生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)（一）（呈色反應(yīng)）一、目的1

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)（一）（呈色反應(yīng)）一、目的1.了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要聯(lián)接方式。2.了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。3.學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法二、雖色反應(yīng)：(一)雙縮脫反應(yīng)：1.原理：尿素加熱至180℃左右生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱(chēng)為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，也能發(fā)生此反應(yīng)?？捎糜诘鞍踪|(zhì)的定性或定量測(cè)定。一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽部有雙納脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。2.試劑：(1)尿索：10克(2)10%氫氧化鈉溶液250毫升(3)1%硫酸銅溶液60毫升(4)2％卵清蛋白溶液80毫升3.操作方法：取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開(kāi)始硬化時(shí)，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后，加10％氫氧化鈉溶液約1毫升，振蕩混勻，再加1％硫酸銅溶液1滴，再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。避免添加過(guò)量硫酸銅，否則，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。向另一試管加卵清蛋白溶液約l毫升和10％氫氧化鈉溶液約2毫升，搖勻，再加1％硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖，觀察紫玫色的出現(xiàn)。(二)茚三酮反應(yīng)1.原理：除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)外，所有α—氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)。該反應(yīng)十分靈敏，1：1500000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測(cè)定方法。茚三酮反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同另一個(gè)水合茚三酮分于和氨縮合生成有色物質(zhì)。反應(yīng)機(jī)理如下：此反應(yīng)的適宜pH為5—7，同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過(guò)大時(shí)甚至不顯色。2.試劑：(1)蛋白質(zhì)溶液100毫升2％卵清蛋白或新鮮雞蛋清溶液(蛋清：水＝1：9)(2)0.5％甘氨酸溶液80毫升(3)0.1％茚三酮水溶液50毫升(4)0.1％茚三酮—乙醇溶液20毫升3.操作方法：(1)取2支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶液1毫升，再各加0.5毫升0.1％茚三酮水溶液，混勻，在沸水浴中加熱1—2分鐘，觀察顏色由粉色變紫紅色再變藍(lán)。(2)在一小塊濾紙上滴一滴0.5％的甘氨酸溶液，風(fēng)干后，再在原處滴上一滴0.1％的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點(diǎn)的出現(xiàn)。(三)黃色反應(yīng)：1.原理：含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成深橙色的硝醌酸鈉。反應(yīng)式如下：多數(shù)蛋白質(zhì)分子臺(tái)有帶苯壞的氨基酸，所以有黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。2.試劑：(1)雞蛋清溶液100毫升將新鮮雞蛋的蛋清與水按1：20混勻，然后用六層紗布過(guò)濾。(2)大豆提取液100毫升將大豆浸泡充分吸脹后研磨成漿狀用紗布過(guò)濾。(3)頭發(fā)(4)指甲(5)0.5％苯酚溶液50毫升(6)濃硝酸200毫升(7)0.3％色氨酸溶液10毫升(8)0.3％酪氨酸溶液10毫升(9)10％氫氧化鈉溶液100毫升3.操作方法：向7個(gè)試管中分別按下表加入試劑，觀察各管出現(xiàn)的現(xiàn)象，有的試管反應(yīng)慢可略放置或用微火加熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10％氫氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化。(四)乙醛酸反應(yīng)1.原理：在濃硫酸存在下，色氨酸與乙醛酸反應(yīng)生成紫色物質(zhì),反應(yīng)機(jī)理尚不清楚，可能是一分子乙醛酸與兩分子色氨酸脫水縮合形成與靛藍(lán)相似的物質(zhì)。含有色氨酸的蛋白質(zhì)也有此反應(yīng)。2.試劑：(1)蛋白質(zhì)溶液100毫升雞蛋清：水＝1：20(2)0.03％色氨酸溶液10毫升(3)冰醋酸200毫升(4)濃硫酸(分析純)100毫升3.操作方法：取3支試管。編號(hào)。分別按上表加入蛋白質(zhì)溶液、色氨酸溶液和水，然后各加入冰醋酸2毫升?；靹蚝髢A斜試試管，沿管壁分別緩緩加入濃硫酸約I毫升，靜置。觀察各管液面間紫色環(huán)的出現(xiàn)。若不明顯，可于水浴中微熱實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)（二）（沉淀反應(yīng)）一、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定：1.目的：(1)了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)。(2)學(xué)習(xí)測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的一種方法2.原理：蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡：蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。當(dāng)溶液的pH達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)日相等，在電場(chǎng)中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動(dòng)，也不向陽(yáng)極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值稱(chēng)為此種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。不同蛋白質(zhì)各有其特異的等電點(diǎn)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用此種性質(zhì)的變化測(cè)定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。最常用的方法是測(cè)其溶解度最低時(shí)的溶液pH值。本實(shí)驗(yàn)借觀察在不同pH溶液中的溶解度以測(cè)定酪蛋白的等電點(diǎn)。用醋酸與酷酸鈉(醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中)配制成各種不同pH值的緩沖液。向諸緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點(diǎn)。3.器材：(1)水浴鍋。(2)溫度計(jì)。(3)200毫升錐形瓶。(4)100毫升容量瓶。(5)吸管。(6)試管。(7)試管架。(8)乳缽。4.試劑：(1)0.4％酪蛋白醋酸鈉溶液200毫升取0.4克酪蛋白，加少量水在乳缽中仔細(xì)地研6，將所得的蛋白質(zhì)懸波移入200毫升錐形瓶?jī)?nèi)，用少量40～50℃的溫水洗滌乳缽，將洗滌液也移入錐形瓶?jī)?nèi)。加入10毫升1當(dāng)量/升醋酸鈉溶液。把錐形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋轉(zhuǎn)錐形瓶，直到酪蛋白完全溶解為止。將錐形瓶?jī)?nèi)的溶液全部移至100毫升容量瓶?jī)?nèi)，加水至刻度，塞緊玻塞，混勻。(2)1.00當(dāng)量／升醋酸溶液100毫升(3)0.10當(dāng)量／升醋酸溶液100毫升(4)0.01當(dāng)量／升醋酸溶液50毫升5.操作方法：(1)取同樣規(guī)格的試營(yíng)4支，按下表顛序分別精確地加入各試劑，然后混勻。(2)向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1毫升，加一管，搖句一管。此時(shí)1、2、3、4管的pH值依次為5.9、5.3、4.7、3.5。觀察其混濁度。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度。最混濁的一管的pH即為酪蛋白的等電點(diǎn)。二、蛋白廈的沉淀及變性：1.目的：(1)加深對(duì)蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識(shí)。(2)了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實(shí)用意義。(3)了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系。2.原理：在水溶液中的蛋白質(zhì)分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體顆粒，在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)穎拉可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類(lèi)。(1)可逆的沉淀反應(yīng)：此時(shí)蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來(lái)的溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。如大多數(shù)蛋白質(zhì)的鹽析作用或在低溫下用乙醇(或丙酮)短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時(shí)，常利用此類(lèi)反應(yīng)。(2)不可逆沉淀反應(yīng)：此時(shí)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來(lái)溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金屆離子或某些有機(jī)酸的反應(yīng)都屬于此類(lèi)。蛋白質(zhì)變性后，有時(shí)由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在(如電荷)，并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定部表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。3.試劉與材料：(1)蛋白質(zhì)溶液500毫升5％卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液(新鮮雞蛋清：水＝1：9)(2)pH4.7醋酸—醋酸鈉的緩沖溶液100毫升(3)3%硝酸銀溶液10毫升(4)5％三氯乙酸溶液50毫升(5)95％乙醇250毫升(6)飽和硫酸銨溶液250毫升(7)硫酸銨結(jié)晶粉末1000克(8)0.1當(dāng)量／升鹽酸溶液300毫升(9)0.1當(dāng)星／升氫氧化鈉溶液100毫升(10)0.1當(dāng)員／升碳酸鈉溶液100毫升(11)0.1當(dāng)量／升醋酸溶液100毫升(12)甲基紅溶液20毫升(13)2％氯化鋇溶液150毫升4.操作方法：(1)蛋白質(zhì)的鹽析。無(wú)機(jī)鹽(硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等)濃溶液能析出蛋白質(zhì)。鹽的濃度不同，析出的蛋白質(zhì)也不同。如球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而清蛋白則在飽和硫酸銨溶液中才能析出。由鹽析獲得的蛋白質(zhì)沉淀，當(dāng)降低其鹽類(lèi)濃度時(shí)，又能再溶解，故蛋白質(zhì)的鹽析作用是可逆過(guò)程。加5％卵靖蛋白溶液5毫升于試管中，再加等量的飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。倒出少量混蝕沉淀，加少量水，是否溶解，為什么？將管內(nèi)容物過(guò)濾，向?yàn)V液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，l此時(shí)析出的沉淀為清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀的再溶解。(2)重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)重金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的復(fù)合物。取一支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2毫升，再加3％硝酸銀溶液1～2滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。放置片刻，傾出上消液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？(3)某些有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)取一支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2毫升，再加入1毫升5％三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。放置片刻，傾出上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。(4)有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)取一支試管，加入2毫升蛋白質(zhì)溶液，再加入2毫升95％乙醇?；靹?，觀察沉淀的生成。(5)乙醇引起的變性與沉淀取3支試管，編號(hào)。依下表順序加入試劑：振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管內(nèi)加水8毫升，然后在第2、3號(hào)管中各加一滴甲基紅．再分別用0.1當(dāng)量／升醋酸溶液及0.1當(dāng)星／升碳酸鈉溶液中和之。觀察各管顏色的變化和沉淀的生成。每管再加0.1當(dāng)量／升鹽酸溶液數(shù)滴，觀察沉淀的再溶解。解釋各管發(fā)生的全部現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)及等電點(diǎn)的測(cè)定蛋白質(zhì)和氨基酸一樣是兩性電解質(zhì)。調(diào)節(jié)溶液的酸堿度達(dá)到一定的離子濃度時(shí)，白質(zhì)分子所帶的正電荷和負(fù)電荷相等，以兼性離子狀態(tài)存在，在電場(chǎng)內(nèi)該蛋白質(zhì)分子不向陰極移動(dòng)，也不向陽(yáng)極移動(dòng)，這時(shí)溶液的pH值稱(chēng)為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)。當(dāng)+液的pH值低于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，即在H較多的條件下，蛋白質(zhì)分子帶正電荷成為—離子，當(dāng)溶液的pH值大于等電點(diǎn)時(shí)，即在OH較多的條件下，蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷成陰離子。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)在不同pH溶液中形成的混濁度來(lái)確定其等電點(diǎn)，在等電點(diǎn)蛋白質(zhì)溶解度最小，最容易沉淀析出。(三)蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)蛋白質(zhì)分子由于形成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的膠體顆粒。但是，蛋白質(zhì)膠體顆粒的穩(wěn)定性是有條件的、相對(duì)的。在一定的物理化學(xué)因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒失去電荷、脫水，甚至變性而喪失穩(wěn)定因素，即以固態(tài)形式從溶液中析出，這種作用稱(chēng)為蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)。該反應(yīng)可分為以下兩種類(lèi)型:1.可逆沉淀反應(yīng)在發(fā)生沉淀反應(yīng)時(shí)，蛋白質(zhì)雖已沉淀析出，但其分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著變化，基本上保持原有的性質(zhì)。沉淀因素除去后，蛋白質(zhì)沉淀可再溶于原來(lái)的溶劑中。這種沉淀反應(yīng)稱(chēng)為可逆沉淀反應(yīng)。屬于此類(lèi)反應(yīng)的有鹽析作用；在低溫下，乙醇或丙酮對(duì)蛋白質(zhì)的短時(shí)間作用以及等電點(diǎn)沉淀等。用大量中性鹽使蛋白質(zhì)從溶液中析出的過(guò)程稱(chēng)為蛋白質(zhì)的鹽析作用。蛋白質(zhì)是親水膠體，在高濃度的中性鹽影響下，蛋白質(zhì)分子被鹽脫去水化層，同時(shí)，蛋白質(zhì)分子所帶的電荷被中和，蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性遭到破壞而沉淀析出。沉淀出的蛋白質(zhì)仍保持其天4然蛋白質(zhì)的性質(zhì)，若減低鹽的濃度時(shí)，還能溶解。沉淀不同的蛋白質(zhì)所需中性鹽的濃度、種類(lèi)不同，所以在不同條件下，采用不同濃度的鹽類(lèi)可將各種蛋白質(zhì)從混合溶液中分別沉淀析出，這種方法稱(chēng)為蛋白質(zhì)的分級(jí)鹽析。它在酶的生產(chǎn)和制備等工作中被廣泛應(yīng)用。2.不可逆的沉淀反應(yīng)在發(fā)生沉淀反應(yīng)時(shí)，蛋白質(zhì)的分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)，空間構(gòu)象遭到破壞，失去其天然蛋白質(zhì)的性質(zhì)，這時(shí)蛋白質(zhì)已發(fā)生變性。變性后的蛋白質(zhì)沉淀不能再溶解于原來(lái)的溶液中，這種沉淀反應(yīng)稱(chēng)為不可逆沉淀反應(yīng)。重金屬鹽、生物堿試劑、過(guò)酸、過(guò)堿、加熱、震蕩、超生波、有機(jī)溶劑等都能使蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆沉淀反應(yīng)。重金屬鹽類(lèi)易與蛋白質(zhì)結(jié)合成穩(wěn)定的沉淀而析出。蛋白質(zhì)在水溶液中是酸堿兩性電解質(zhì)，在堿性溶液中（對(duì)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)而言），蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，能與帶正電荷的2+2+2+2+3+金屬離子，如Zn、Cu、Hg、Pb、Fe結(jié)合成蛋白質(zhì)鹽。在有機(jī)體內(nèi)，蛋白質(zhì)常以其可溶性的鈉鹽或鉀鹽存在，當(dāng)加入汞、鉛、銅、銀等重金屬鹽時(shí)，則蛋白質(zhì)形成不溶性的鹽類(lèi)而沉淀。經(jīng)過(guò)這種處理后的蛋白質(zhì)沉淀不再溶解在水中，說(shuō)明它已發(fā)生了變性。重金屬鹽類(lèi)沉淀蛋白質(zhì)的反應(yīng)通常很完全。因此，生化分析中，常用重金屬鹽除去體液中的蛋白質(zhì);臨床上則用蛋白質(zhì)解除重金屬鹽食物性中毒。但應(yīng)注意，過(guò)量的醋酸鉛或硫酸銅可使沉淀的蛋白質(zhì)再溶解。蛋白質(zhì)在有機(jī)酸的作用下帶正電荷，與酸根的負(fù)電荷結(jié)合成為溶解度很小的鹽類(lèi)而沉淀。三氯乙酸和磺基水楊酸最有效，可將血清等生物體液中的蛋白質(zhì)完全除去，因此得到廣泛應(yīng)用?！緦?shí)驗(yàn)試劑和器材】（一）試劑1.卵清蛋白溶液：取5ml雞蛋清，用蒸餾水稀釋至100ml，攪拌均勻后用4—層紗布過(guò)濾,新鮮配制。2.0.5%酪蛋白(以0.01NNaOH作溶劑)3.酪蛋白-醋酸鈉溶液：稱(chēng)取純酪蛋白0.25克，加蒸餾水20ml及1.00NNaOH溶液5ml(必須準(zhǔn)確)。搖蕩使酪蛋白溶解。然后加1.00N醋酸5ml((必須準(zhǔn)確)，倒入50ml蒸餾瓶?jī)?nèi)，用蒸餾水稀釋至刻度，混勻，結(jié)果是酪蛋白溶于0.10N醋酸鈉溶液內(nèi)，酪蛋白的濃度為0.5%。4.蛋白質(zhì)-NaCl溶液:取20ml蛋清,加蒸餾水200ml和飽和氯化鈉溶液100ml，充分?jǐn)噭蚝?，以紗布濾去不溶物（加入氯化鈉的目的是溶解球蛋白）。5.0.5%甘氨酸，0.3%酪氨酸，0.5%色氨酸6.尿素，雙縮脲試劑，0.1%茚三酮乙醇溶液，濃硝酸，10%NaOH7.0.01%溴甲酚綠指示劑，0.02NHCl，0.02NNaOH，0.01NHAc，0.10NHAc，1.00NHAc8.飽和硫酸銨溶液,硫酸銨粉末,2%硝酸銀,0.1%硫酸銅,飽和硫酸銅,10%三氯乙酸,（二）器材試管及試管架，酒精燈，玻璃漏斗，濾紙，移液管，滴管，恒溫水浴?！緦?shí)驗(yàn)方法】1.雙縮脲反應(yīng)取少量尿素結(jié)晶，加入干燥試管中。用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開(kāi)始硬化時(shí)，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷后加入10滴雙縮脲試劑，混勻,觀察顏色變化。另取1支試管，加入卵清蛋白溶液1ml再加入5滴雙縮脲試劑，混勻，觀察顏色變化。2.茚三酮反應(yīng)取2支試管，分別加入卵清蛋白溶液和0.5%甘氨酸溶液4滴，再加入2滴0.1%茚三酮乙醇溶液，混勻，在沸水浴中加熱1-2分鐘，觀察顏色變化，并比較蛋白質(zhì)和氨基酸呈色深淺。3.黃色反應(yīng)按下表分別向6支試管中加入試劑，微火小心加熱(不必沸騰)，觀察顏色變化。再滴加10%NaOH溶液使呈堿性，觀察顏色變化。管號(hào)123456卵清蛋白0.3%酪氨酸0.3%色氨酸5%苯酚指甲頭發(fā)樣品(滴)4444少許少許濃硝酸(滴)222220204.蛋白質(zhì)的兩性反應(yīng)（1）取1支試管，加入1ml0.5%酪蛋白和5-7滴0.01%溴甲酚綠指示劑（變色范圍是pH3.8—5.4，在酸性溶液中為黃色，在堿性溶液中為藍(lán)色），混勻，觀察溶液的顏色。（2）用滴管緩慢加入0.02NHCl溶液，隨加隨搖，直到有大量沉淀產(chǎn)生。說(shuō)明原因，并觀察溶液顏色的變化。（3）繼續(xù)滴入0.02NHCl溶液，觀察沉淀和溶液顏色的變化，說(shuō)明原因。（4）再緩慢滴入0.02NNaOH溶液，觀察沉淀和溶液顏色的變化過(guò)程，說(shuō)明原因。5.酪蛋白等電點(diǎn)的測(cè)定取9試管編號(hào)后按下表順序準(zhǔn)確加入試劑。加入每種試劑后應(yīng)混勻。（單位：ml）123456789123456789管號(hào)試劑蒸餾水2.43.2—2.03.03.51.52.753.381.00NHAc1.60.8———————0.10NHAc——4.02.01.00.5———0.01NHAc——————2.51.250.62酪蛋白-NaAc1.01.01.01.01.01.01.01.01.0溶液的最終pH3.53.84.14.44.75.05.35.65.9沉淀出現(xiàn)的情況靜置約20分鐘,觀察每支試管內(nèi)的混濁度,以-,+,++,+++,++++符號(hào)表示沉淀的多少。根據(jù)觀察結(jié)果，指出哪個(gè)pH是酪蛋白的pI。6.蛋白質(zhì)的鹽析作用(選做)取1支試管，加入3ml蛋白質(zhì)-NaCl溶液和3ml飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置0分鐘，球蛋白則沉淀析出。過(guò)濾后向?yàn)V液中加入硫酸銨粉末，邊加邊用玻璃棒攪拌，至粉末不再溶解，析出的沉淀為清蛋白。靜置，棄上部清液，取部分清蛋白沉淀加水稀釋?zhuān)^察它是否溶解。7.重金屬沉淀蛋白質(zhì)(選做)取2支試管，各加入約1ml卵清蛋白質(zhì)液，分別加入2%硝酸銀溶液及0.1%硫酸銅溶液1滴，觀察沉淀的生成。對(duì)第2支試管再加入過(guò)量的飽和硫酸銅溶液，觀察沉淀的再溶解。8.有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)(選做)取1支試管，加入卵清蛋白質(zhì)液約0.5ml，然后滴加10%三氯乙酸溶液數(shù)滴，觀察沉淀的生成?！舅伎碱}】1.如果蛋白質(zhì)水解作用一直進(jìn)行到雙縮脲反應(yīng)呈陰性結(jié)果，此作何結(jié)論?2.茚三酮反應(yīng)的陽(yáng)性結(jié)果是否經(jīng)常是同一色調(diào)?若不是，為什么?3.在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度為什么最低?4.蛋白質(zhì)分子中的哪些基團(tuán)可以與(1)重金屬離子作用而使蛋白質(zhì)沉淀?(2)有機(jī)酸、無(wú)機(jī)酸作用而使蛋白質(zhì)沉淀?實(shí)驗(yàn)三糖類(lèi)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)（一）(糖的顏色反應(yīng))一．目的要求1、了解糖類(lèi)某些顏色反應(yīng)的原理。２、學(xué)習(xí)應(yīng)用糖的顏色反應(yīng)鑒別糖類(lèi)的方法。二.原理

糖經(jīng)濃無(wú)機(jī)酸處理，脫水產(chǎn)生糠醛或糠醛衍生物。戊糖形成糠醛，己糖則形成羥甲基糠醛。這些糠醛和糠醛衍生物在濃無(wú)機(jī)酸作用下，能與酚類(lèi)化合物縮合生成有色物質(zhì)。與一元酚如α－萘酚作用，形成三芳香環(huán)甲基有色物質(zhì)。與多元酚如間苯二酚作用，則形成氧雜蒽有色物質(zhì)，反應(yīng)式如下：

通常使用的無(wú)機(jī)酸為硫酸。如用鹽酸，則必須加熱。常用的酚類(lèi)為α－萘酚、甲基苯二酚、間苯二酚和間苯三酚等，有時(shí)也用芳香胺、膽酸、某些吲哚衍生物和一些嘧啶類(lèi)化合物等。有人認(rèn)為，用濃硫酸作為脫水劑時(shí)，形成有顏色的產(chǎn)物與酚核的磺化有關(guān)，見(jiàn)如下反應(yīng)式：一、糖的呈色反應(yīng)1．Molish反應(yīng)（α－萘酚反應(yīng)）本實(shí)驗(yàn)是鑒定糖類(lèi)最常用的顏色反應(yīng)。糖在濃酸作用下形成的糠醛及其衍生物與α－萘酚作用，形成紅紫色復(fù)合物。在糖溶液與濃硫酸兩液面間出現(xiàn)紫環(huán)，因此又稱(chēng)紫環(huán)反應(yīng)。自由存在和結(jié)合存在的糖均呈陽(yáng)性反應(yīng)。此外，各種糠醛衍生物、葡萄糖醛酸、丙酮、甲酸、乳酸等皆呈顏色近似的陽(yáng)性反應(yīng)。因此，陰性反應(yīng)證明沒(méi)有糖類(lèi)物質(zhì)的存在；而陽(yáng)性反應(yīng)，則說(shuō)明有糖存在的可能性，需要進(jìn)一步通過(guò)其他糖的定性試驗(yàn)才能確定有糖的存在。２器材（１）試管及試管架（２）滴管３試劑（１）莫氏試劑５％a-奈酚的酒精溶液１５００毫升（２）１％葡萄糖溶液１００毫升（３）１％果糖溶液１００毫升（４）１％蔗糖溶液１００毫升（５）１％淀粉溶液１００毫升（６）０．１％糠醛溶液１００毫升（７）濃硫酸５００毫升４、取五支試管，分別加入１％葡萄糖溶液、１％果糖溶液、１％蔗糖溶液、１％淀粉溶液、０．１％糠醛溶液各一毫升。再向五支試管中個(gè)加入２滴莫氏試劑，充分混合。斜執(zhí)試管，沿管壁慢慢加入濃硫酸約１毫升，慢慢立起試管，切勿搖動(dòng)。濃硫酸在試液下形成兩層。在二液分解出有紫紅色環(huán)出現(xiàn)。觀察、記錄各管的顏色。２．Seliwanoff反應(yīng)（間苯二酚反應(yīng)）該反應(yīng)是鑒定酮糖的特殊反應(yīng)。在酸作用下，己酮糖脫水生成羥甲基糠醛。后者與間苯二酚結(jié)合生成鮮紅色的化合物，反應(yīng)迅速，僅需20—30s。在同樣條件下，醛糖形成羥甲基糠醛較饅。只有糖濃度較高時(shí)或需要較長(zhǎng)時(shí)間的煮沸，才給出微弱的陽(yáng)性反應(yīng)。蔗糖被鹽酸水解生成的果糖也能給出陽(yáng)性反應(yīng)。２、器材（１）試管及試管架（２）滴管（３）水浴鍋３、試劑（１）塞氏試劑１０００毫升（２）１％葡萄糖溶液１００毫升（３）１％果糖溶液１００毫升（４）１％蔗糖溶液１００毫升４、操作取三支試管，分別加入１％葡萄糖溶液、１％果糖溶液、１％蔗糖溶液各０．５毫升。再向各管分別加入塞氏試劑５毫升，混勻。將三支試管同時(shí)放入沸水浴中，注意觀察、記錄各管顏色的變化及變化時(shí)間。思考題可用何種反應(yīng)鑒別酮糖的存在？２、a-奈酚反應(yīng)的原理？實(shí)驗(yàn)總結(jié)（一）a-奈酚反應(yīng)試劑現(xiàn)象解釋現(xiàn)象１％葡萄糖溶液１％果糖溶液１％蔗糖溶液１％淀粉溶液０、１％糠醛溶液（二）間苯二酚反應(yīng)試劑現(xiàn)象解釋現(xiàn)象１％葡萄糖溶液１％果糖溶液１％蔗糖溶液實(shí)驗(yàn)四糖類(lèi)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)（二）(糖類(lèi)的還原作用)目的學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定糖類(lèi)還原性的方法及其原理。二、原理含有自由醛基或酮基的單糖和二糖為還原糖。在堿性溶液中，還原糖能將金屬離子（銅、鉍、汞、銀等）還原，糖本身被氧化成酸類(lèi)化合物，此性質(zhì)常用于檢驗(yàn)糖的還原性，并且常成為測(cè)定還原糖含量的各種方法的依據(jù)。1．Fehling反應(yīng)費(fèi)林試劑是含有硫酸銅與酒石酸鉀鈉的氫氧化鈉溶液。硫酸銅與堿溶液混合加熱，則生成黑色的氧化銅沉淀。若同時(shí)有還原糖存在，則產(chǎn)生黃色或磚紅色的氧化亞銅沉淀。上述反應(yīng)可用下列方程式表示：在堿性條件下，糖不僅發(fā)生烯醇化、異構(gòu)化等作用。也能發(fā)生糖分子的分解、氧化、還原或多聚作用等。由這些作用所形成的復(fù)雜混合物具有強(qiáng)烈的還原作用，因此企圖用簡(jiǎn)單的氧化還原作用來(lái)寫(xiě)出反應(yīng)平衡式是不可能的。為了防止銅離子和堿反應(yīng)生成氫氧化銅或堿性碳酸銅沉淀，F(xiàn)ehling試劑中加入酒石酸鉀鈉，它與Cu2+形成的酒石酸鉀鈉絡(luò)合銅離子是可溶性的絡(luò)離子，該反應(yīng)是可逆的。平衡后溶液內(nèi)保持一定濃度的氫氧化銅。費(fèi)林試劑是一種弱的氧化劑，它不與酮和芳香醛發(fā)生反應(yīng)．2．Benedict反應(yīng)Benedict試劑是Fehling試劑的改良。它利用檸檬酸作為Cu2+的絡(luò)合劑，其堿性比Fehling試劑弱，靈敏度高，干擾因素少，因而在實(shí)際應(yīng)用中有更多的優(yōu)點(diǎn)。3．Barfoed反應(yīng)該反應(yīng)的特點(diǎn)是在酸性條件下進(jìn)行還原作用。在酸性溶液中，單糖和還原二糖的還原速度有明顯差異。單糖在3min內(nèi)就能還原Cu2+而還原二糖則需20min。所以，該反應(yīng)可用于區(qū)別單糖和還原二糖。當(dāng)加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，非還原性二糖被水解也能呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，如蔗糖在10min內(nèi)水解而發(fā)生反應(yīng)。還原二糖濃度過(guò)高時(shí)，也會(huì)很快呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，若樣品中含有少量氯化鈉也會(huì)干擾此反應(yīng)。三.試劑和器材1、測(cè)試糖液１％葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、1％淀粉溶液各１００毫升。

2、試劑斐林（Fehling）試劑，苯尼迪克特（Benedict）試劑個(gè)１０００毫升。

3、器材試管，試管架，電爐和沸水浴等。四.操作方法先取一支試管加入斐林試劑約１毫升，在加入４毫升蒸餾水，加熱煮沸，如有沉淀生成，說(shuō)明此試劑已不能用。經(jīng)檢驗(yàn)試劑合格后，在進(jìn)行下述試驗(yàn)。取五支試管，分別加入２毫升的斐林試劑，在向各試管分別加入１％葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、1％淀粉溶液各１毫升。置沸水浴中加熱數(shù)分鐘，取出，冷卻。觀察各管溶液的變化。另取六支試管，用苯尼迪克特試劑重復(fù)上述試驗(yàn)。比較兩種試法的結(jié)果。五、思考題１、斐林試劑、苯尼迪克特試劑試法檢驗(yàn)糖的原理是什么？２、試比較斐林試劑、苯尼迪克特試劑試法？實(shí)驗(yàn)總結(jié)斐林試劑、苯尼迪克特試劑法溶液現(xiàn)象試劑１％葡萄糖、１％果糖１％麥芽糖、１％蔗糖1％淀粉溶液斐林試劑苯尼迪克特試劑六.注意事項(xiàng)（l）Molish反應(yīng)非常靈敏，0.001％葡萄糖和0.0001％蔗糖即能呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。因此，不可使碎紙屑或?yàn)V紙毛混入樣品中。過(guò)濃的果糖溶液，由于硫酸對(duì)它的焦化作用，將呈現(xiàn)紅色及褐色而不呈紫色。需稀釋糖溶液后重做．（2）果糖在Seliwanoff試劑中反應(yīng)十分迅速，呈鮮紅色，而葡萄糖所需時(shí)間長(zhǎng)，且只能產(chǎn)生黃色至淡紅色。戊糖亦與Seliwanoff試劑反應(yīng)，戊糖經(jīng)酸脫水生成糠醛，與間苯二酚縮合，生成綠色到藍(lán)色產(chǎn)物。（3）酮基本身并沒(méi)有還原性，只有在變?yōu)橄┐际胶?，才顯示還原作用．（4）糖的還原作用生成氧化亞銅沉淀的顏色決定于顆粒的大小，Cu2O顆粒的大小又決定于反應(yīng)速度。反應(yīng)速度快時(shí)，生成的Cu2O顆粒較小，呈黃綠色；反應(yīng)慢時(shí)，生成的Cu2O顆粒較大，呈紅色。有保護(hù)膠體存在時(shí)，常生成黃色沉淀。實(shí)際生成的沉淀含有大小不同的Cu2O顆粒，因而每次觀察到顏色可能略有不同。溶液中還原糖的濃度可以從生成沉淀的多少來(lái)估計(jì)，而不能依據(jù)沉淀的顏色來(lái)區(qū)別。（5）Barfoed反應(yīng)產(chǎn)生的Cu2O沉淀聚集在試管底部，溶液仍為深藍(lán)色。應(yīng)注意觀察試管底部紅色的出現(xiàn)，它與一般還原性實(shí)驗(yàn)不相同，觀察不到反應(yīng)液由藍(lán)色變綠變黃或變紅的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)五酶的特性一、目的：加深對(duì)酶的性質(zhì)的認(rèn)識(shí)。二、內(nèi)容：·本實(shí)驗(yàn)由溫度對(duì)酶的活力的影響；pH對(duì)酶活力的影響；酶的激活劑及抑制劑；酶的專(zhuān)一性四組實(shí)驗(yàn)組成。(一)溫度對(duì)酶活力的影響1．原理：酶的催化作用受溫度的影響，在最適溫度下，酶的反應(yīng)速度最高。大多數(shù)動(dòng)物酶的最適溫度為37～40℃，植物酶的最適溫度為50～60℃。酶對(duì)溫度的穩(wěn)定性與其存在形式有關(guān)。有些酶的干燥制劑，雖加熱到100℃，其活性并無(wú)明顯改變，但在I100℃的溶液中卻很快地完全失去活性。低溫能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。2．器材：(1)試管及試管架，(2)恒溫水浴。(3)冰浴。(4)沸水浴。3．試劑和材料：(1)0.2％淀粉的0.3％氮化鈉溶液150毫升需新鮮配制。(2)稀擇50倍的唾液50毫升用蒸餾水漱口，以清除食物殘?jiān)?、再含一口蒸餾水，半分鐘后使其流入量簡(jiǎn)并稀碌50倍，(稀釋倍數(shù)可根據(jù)各人唾液淀粉酶活性調(diào)整)混勻備用。(3)碘比鉀—碘溶液50毫升將碘化鉀20克及碘10克溶于100毫升水中。使用前稀釋10倍。4．操作方法：淀粉和可溶性淀粉遇碘呈藍(lán)色。糊精按其分子的大小，退碘可呈藍(lán)色、紫色、暗褐色或紅色。最簡(jiǎn)單的糊精遏碘不呈顏色，麥芽糖遏碘也不呈色。在不同溫度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由水解混合物遇碘呈現(xiàn)的顏色來(lái)判斷。取3支試管，編號(hào)后按下表加入試劑：搖勻后，將1號(hào)、3號(hào)兩試管放人37℃恒溫水浴中，2號(hào)試管放人冰水中。10分鐘后取出，(將2號(hào)管內(nèi)液體分為兩半)用碘化鉀—碘溶液來(lái)檢驗(yàn)1、2、3管內(nèi)淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。記錄并解釋結(jié)果，將二號(hào)管剩下的一半镕液放人37℃水浴中繼續(xù)保溫10分鐘后，再用碘液實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如何？(二)pH對(duì)酶活性的影響1．原理：酶的活力受環(huán)境pH的影響極為顯著；不同酶的最適pH值不同。本實(shí)驗(yàn)觀察pH對(duì)唾液淀粉酶活性的影響，唾液淀粉酶的最適pH約為6．8。2．器材：(1)試管及試管架。(2)吸管。(3)滴管。(4)50毫升錐形瓶。(5)恒溫水浴。3．試劑和材料：(1)新配制的溶于0.3％氯化鈉的0.5％淀粉溶液250毫升(2)稀釋50倍的新鮮唾液100毫升·(3)0.2摩爾／升磷酸氫二鈉溶液600毫升(4)0.1摩爾檸檬酸溶液400毫升(5)碘化鉀—碘溶液50毫升(6)pH試紙：pH＝5、pH＝5．8、pH＝6．8、PH＝8四種4．操作方法：取4個(gè)標(biāo)有號(hào)碼的50毫升錐形瓶。用吸管按下表添加0.2摩爾／升磷酸氫二鈉溶液和0.1摩爾／升檸檬酸溶液以制備pH5．0一8．0的四種緩沖液。從四個(gè)錐形瓶中各取緩沖液3毫升，分別注入4支帶有號(hào)碼的試管中，隨后于每個(gè)試管中添加0.5％淀粉溶液2毫升和稀釋50倍的唾液2毫升。向各試管中加入稀釋唾液的時(shí)間間隔各為1分鐘。將各試管內(nèi)容物混勻，井依次置于37℃恒溫水浴中保溫。第四管加入唾液2分鐘后，每隔I分鐘由第3管取出一滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化鉀—碘溶液，檢驗(yàn)淀粉的水解程度。待混合液變?yōu)樽攸S色時(shí)，向所有試管依次添加1—2滴碘化鉀—碘溶液。添加碘化鉀—碘溶液的時(shí)間間隔，從第一管起，亦均為1分鐘。觀察各試管內(nèi)容物呈現(xiàn)的顏色，分析pH對(duì)唾液淀粉酶活性的影響。(三)唾液淀粉酶的活化和抑制1．原理：酶的活性受活化劑或抑制劑的影響。氯離子為唾液淀粉酶的活化劑，銅離子為其抑制劑。2．器材：(1)恒溫水浴。(2)試管及試管架。3．試劑和材料：(1)0.1％淀扮溶液150毫升(2)稀釋50倍的新鮮唾液150毫升(3)1％氯化鈉溶液50毫升(4)1％硫酸銅镕液50毫升(5)1%硫酸鈉溶液50毫升(6)碘化鉀—碘溶液100毫升4．操作方法：解釋結(jié)果，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)第3管的意義。(四)酶的專(zhuān)一性1．原理：酶具有高度的專(zhuān)一性。本實(shí)驗(yàn)以唾液淀粉酶和蔗糖酶對(duì)淀粉和蔗糖的作用為例，來(lái)說(shuō)明酶的專(zhuān)一性。淀粉和蔗糖無(wú)還原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有還原性的麥芽糖，但不能催化蔗糖的水解，蔗糖酶能催化蔗糖水解產(chǎn)生還原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解，用Benedict試劑檢查糖的還原性。2．器材：(1)恒溫水浴。(2)沸水浴。(3)試管及試管架．3．試劑和材料：(1)2％蔗糖溶液150毫升(2)溶于0.3%的氯化鈉的1％淀粉溶液150毫升(需新鮮配制)(3)稀釋50倍的新鮮唾液100毫升(4)蔗糖酶溶液100毫升將啤酒廠的鮮酵母用水洗滌2—3次(離心法)，然后放在濾紙上自然干燥。取干酵母100克，置于乳缽內(nèi)，添加適量蒸餾水及少量細(xì)沙用力研磨，提取約1小時(shí)，再加蒸餾水使總體積約為原體積的10倍。離心，將上清液保存于冰箱中備用。(5)Benedict氏試劑200毫升無(wú)水硫酸銅1.74克溶于100毫升熱水中，冷卻后稀釋至150毫升。取檸檬酸鈉173克，無(wú)水碳酸鈉100克和600毫升水共熱，溶解后冷卻并加水至850毫升。再將冷卻的150毫升硫酸銅溶液傾入。本試劑可長(zhǎng)久保存。4.操作方法(1)淀粉酶的專(zhuān)一性：解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果(提示：唾液除含淀粉酶外近合有少旦麥芽糖酶)。(2)蔗糖酶的專(zhuān)一性：解釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。三、注意事項(xiàng)

（1）各人唾液中淀粉酶活力不同，因此實(shí)驗(yàn)2、3、4應(yīng)隨時(shí)檢查反應(yīng)進(jìn)行情況。如反應(yīng)進(jìn)行得太快，應(yīng)適當(dāng)稀釋唾液；反之，則應(yīng)減少唾液淀粉酶稀釋倍數(shù)。（2）酶的抑制與激活最好用經(jīng)透析的唾液，因?yàn)橥僖褐泻猩倭緾l－。另外，注意不要在檢查反應(yīng)程度時(shí)使各管溶液混雜。四、思考題：

１．何謂酶的最適pH和最適溫度？

２．說(shuō)明底物濃度、酶濃度、溫度和pH對(duì)酶反應(yīng)速度的影響。３．酶作為一種生物催化劑，有哪些催化特點(diǎn)？４．為什么溫度會(huì)影響酶的活性？５．PH值對(duì)酶的活性如何影響？什么是最適PH？與那些因素有關(guān)？６．為什么溫度對(duì)酶的活性具有雙重影響？什么是酶的最適溫度？它是表征常數(shù)嗎？與那些因素有關(guān)？有何實(shí)踐意義。實(shí)驗(yàn)六甲醛滴定法測(cè)定氨基氮一、目的：初步掌握甲醛滴定法測(cè)定氨基酸含量的原理和操作要點(diǎn)。二、原理：氨基酸是兩性電解質(zhì)，在水溶液中有如下平衡：－NH3是弱酸，完全解離時(shí)pH為11—12或更高，若用堿滴定一NH3所釋放的H＋來(lái)測(cè)量氨基酸，一般指示劑變色域小于10，很難準(zhǔn)確指示終點(diǎn)。常溫下，甲醛能迅速與氨基酸的氨基結(jié)合，生成羥甲基化合物，使上述平衡右移，促使－NH3釋放H+，使溶液的酸度增加，滴定終點(diǎn)移至酚酞的變色域內(nèi)(pH9．0左右)。因此，可用酚酞作指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定。如樣品為一種已知的氨基酸，從甲醛滴定的結(jié)果可算出氨基氮的含量。如樣品是多種氨基酸的混合物如蛋白水解液，則滴定結(jié)果不能作為氨基酸的定量依據(jù)。但此法簡(jiǎn)便快速，常用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的水解程度，隨水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加時(shí)，表示水解作用已完全。三、器材：1．25毫升錐形瓶。2．3毫升微量滴定管。3．吸管。四、試劑：1．0．1當(dāng)量／升標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液300毫升準(zhǔn)確稱(chēng)取750毫克甘氨酸，溶解后定容至100毫升。2．0．1當(dāng)量／升標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液500毫升3．酚酞指示劉20毫升0.5％酚酞的50％乙酵溶液4．中性甲醛溶液400毫升在50毫升36—37％分析純甲醛溶液中加入1毫升0.1％酚酞乙醇水溶液，用0.1當(dāng)量／升的氫氧化鈉镕液滴定到微紅，貯于密閉的玻璃瓶中，此試劑在臨用前配制。如已放置一段時(shí)間，則使用前需重新中和。五、操作方法：錐形瓶編號(hào)試劑樣品1樣品2空白1%甘氨酸溶液或樣品（ml）2.02.0—蒸餾水（ml）5.05.07.0中性甲醛溶液（ml）5.05.05.00.05%溴麝香草酚藍(lán)溶液（滴）2220.5%酚酞乙醇溶液（滴）4441．取3個(gè)25毫升的錐形瓶，編號(hào)。向第1、2號(hào)瓶?jī)?nèi)各加入0.1當(dāng)量／升的標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸溶液2毫升和水5毫升，混勻。向3號(hào)瓶?jī)?nèi)加入7毫升水。然后向三個(gè)瓶中各加入5滴酚酞指示劑，混勻后各加2毫升甲醛溶液再混勻，分別用0.1當(dāng)量／升標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至溶液顯微紅色。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)2次，記錄每次每瓶消耗標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的毫升數(shù)。取平均值，計(jì)算甘氨酸氨基氮的回收率。公式中實(shí)際測(cè)得量為滴定第1和2號(hào)瓶耗用的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液毫升數(shù)的平均值與第3號(hào)瓶耗用的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液毫升數(shù)之差乘以標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉的當(dāng)量濃度，再乘以14．008。2毫升乘以標(biāo)準(zhǔn)甘氨酸的當(dāng)量濃度再乘14．008、即為加入理論量的毫克數(shù)。2．取未知濃度的甘氨酸溶液2毫升，依上述方法進(jìn)行測(cè)定，平行做幾份，取平均值。計(jì)算每毫升甘氨酸溶液中含有氨基氮的毫克數(shù)。公式中V未為滴定待測(cè)液耗用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的平均毫升數(shù)。V對(duì)為滴定對(duì)照液(3號(hào)瓶)耗用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液的平均毫升數(shù)。NNaOH為標(biāo)推氫氧化鈉溶液的真實(shí)當(dāng)量濃度。五、注意事項(xiàng)利用甲醛滴淀法可以用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的水解程度。隨著蛋白質(zhì)水解度的增加，滴定值也增加，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解完成后，滴定值不再增加。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告根據(jù)滴定結(jié)果，總結(jié)分析此法在實(shí)際應(yīng)用中的優(yōu)缺點(diǎn)。，七、思考題1、甲醛法測(cè)定氨基酸含量的原理是什么/2、為什么氫氧化鈉溶液滴定氨基酸的—N+H3基上的H+，不能用一般的酸堿指示劑？實(shí)驗(yàn)七脂肪酸的β-氧化一、目的：了解脂肪酸的β—氧化作用。二、原理：在肝臟中，脂肪酸經(jīng)β—氧化作用生成乙酰輔酶A。兩分子乙酰輔酶A可縮合生成乙酰乙酸。乙酰乙酸可脫羧生成丙酮，也可還原生成真β—羥丁酸。乙酰乙酸、β—羥丁酸和丙酮總稱(chēng)為酮體。本實(shí)驗(yàn)用新鮮肝糜與丁酸保溫，生成的丙酮在堿性條件下，與碘生成碘仿。反應(yīng)式如下：剩余的碘，可用標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液滴定。根據(jù)滴定樣品與滴定對(duì)照所消耗的硫化硫酸鈉溶液體積之差，可以計(jì)算由丁酸氧化生成丙酮的量。三、器材：1．5毫升微量滴定管。2．恒溫水浴。3．吸管。4．剪刀及鑷子。5．50毫升錐形瓶。6．漏斗。7．試管及試管架。四、試劑和材料：1．家兔2．0.1％淀粉溶液20毫升3．0．9％氯化鈉溶液200毫升4．0．5當(dāng)量／升丁酸溶液150毫升取5毫升丁酸溶于100毫升0．5當(dāng)量／升氫氧化鈉溶液中。5．15％三氯乙酸溶液200毫升6．10％氫氧比鈉溶液150毫升7．10％鹽酸解液150毫升8．0.1當(dāng)量／升碘溶液200毫升稱(chēng)取12．7克碘和約25克碘化鉀溶于水中，稀釋到1000毫升，混勻，用標(biāo)準(zhǔn)o．1當(dāng)量／升硫代硫酸鈉溶液標(biāo)定。9．標(biāo)推0．02當(dāng)晝／升硫代硫酸鈉溶液500毫引臨用時(shí)將已標(biāo)定的1當(dāng)量／升硫代硫酸鈉溶液稀釋成0．02當(dāng)量／升。10．1／15摩爾／升pH7．6磷酸鹽緩沖液200毫升1/15摩爾／升磷酸氫二鈉86．8毫升與1/15摩爾／升磷酸二氫鈉13．2毫升混合。五、操作方法：1．肝糜制備：將家免頸部放血處死，取出肝臟。用0．9％氯化鈉溶液洗去污血。用濾紙吸去表面的水分。稱(chēng)取肝組織5克置研缽中。加少量0．9％氯化鈉溶液，研磨成細(xì)漿。再加0．9％氯化鈉溶液至總體積為10毫升。2．取2個(gè)50毫升錐形瓶，各加入3毫升1／15摩爾／升pH7．6的磷酸鹽緩沖液。向一個(gè)錐形瓶中加入2毫升正丁酸；另一個(gè)錐形瓶作為對(duì)照，不加正丁酸。然后各加入2毫升肝組織糜?；靹?、置于43℃恒溫水浴內(nèi)保溫。3．沉淀蛋白質(zhì)：保溫1．5小時(shí)后，取出錐形瓶各加入3毫升15％三氯乙酸溶液，在對(duì)照瓶?jī)?nèi)追加2毫升正丁酸，混勻，靜置15分鐘后過(guò)濾。將濾液分別收集在2支試管中。4．酮體的測(cè)定：吸取兩種濾液各2毫升分別放入另外兩個(gè)錐形瓶中，再各加3毫升0．1當(dāng)量／升碘溶液和3毫升10％氫氧化鈉溶液。搖勻后，靜登10分鐘。加入3毫升10％鹽酸溶液中和。然后用0．02當(dāng)量／升標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液滴定剩余的碘。滴至淺黃色時(shí)，加人3滴淀粉溶液作指示劑。搖勻，并繼續(xù)滴到藍(lán)色消失。記錄滴定樣品與對(duì)照所用的硫代硫酸鈉溶液的毫升數(shù)，并按下式計(jì)算樣品中丙酮含量。5．計(jì)算：肝糜催化生成的丙酮量(毫摩爾／克)＝(A—B)×N×5/6A在上式中為滴定對(duì)照所消耗的0．02當(dāng)里／升硫代硫酸鈉溶液的毫升數(shù)。B為滴定樣品所消耗的0．02當(dāng)員／升硫代硫酸鈉溶液的毫升數(shù)。N：為標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液濃度(當(dāng)量／升)。實(shí)驗(yàn)八肝糖原的提取與鑒定肝糖原的提取及鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.了解肝糖原的性質(zhì)并掌握其提取方法。

2.熟悉肝糖原的鑒定方法。

二、實(shí)驗(yàn)原理

糖原屬于高分子糖類(lèi)化合物，是動(dòng)物體內(nèi)糖的主要儲(chǔ)存形式，在肝臟內(nèi)儲(chǔ)量較為豐富。糖原在體內(nèi)的合成與分解代謝，對(duì)血糖濃度的調(diào)節(jié)起著重要的作用。

糖原微溶于水，無(wú)還原性，與碘作用生成紅色。常用的提取肝糖原的方法是將新鮮的肝組織與石英砂共同研磨以破壞肝組織，加入三氯醋酸溶液沉淀其中的蛋白質(zhì)，離心除去沉淀。上清液中的肝糖原則通過(guò)加入乙醇沉淀而得。將沉淀的糖原溶于水，取一部分加入碘觀察顏色反應(yīng)，另一部分經(jīng)酸水解成葡萄糖后，用斑氏試劑(Benedict)檢驗(yàn)。

三、儀器、原料和試劑

儀器

研缽、離心機(jī)、離心管、電爐、廣泛試紙、濾紙、試管等。

原料

新鮮動(dòng)物肝臟

試劑

1.10%的三氯醋酸溶液

2.5%的三氯醋酸溶液

3.95%乙醇

4.濃鹽酸

5.20%的NaOH溶液

6.碘液：碘1g、碘化鉀2g溶于500mL蒸餾水中。

7.斑氏試劑將硫酸銅17.3g溶于100mL溫蒸餾水中；將檸檬酸鈉173g和無(wú)水碳酸鈉100g溶于

700mL溫蒸餾水中，冷卻；將硫酸銅溶液攪拌下緩緩加入檸檬酸和碳酸鈉混合液中，最后用蒸餾水稀釋至1000mL。

四、操作步驟

(一)肝糖原的提取

稱(chēng)取1g左右新鮮動(dòng)物肝臟至研缽中，加入少許石英砂以及1mL10%的三氯醋酸溶液，研磨至糜狀再加入2mL5%的三氯醋酸繼續(xù)研磨片刻，使成均勻糜漿，轉(zhuǎn)入離心管中，2500r/min離心10min。取上清液于另一離心管中，加入等體積的95%乙醇，混勻后靜置片刻，使糖原呈絮狀析出，再放入離心機(jī)2500r/min離心10min。棄去上清液，將離心管倒置于濾紙上。

(二)肝糖原的鑒定

向肝糖原沉淀中加入1mL蒸餾水，用細(xì)玻棒攪拌至溶解，得糖原溶液。

1.取小試管2支，一支加入糖原溶液10滴，另一支加入蒸餾水10滴，然后兩管再各加入碘液2滴，混勻。觀察管中顏色變化，并解釋現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)九瓊脂糖凝膠電泳法凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用的技術(shù)。根據(jù)制備凝膠的材料:瓊脂糖電泳凝膠電泳聚丙烯酰胺電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆窄傊悄z電泳分離DNA的原理和方法二、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。因而就可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過(guò)程可以通過(guò)把分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品DNA濃度。注意事項(xiàng)：EB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作要保持安靜、鎮(zhèn)定，注意樣品不能混樣，三、實(shí)驗(yàn)材料、器具及藥品以前實(shí)驗(yàn)中提取的小麥總DNA和質(zhì)粒樣品。電泳儀，電泳槽，電子天平，移液器，槍頭，微波爐，紫外透射檢測(cè)儀等。瓊脂糖，1XTAE電泳緩沖液，溴化乙錠（EB），6X載樣緩沖液四、實(shí)驗(yàn)步驟⑴1g瓊脂糖加入100ml1×TAE電泳緩沖液中，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。（冷卻到60℃，加入100μl的0.5mg/mlEB，并搖勻。）⑵用膠帶將制膠板兩端封好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入，室溫冷卻凝固。⑶充分凝固后撕掉兩端的膠布，將凝膠置入電泳槽中，加1×TAE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。⑷用移液器吸取總DNA或質(zhì)粒樣品4μl于封口膜上，再加入2μl的6X載樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。⑸打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見(jiàn)到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，電泳約30min-60min。⑹將凝膠放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。⑺將染色后的凝膠置于紫外透射檢測(cè)儀上，蓋上防護(hù)觀察罩，打開(kāi)紫外燈，可見(jiàn)到發(fā)出熒光的DNA條帶。植物總（核）DNA樣品應(yīng)呈現(xiàn)一條遷移率很小的整齊條帶。質(zhì)粒DNA應(yīng)呈現(xiàn)一到三條不同構(gòu)型的條帶，這時(shí)表明所提樣品較純。溴酚藍(lán)前的熒光區(qū)是樣品中存有的RNA雜質(zhì)。若質(zhì)粒DNA樣品在遷移率小的地方還有熒光條帶，表明質(zhì)粒DNA樣品中有細(xì)菌的染色體DNA污染。瓊脂糖電泳的優(yōu)點(diǎn)（1）瓊脂糖含液體量大，可達(dá)98-99%，近似自由電泳，但是樣品的擴(kuò)散度比自由電泳小。（2）電泳速度快。（3）透明而不吸收紫外線(xiàn)，可以直接用紫外檢測(cè)儀作定量測(cè)定。（4）樣品易回收，常用于制備。配制多大濃度的瓊脂糖凝膠，要根據(jù)被檢的DNA分子大小來(lái)確定。瓊脂糖凝膠濃度與線(xiàn)性DNA分辨范圍常用的電泳緩沖液4℃保存?zhèn)溆?常用的6X載樣緩沖液Ⅰ0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，40%蔗糖水溶液Ⅱ0.25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青，30%甘油水溶液實(shí)驗(yàn)十植物DNA的提取及鑒定一、SOS法（一）試驗(yàn)原理：

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物細(xì)胞的重要組成成分，主要存在于細(xì)胞核中，鹽溶法是提取DNA的常規(guī)技術(shù)之一。從細(xì)胞中分離得到的DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA，其中還含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地將這兩種核蛋白分開(kāi)是技術(shù)的關(guān)鍵。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA則能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用這一性質(zhì)就可以將二者從破碎細(xì)胞漿液中分開(kāi)。制備過(guò)程中，細(xì)胞破碎的同時(shí)就有Dnase釋放到提取液中，使DNA因被降解而影響得率，在提取緩沖液中加入適量的檸檬酸鹽和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白質(zhì)脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）是一切生物細(xì)胞的重要組成成分，主要存在于細(xì)胞核中，鹽溶法是提取DNA的常規(guī)技術(shù)之一。從細(xì)胞中分離得到的DNA是與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA，其中還含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地將這兩種核蛋白分開(kāi)是技術(shù)的關(guān)鍵。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA則能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用這一性質(zhì)就可以將二者從破碎細(xì)胞漿液中分開(kāi)。制備過(guò)程中，細(xì)胞破碎的同時(shí)就有Dnase釋放到提取液中，使DNA因被降解而影響得率，在提取緩沖液中加入適量的檸檬酸鹽和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白質(zhì)變性而與核酸分離，再加入陰離子去垢劑0.15％的SDS，經(jīng)過(guò)2h攪拌，或用氯仿－異醇除去蛋白，通過(guò)離心使蛋白質(zhì)沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的預(yù)冷乙醇即可把DNA從除去蛋白質(zhì)的提取液中沉淀出來(lái)。

（二）試驗(yàn)試劑：1Q+K-f

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1、研磨緩沖液：稱(chēng)取59.63gNaCl，13.25g檸檬酸三鈉，37.2gEDTA－Na分別溶解后合并為一，用0.2mol/L的NaOH調(diào)至pH7.0，并定容至1000ml。7e/D:S:E9C+^)t

2、10×SSC溶液：稱(chēng)取87.66gNaCl和44.12g檸檬酸三鈉，分別溶解，一起定容至1000ml。

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3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀釋10倍。6T!B:x0q!d*K:e5\/p:u6T

4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀釋10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LN