DB12T 505-2014 玉米轉基因成分篩查方法　

DB12DB12/T505—2014玉米轉基因成分篩查方法Screeningmethodforgeneticallymodifiedmaize2014-04-22發(fā)布2014-07-20實施天津市質量技術監(jiān)督局發(fā)布DB12/T505—2014DB12/T505—2014本標準規(guī)定了玉米中轉基因成分定性PCR篩查的術語本標準適用玉米及其制品中zSSIIb基因、HPT基因的定性PCR篩查檢測GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格NY/T672轉基因植物及其產品檢測通用要求農業(yè)部2031號公告—19—2013轉基因植物及其產品檢測抽樣zSSIIb基因zSSIIbgeneCaMV35S啟動子35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus（CaMV）NOS終止子terminatorofnopalinesynthase（NOS）geneBt基因Bt（Bacillusthuringiensis）gene來源與蘇云金芽胞桿菌（Bacillusthur），見的Bt基因有cry1Ac基因、cry1Ab基因、cry1Ab/crybar基因bialaphosresistanceacetyltransferase，PHPT基因HPTgene來源于大腸桿菌或鏈球菌（Streptomyceshygroscopicus編碼潮霉素磷酸轉移酶（hygromycinDB12/T505—20144檢測方法4.1.1實驗用水為重蒸餾水或符合GB/），注：溴化乙錠有致癌作用，配制和使用時應戴），）：）：），），4.1.13引物：玉米內標準基因和轉基因玉米zSSIIbCaMV35SNOSBtbarbar-F：5′-GAAGGCACGCAACGCCTbar-R：5′-CCAGAAACCCACGTCATGC262bpDB12/T505—2014HPThpt-F：5′-GAAGTGCTTGACATTGGGGAGThpt-R：5′-AGATGTTGGCGACCTCGTA472bp4.1.14引物溶液：用TE緩沖液（4水2.5μLDB12/T505—201425mmol/L氯化鎂溶液2.0μL0.25～1.25μL0.25～1.25μL0.025U/μL2.0μL25.0μL測反應體系中，上、下游引物分別是bar-F和bar-R，引物終濃度分別為0.2μmol/L；HPT基因PCR檢測反應體系中，上下游引物分別是hpt-F和hpt-R，引物終濃度分別為0.zSSIIbNOSBtbarHPT4.3.5.1.5反應結束后取出PCR管，對PCR反應產物進行電泳檢測。DB12/T505—2014mL瓊脂糖溶液中加入5μLEB溶液，混勻，稍適冷卻后，將其倒入電泳板上，插條件下電泳檢測。將回收的PCR產物克隆測序，與玉米內標準基因zSSIIb、CaMV35S、NOS、Bt、bar、HPT基因5.2.1在試樣的PCR反應中，內標準基因得到擴增，且擴增片段大小與預期片段大小一致；而CaMV35S啟動子、NOS終止子、Bt基因、bar基因和HPT基因均未得到擴增，或擴增片段大小與預DB12/T505—2014A.2CaMV35S啟動子PCR擴增產物核苷酸序列