《奶牛瘤胃源性乳腺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》

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團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

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奶牛瘤胃源性乳腺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)

Diagnosticcriteriaofruminaldysbiosis-inducedmastitisondairycows

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XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實(shí)施

中國獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布

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奶牛瘤胃源性乳腺炎診斷規(guī)范

1范圍

本文件規(guī)定了奶牛瘤胃源性乳腺炎的定義以及其診斷標(biāo)準(zhǔn)和方法。

本文件適用于牧場獸醫(yī)、動(dòng)物診療人員和科研人員對(duì)奶牛瘤胃源性乳腺炎的診斷。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1瘤胃源性乳腺炎R(shí)uminaldysbiosis-inducedmastitis

飼料成分或比例突然變更等應(yīng)激因素導(dǎo)致奶牛瘤胃內(nèi)環(huán)境失衡，瘤胃菌群、代謝及神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，

有害菌及其代謝物通過作用于上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、瘤胃神經(jīng)等破壞瘤胃屏障，引起瘤胃屏障通透性增

加；有害菌、代謝物和神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)一步通過損傷的瘤胃屏障誘導(dǎo)瘤胃及系統(tǒng)性炎癥、促進(jìn)瘤胃內(nèi)免疫細(xì)

胞向乳腺遷移、破壞系統(tǒng)性代謝穩(wěn)態(tài)、激活瘤胃-乳腺介導(dǎo)途徑、促使有害菌從瘤胃向乳腺遷移，從而

破壞血乳屏障，導(dǎo)致瘤胃源性乳腺炎。

3.2保定Restraint

通過物理方法或者化學(xué)方法限制動(dòng)物的活動(dòng)，使其易于進(jìn)行檢查、診療等操作，從而保障人畜安全

所采取的措施。

3.3前胃弛緩HypotoniaandAtoniaofForestomaches

是指瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃神經(jīng)肌肉裝置感受性降低，平滑肌自動(dòng)運(yùn)動(dòng)性減弱，內(nèi)容物運(yùn)轉(zhuǎn)遲滯所致發(fā)

的反芻動(dòng)物消化障礙綜合征。

3.4體細(xì)胞數(shù)（SCC）

牛奶中的體細(xì)胞多數(shù)是白細(xì)胞，通常由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、多形核中性粒細(xì)胞和少量的乳腺組織

上皮細(xì)胞等組成，約占牛體細(xì)胞數(shù)的95%，其余是乳腺組織脫落的上皮細(xì)胞。通常由每毫升奶含有的體

細(xì)胞數(shù)目表示，即體細(xì)胞數(shù)（somaticcellcount,SCC）。

3.5無菌操作

無菌操作是指在醫(yī)療護(hù)理操作過程中，保持無菌物品、無菌區(qū)域不被污染、防止病原微生物入侵機(jī)

體的一系列操作技術(shù)。

4奶牛瘤胃源性乳腺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)

（1）乳汁SCC≥50萬個(gè)/mL；

（2）瘤胃液pH值<6.0；

（3）纖毛蟲活力降低；

（4）血清LPS水平升高；

（5）伴發(fā)系統(tǒng)性炎癥。

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5奶牛瘤胃源性乳腺炎診斷規(guī)范

5.1器械物品的準(zhǔn)備

保定繩、加州乳房炎實(shí)驗(yàn)（CMT）檢測試劑、體溫計(jì)、聽診器、計(jì)時(shí)器、pH計(jì)、LPS鱟試劑檢測試

劑盒、EDTA-抗凝管、采血針、倒胃管、0.1%高錳酸鉀溶液、注射器或抽濾器、紗布、液氮罐、-80℃冰

箱、50mL無菌離心管、棉線、MiSeq16S宏基因組測序儀、血常規(guī)分析儀。

5.2牛的保定

在牛舍借助頸架，限制牛前后運(yùn)動(dòng)，同時(shí)采用保定繩將牛的頭部固定在頸夾上，頭部不要過高。

5.3CMT檢測乳中SCC

待檢測奶牛四個(gè)乳區(qū)清潔，擦拭后的乳頭必須干凈清潔，沒有糞渣、藥浴液和污水。每個(gè)乳區(qū)棄掉

頭三把奶后擠出2mL被檢乳置于乳房炎檢驗(yàn)盤，隨后加入試劑2mL,緩慢做同心圓狀攪拌10s,觀察判定（判

定結(jié)果參考試劑盒說明書）。以SCC≥50萬個(gè)/mL為乳腺炎奶牛判定標(biāo)準(zhǔn)。

5.4核對(duì)牛的信息

采樣前根據(jù)登記信息，核對(duì)輸液牛的耳標(biāo)號(hào)信息，確認(rèn)無誤。

5.5體溫檢測

體溫測量通過體溫計(jì)檢測直腸溫度，3min-5min。

5.6心率檢測

在安靜狀態(tài)下檢查牛的心率。將聽診器放在心臟的聽診部位在左側(cè)胸壁的前下方，肘關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)

第3～5肋間位置，記錄一分鐘內(nèi)心臟搏動(dòng)次數(shù)。

5.7呼吸頻率檢測

在安靜狀態(tài)下檢查牛的呼吸數(shù)。站在牛胸部的前側(cè)方或腹部的后側(cè)方觀察，胸腹部的一起一伏是一

次呼吸。計(jì)算1分鐘的呼吸次數(shù)。

5.8奶牛前胃弛緩的診斷

主要判定標(biāo)準(zhǔn)：食欲減退、反芻、噯氣紊亂，胃蠕動(dòng)減弱或停止，可繼發(fā)酸中毒。

5.9血常規(guī)檢測

按照儀器說明書進(jìn)行。

5.10血液和瘤胃液LPS濃度檢測

通過LPS鱟試劑盒進(jìn)行檢測，操作方法按照說明書進(jìn)行。

6血液采集

待測牛保定，尾靜脈采血。具體部位為離尾根10cm左右，第4、5尾椎骨交界中點(diǎn)凹陷處，采血者左

手托起牛尾巴，右手對(duì)采血部位消毒后，持一次無菌采血針，右手食指控制針頭深度，由下向上垂直刺

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入牛尾腹側(cè)中心線位置約1cm，見有回血即可抽血，一般采3mL即可，拔出采血針，用酒精棉球壓一下針

孔防止出血。血液立即轉(zhuǎn)移至無熱源ep管中，用于LPS濃度檢測。

7瘤胃液收集

7.1收集前的準(zhǔn)備

將牛保定。瘤胃導(dǎo)管用0.1%的高錳酸鉀浸泡消毒10分鐘，隨后用清水清洗干凈。操作人員要帶口罩、

手套，遵守?zé)o菌操作。

7.2瘤胃液采集

在奶牛采食2h之后且避免剛剛飲水之后采集瘤胃液樣本。把2米長的帶過濾頭的導(dǎo)胃管送入口腔中，

達(dá)咽喉部；待奶牛有吞咽動(dòng)作時(shí)順勢將倒胃管送入至瘤胃；將倒管末端放低或者利用抽濾器或注射器等

抽出導(dǎo)管內(nèi)空氣，使瘤胃液流出；為防止唾液污染，棄去前100mL瘤胃液,再繼續(xù)收集50mL；收集的瘤胃

液經(jīng)過4層無菌紗布過濾，收集濾液，放入液氮速凍后放-80℃冰箱保存，用于菌群測序分析。采集完畢

后，導(dǎo)管向地面傾斜，防止拔管過程中采集管里殘留的瘤胃液流入氣管，隨后將導(dǎo)管緩慢抽出，并放置

在盛有蒸餾水的盆中，溫水反復(fù)換水沖洗導(dǎo)管。

7.3瘤胃液的pH檢測

通過倒胃管收集的瘤胃液四層紗布過濾后立即用pH計(jì)檢測瘤胃液pH值。

7.4瘤胃菌群分析

采用CTAB或SDS方法提取樣本基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度和濃度，無菌稀釋至

1ng/μL。以稀釋的基因組DNA為模板，選擇16SV4區(qū)引物（515F和806R）、Phusion?High-FidelityPCR

MasterMixwithGCBuffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物用2%濃度的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，

根據(jù)濃度等量混樣，混勻后再次通過2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并對(duì)目的條帶回收。隨后進(jìn)行建庫，

Qubit和Q-PCR定量，NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測序。

7.5瘤胃纖毛蟲活力檢測

新鮮瘤胃液用四層紗布過濾后，滴一滴于干凈載玻片上涂成薄層，蓋上蓋玻片后低倍鏡觀察10個(gè)視

野，計(jì)算每個(gè)視野中纖毛蟲的平均數(shù)和有活力的纖毛蟲百分?jǐn)?shù)。

8注意事項(xiàng)

8.1按照登記信息，檢查所選牛只是否正確；

8.2保定牛應(yīng)確實(shí)，確保人畜安全；

8.3檢測SCC時(shí)，保證乳區(qū)干凈且每個(gè)乳區(qū)棄掉頭三把奶。

8.4瘤胃液采集遵守?zé)o菌操作，盡量避免環(huán)境微生物對(duì)瘤胃微生物的污染；

8.5用于檢測LPS濃度的血液和瘤胃液樣本處理過程中均用無熱源管，防止LPS受到污染；

8.6導(dǎo)出瘤胃液過程切記判斷導(dǎo)管是否插入瘤胃，避免導(dǎo)管進(jìn)入氣管對(duì)牛只造成傷害；