動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù) 豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒

ⅠⅠ動(dòng)物疫病鑒別檢測(cè)技術(shù)豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒1范圍本文件規(guī)定了豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒SYBRGreenI熒光RT-PCR鑒別檢測(cè)。本文件適用于豬瘟強(qiáng)毒與豬瘟疫苗弱毒的鑒別檢測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4試驗(yàn)原理本文件通過(guò)特異性引物，在RT-PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增出了豬瘟疫苗弱毒126bp及豬瘟強(qiáng)毒335bp的目的產(chǎn)物，當(dāng)SYBRGreenI熒光染料與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合時(shí)，熒光信號(hào)增強(qiáng)，從擴(kuò)增產(chǎn)物上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱，不同DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，Tm值不同，通過(guò)Tm值的差異及熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)了豬瘟疫苗弱毒與豬瘟強(qiáng)毒擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒別。注：SYBRGreenI是一種只與雙鏈DNA小溝結(jié)合的染料。5試劑或材料除非另有說(shuō)明，僅使用分析純?cè)噭?.1水：GB/T6682，一級(jí)。5.2焦碳酸二乙酯（DEPC）水：取1mLDEPC加入水至1000mL，充分震蕩混勻，靜置24h后，121℃高壓滅菌15min，2℃～8℃保存?zhèn)溆谩?.3磷酸鹽緩沖溶液（PBS）：取Na2HPO4.12H2O2.9g，KCl0.2g，KH2PO40.2g，NaCl8g，溶于800mL水中，充分?jǐn)嚢枞芙?，滴加濃鹽酸將pH調(diào)節(jié)至7.4，加水定容至1000mL，121℃高壓滅菌15min，2℃～8℃保存?zhèn)溆谩?.4氫氧化鈉溶液（3%）：稱取3g氫氧化鈉，溶于少量水中，放置室溫后，加水定容至100mL。5.5乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（4%）：稱取4g乙二胺四乙酸二鈉，加水定容至100mL。5.6引物：引物名稱和序列見附錄A。5.7商品化病毒核酸提取試劑盒。5.8商品化一步法熒光RT-PCR反應(yīng)試劑。5.9豬瘟疫苗弱毒陽(yáng)性對(duì)照：市售商品化豬瘟兔化弱毒疫苗（傳代細(xì)胞源）。5.10豬瘟疫苗弱毒陰性對(duì)照：DEPC水。5.11豬瘟強(qiáng)毒陽(yáng)性對(duì)照：含有豬瘟強(qiáng)毒株擴(kuò)增目的基因的陽(yáng)性質(zhì)粒。5.12豬瘟強(qiáng)毒陰性對(duì)照：DEPC水。5.13飲用水：清潔、無(wú)異味，pH值在6.5～8.5之間。6儀器設(shè)備6.1二級(jí)生物安全柜。6.2熒光PCR檢測(cè)儀。6.3電子天平：精度0.01g。6.4高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥12000r/min。6.5瞬時(shí)離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥6000r/min。6.6低溫冰柜：-70℃以下。6.7高壓蒸汽滅菌器。6.8干熱滅菌器。7樣品7.1采樣工具7.1.1扁桃體采樣器：鼻鉗子、開口器和采樣槍。使用前均用3%的氫氧化鈉溶液浸泡消毒5min～10min，飲用水流水沖洗2min。7.1.2剪子、鑷子經(jīng)160℃干熱滅菌2h。7.2采樣7.2.1采樣要求采樣過(guò)程按照NY/T541執(zhí)行，采樣及樣品處理過(guò)程中應(yīng)戴一次性手套，樣品間不得交叉污染。7.2.2扁桃體樣品：鼻鉗子固定活豬上顎，用開口器打開口腔，用采樣槍采集扁桃體，滅菌牙簽挑至1.5mL離心管，編號(hào)標(biāo)記。7.2.3內(nèi)臟樣品：采集病死或安樂(lè)死的豬、兔各種內(nèi)臟器官（脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、肺臟、盲腸等）裝入一次性塑料袋或其他滅菌容器，編號(hào)標(biāo)記。7.2.4全血樣品：用無(wú)菌注射器采集全血，注入含有1/10體積4%的EDTA溶液的無(wú)菌容器內(nèi)，充分混勻后編號(hào)備用。7.2.5排泄物樣品：用棉拭子挑取少許新鮮糞便樣品于離心管內(nèi)，加入1mLPBS，震蕩混勻，編號(hào)標(biāo)記。7.2.6細(xì)胞培養(yǎng)物：取1mL細(xì)胞培養(yǎng)物置于離心管內(nèi)，編號(hào)標(biāo)記。7.2.7疫苗樣品：隨機(jī)抽取豬瘟活疫苗樣品3瓶，分別加入2mLPBS，溶解，編號(hào)標(biāo)記。7.3樣品的運(yùn)輸及保存7.3.1運(yùn)輸：采集的樣品密封后，采用保溫箱加冰密封，在2℃～8℃條件下24h內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。7.3.2保存：采集的樣品在2℃～8℃條件下保存，時(shí)間不超過(guò)24h；-20℃不超過(guò)3個(gè)月，-70℃不超過(guò)5年。8試驗(yàn)步驟8.1樣品處理8.1.1扁桃體樣品：樣品加入5倍體積4℃預(yù)冷的DEPC水，充分研磨，4℃、10000r/min離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入離心管中編號(hào)備用。8.1.2內(nèi)臟樣品：樣品加入5倍體積4℃預(yù)冷的DEPC水，充分研磨，4℃、10000r/min離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入離心管中編號(hào)備用。8.1.3排泄物樣品：4℃、10000r/min離心5min，取上清液0.5mL轉(zhuǎn)入離心管中編號(hào)備用。8.1.4細(xì)胞培養(yǎng)物：10000r/min離心5min，取上清液0.5mL轉(zhuǎn)入離心管中編號(hào)備用。8.1.5疫苗樣品：10000r/min離心5min，取上清液0.5mL轉(zhuǎn)入離心管中編號(hào)備用。8.1.6全血樣品：全血樣品可直接用做核酸提取。8.2核酸抽提進(jìn)行豬瘟病毒檢測(cè)時(shí)，生物安全按照GB19489執(zhí)行，采用商品化試劑盒提取病毒核酸。8.3熒光RT-PCR檢測(cè)8.3.1反應(yīng)體系的配制反應(yīng)體系的配制見附錄B。8.3.2加樣在各設(shè)定的熒光RT-PCR管中分別加入陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和提取的試樣溶液2μL，蓋緊管蓋，混勻，瞬時(shí)離心1min。8.3.3測(cè)定參考儀器參數(shù)，選擇SYBRGreenI熒光通道。參考擴(kuò)增條件：第一階段，42℃反轉(zhuǎn)錄5min；第二階段，95℃預(yù)變性10s；第三階段，95℃變性5s，55℃退火10s，72℃延伸20s，40個(gè)循環(huán)。72℃時(shí)設(shè)置采集熒光。第四階段，溶解曲線分析，60℃1min，以0.1℃/s的速率升溫，直到97℃，整個(gè)過(guò)程連續(xù)采集熒光，繪制擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。9結(jié)果判定9.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)9.1.1豬瘟病毒疫苗弱毒9.1.1.1陰性對(duì)照：無(wú)Ct值，無(wú)典型擴(kuò)增曲線，在熔解曲線Tm值為81.5℃±0.5℃范圍內(nèi)未出現(xiàn)熔解峰。9.1.1.2陽(yáng)性對(duì)照：Ct值<30.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且熔解曲線Tm值在81.5℃±0.5℃出現(xiàn)熔解峰，參見附錄C（圖C.1）。9.1.1.3若陰、陽(yáng)性對(duì)照組結(jié)果不成立，則視為無(wú)效檢驗(yàn)。9.1.2豬瘟病毒強(qiáng)毒9.1.2.1陰性對(duì)照：無(wú)Ct值，無(wú)典型擴(kuò)增曲線，在熔解曲線Tm值在83.3℃±0.9℃范圍內(nèi)未出現(xiàn)熔解峰。9.1.2.2陽(yáng)性對(duì)照：Ct值<30.0，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且熔解曲線Tm值在83.3℃±0.9℃出現(xiàn)熔解峰，參見附錄C（圖C.2）。9.1.2.3若陰、陽(yáng)性對(duì)照組結(jié)果不成立，則視為無(wú)效檢驗(yàn)。9.2陰陽(yáng)性結(jié)果的判定9.2.1豬瘟病毒疫苗弱毒9.2.1.1若檢測(cè)樣品無(wú)Ct值并且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，在熔解曲線Tm值為81.5℃±0.5℃范圍內(nèi)未出現(xiàn)熔解峰，則判為豬瘟病毒疫苗弱毒核酸陰性。9.2.1.2若檢測(cè)樣品Ct值≤30.0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且熔解曲線Tm值為81.5℃±0.5℃出現(xiàn)熔解峰，則判為豬瘟病毒疫苗弱毒核酸陽(yáng)性。9.2.1.3若檢測(cè)樣品30.0＜Ct值≤35.0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且熔解曲線Tm值為81.5℃±0.5℃出現(xiàn)熔解峰，則判為可疑?？梢蓸颖具M(jìn)行雙孔重復(fù)試驗(yàn)，若任一孔或兩孔重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性者判為豬瘟病毒疫苗弱毒核酸陽(yáng)性，否則為陰性。9.2.2豬瘟病毒強(qiáng)毒9.2.2.1若檢測(cè)樣品無(wú)Ct值并且無(wú)典型的擴(kuò)增曲線，在熔解曲線Tm值為83.3℃±0.9℃范圍內(nèi)未出現(xiàn)熔解峰，則判為豬瘟病毒強(qiáng)毒陰性。9.2.2.2若檢測(cè)樣品Ct值≤30.0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且熔解曲線Tm值在83.3℃±0.9℃出現(xiàn)熔解峰，則判為豬瘟病毒強(qiáng)毒核酸陽(yáng)性。9.2.2.3若檢測(cè)樣品30.0＜Ct值≤35.0，出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，且熔解曲線Tm值在83.3℃±0.9℃出現(xiàn)熔解峰，則判為可疑。可疑樣本進(jìn)行雙孔重復(fù)試驗(yàn)，若任一孔或兩孔重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性者判為豬瘟病毒強(qiáng)毒核酸陽(yáng)性，否則為陰性。

附錄A（規(guī)范性）引物A.1引物名稱和序列見表A.1表A.1引物名稱和序列引物名稱引物序列（5′—3′）豬瘟病毒疫苗弱毒上游引物GGTCTCCACAGGGGGGGT豬瘟病毒疫苗弱毒下游引物ACTATTCTGTAACCTGTCTCATTT豬瘟病毒強(qiáng)毒上游引物TGGCACATGGAGTTGAATCAT豬瘟病毒強(qiáng)毒下游引物TGCGTCTCATTGAAAAACTCTA注：引物用DEPC水溶解并稀釋至100μmol/L后，-20℃保存?zhèn)溆茫桓鶕?jù)需要配制10μmol/L工作液，-20℃保存供檢測(cè)使用?！涓戒汢（規(guī)范性）熒光RT-PCR反應(yīng)體系配制B.1豬瘟病毒疫苗弱毒熒光RT-PCR反應(yīng)體系配制見表B.1表B.1豬瘟病毒疫苗弱毒熒光RT-PCR反應(yīng)體系試劑1個(gè)檢測(cè)反應(yīng)的加入量2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μLExTaqHS（5U/μL）0.5μL豬瘟病毒疫苗弱毒上游引物1.0μL豬瘟病毒疫苗弱毒下游引物1.0μLRNaseFreedH2O7.5μL試樣溶液2.0uL總體積25.0μLB.2豬瘟病毒強(qiáng)毒熒光RT-PCR反應(yīng)體系配制見表B.2表B.2豬瘟病毒強(qiáng)毒熒光RT-PCR反應(yīng)體系試劑1個(gè)檢測(cè)反應(yīng)的加入量2×OneStepTBGreenRT-PCRBufferⅢ12.5μLPrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.5μLExTaqHS（5U/μL）0.5μL豬瘟病毒強(qiáng)毒上游引物1.0μL豬瘟病毒強(qiáng)毒下游引物1.0μLRNaseFreedH2O7.5μL試樣溶液2.0uL總體積25