫純水設(shè)備廠、天津超濾設(shè)備廠、湖北沙市水處理設(shè)備廠等。從膜的品種，以及從某些研究工作的深度方面看，我國(guó)與世畀先進(jìn)國(guó)家的差距不很大，但在膜的質(zhì)量性能及商品化方面尚有較大差距。

（4）透析法商品透析袋制成管狀，其扁平寬度為23mm-50mm不等。為防干裂，出廠時(shí)都用10％的甘油處理過，并含有極微量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質(zhì)，它們對(duì)生物活性物質(zhì)有害，用前必須除去?？上扔?0％乙醇煮沸1小時(shí)，再依次用50％乙醇、0.01mol/L碳酸氫鈉和0.001mol/LEDTA溶液洗滌，最后用蒸餾水沖洗即可使用。實(shí)驗(yàn)證明，50％乙醇處理對(duì)除去具有紫外吸收的雜質(zhì)特別有效。使用后的透析袋洗凈后可存于4℃蒸餾水中，若長(zhǎng)時(shí)間不用，可加少量NaN2，以防長(zhǎng)菌。洗凈涼干的透析袋彎折時(shí)易裂口，用時(shí)必須仔細(xì)檢查，不漏時(shí)方可重復(fù)使用。

新透析袋如不作如上的特殊處理，則可用沸水煮五至十分鐘，再用蒸餾水洗凈，即可使用。透析進(jìn)，通常要留三分之一至一半的空間，以防透析過程中，透析的小分子量較大時(shí)，袋外的水過量進(jìn)入袋內(nèi)將袋漲破。為了加快透析速度，除多次更換透析液外，還可使用磁子攪拌。透析的容器要大一些，可以使用大燒杯、大量筒和塑料桶。小量體積溶液的透析，可在袋內(nèi)放一截兩頭燒園的玻璃棒或兩端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。

檢查透析效果的方法是：用1％BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1％AgNO3

檢查NaCl、KCl等。①把裝抽提液的透析袋埋在吸水力強(qiáng)的聚乙二醇（polyetheyleneglycol,分子量20000以上，簡(jiǎn)稱PEG）或甘油中，10ml抽提液可在1小時(shí)內(nèi)濃縮到幾乎無水程度。該方法的濃縮速度與透析袋的表面積以及PEG的數(shù)量有密切關(guān)系。②真空透析濃縮

（5）真空濃縮法（6）冷凍干燥法

4．沉淀常用方法：等電點(diǎn)法（酸性多糖、堿性多糖）、乙醇沉淀法。

5．脫蛋白（1）游離蛋白質(zhì)的去除方法：

Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、柱色譜法。前三種方法的缺點(diǎn)：操作用到大量有毒有機(jī)試劑，對(duì)操作者的身體健康造成危害；同時(shí)，操作往往要重復(fù)十幾次才能達(dá)到較好的效果，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；最后，操作會(huì)造成多糖的大量損失。柱色譜法的優(yōu)缺點(diǎn)：一次操作既可達(dá)到良好效果，但所選擇的色譜材料不能對(duì)多糖有影響。（2）結(jié)合蛋白質(zhì)的去除結(jié)合蛋白常用蛋白酶法去除：鏈霉菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶等處理多糖提取液或多糖粗品，經(jīng)