腸道病毒71型滅活疫苗

Enterovirustype71inactivatedvaccine課程：生物技術(shù)制藥班級(jí)：2013生技一班腸道病毒71型滅活疫苗2021/6/271EV71圖片腸道病毒71型(enterovirus71，EV71)為單股正鏈ＲNA病毒，是?。襈A病毒科腸道病毒屬中的重要成員之一。EV71基因組由7400多個(gè)核苷酸構(gòu)成，包含一個(gè)開放讀碼框，編碼大約2200個(gè)氨基酸的多聚蛋白。該多聚蛋白可被進(jìn)一步水解成P1、P2和P3三個(gè)前體蛋白，P1前體蛋白編碼VP1、VP2、VP3和VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白，P2、P3前體蛋白編碼7種非結(jié)構(gòu)蛋白(2A～2C和3A～3D)

EV71包括A、B和C3種基因型，11個(gè)基因亞型，每種亞型感染均可引起手足口病(hand，footandmouthdisease，HFMDEV71簡(jiǎn)介2021/6/27201020203人血漿中含有的中和抗體可在細(xì)胞基質(zhì)上中和不同的EV71。可減少或消除毒株攻擊乳鼠后的致病及死亡現(xiàn)象，而在毒株攻擊乳鼠的同時(shí)或其后限定的時(shí)間內(nèi)注射含EV71中和抗體的人血漿，可起到保護(hù)乳鼠的作用EV71感染或疫苗免疫動(dòng)物后產(chǎn)生的抗體具有病毒中和活性；中和抗體在體外與EV71中和后，可減少或消除毒株攻擊乳鼠后的致病性；EV71疫苗除能誘導(dǎo)中和抗體外，還能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，其也具有免疫保護(hù)作用。EV71疫苗可行性2021/6/27301020304全病毒滅活疫苗

減毒活疫苗

基因工程疫苗

病毒樣顆粒(VLPs)疫苗

腸道病毒71型疫苗分類05合成肽疫苗

2021/6/274為什么選擇滅活疫苗生產(chǎn)工藝成熟，具有良好的免疫原性及安全性，眾多研究證明滅活EV71病毒疫苗較其他形式疫苗，如VP1亞單位疫苗、DNA疫苗、VLP疫苗有更好的免疫效果，是EV71疫苗發(fā)展的主要類型。目前進(jìn)入臨床研究的5株EV71疫苗均為滅活疫苗，而臨床試驗(yàn)結(jié)果表明這些疫苗均有較好的免疫原性及安全性。（2014）

在中國(guó)內(nèi)地1998年后流行株均為C4，故中國(guó)企業(yè)研發(fā)的疫苗均以C4型毒株作為疫苗株。2021/6/27512二倍體細(xì)胞疫苗生產(chǎn)工藝：ＥＶ７１疫苗株ＦＹ－２３Ｋ－Ｂ株在人二倍體細(xì)胞（ＫＭＢ１７株）上適應(yīng)傳代，收獲病毒液，經(jīng)滅活、濃縮、層析過濾，吸附氫氧化鋁佐劑后，制備成為腸道病毒７１型滅活疫苗成品。Ｖｅｒｏ細(xì)胞疫苗生產(chǎn)工藝：疫苗株ＥＶ７１ＡＨ－ＦＹ７ＶＰ５株或Ｈ０７株感染Ｖｅｒｏ細(xì)胞后，收獲病毒培養(yǎng)液，經(jīng)超濾濃縮、凝膠過濾、離子交換層析純化、甲醛滅活，吸附氫氧化鋁佐劑后，制備ＥＶ7１滅活疫苗成品。

ＥＶ７１滅活疫苗兩種類型2021/6/27601

ＥＶ７１病毒液的培養(yǎng)

及滅活02EV71病毒的純化、檢測(cè)及制備03ＥＶ７１滅活疫苗免疫原性檢測(cè)及保護(hù)性研究ＥＶ７１滅活疫苗制備一般流程2021/6/27712病毒液的滅活收獲病毒液按１∶４０００（Ｖ／Ｖ）加入福爾馬林，３７℃滅活，并每間隔2ｈ取樣，采用微量滴定法進(jìn)行感染性滴度檢測(cè)以觀察其滅活效果。

病毒微量滴定法：將滅活后的病毒液按１０倍梯度稀釋，以１００μｌ／孔置于９６孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度接種８孔，每孔按１×１０４細(xì)胞／１００μｌ培養(yǎng)液加入Ｖｅｒｏ細(xì)胞，３、７ｄ時(shí)觀察記錄病變，超過５０％細(xì)胞病變孔判為病變陽性ＥＶ７１病毒液的滅活2021/6/278EV71病毒的純化、檢測(cè)及制備ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析ＨＰＬＣ檢測(cè)將純化后的產(chǎn)品進(jìn)行滅活疫苗成品的制備010203042021/6/27901020304膜分離技術(shù)

超速離心

凝膠過濾層析（gelfiltrationchromatography，GF）

離子交換層析（ion-exchangechromatography，IEC）

腸道病毒71型滅活疫苗分離純化方法05疏水相互作用層析（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）

2021/6/271003Options02Options01Options疫苗標(biāo)準(zhǔn)方面國(guó)家質(zhì)量控制和審評(píng)部門結(jié)合2010版《中華人民共和國(guó)藥典》和修訂企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)預(yù)防性疫苗的要求，對(duì)申報(bào)臨床試驗(yàn)的滅活疫苗毒株、原液和成品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行規(guī)范和統(tǒng)一。對(duì)種子庫要求疫苗主要保護(hù)區(qū)ＶＰ１氨基酸序列在三級(jí)種子批均保持一致；疫苗純度控制方面在疫苗純度控制上，

高效液相色譜法（ＨＰＬＣ）規(guī)定顆粒峰面積不低于９５．０％，疫苗動(dòng)物效力統(tǒng)一修定為以１針后半數(shù)有效量（ＥＤ５０）作為效力指標(biāo)，保證了疫苗生產(chǎn)的一致性和有效性；標(biāo)準(zhǔn)品方面中國(guó)食品藥品檢定研究院（中檢院）聯(lián)合３家企業(yè)已完成了疫苗中和抗體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品和疫苗抗原定量標(biāo)準(zhǔn)品的研制（２０１０國(guó)生標(biāo)字００２３、００２４）。正在開展的疫苗標(biāo)準(zhǔn)研究包括：比活一致性標(biāo)準(zhǔn)，Ｖｅｒｏ細(xì)胞殘余ＤNＡ標(biāo)準(zhǔn)等；開展的疫苗標(biāo)準(zhǔn)品研究包括疫苗效力標(biāo)準(zhǔn)品和凍干標(biāo)準(zhǔn)中和抗體檢測(cè)株等2021/6/2711目前，亞洲地區(qū)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的滅活疫苗有5家(其中3家來自中國(guó)大陸，另外2家分別來自我國(guó)臺(tái)灣和新加坡)，他們采用的病毒株、細(xì)胞系、培養(yǎng)技術(shù)和免疫佐劑有所不同(表1)北京微谷生物醫(yī)藥有限公司(Vigoo)、中國(guó)科興生物制品有限公司(Inovac)和中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院(CAMS)所研制的疫苗在2013年已完成了臨床Ⅲ期試驗(yàn)，而我國(guó)臺(tái)灣國(guó)家衛(wèi)生研究院(NHＲI)和新加坡Inviragen公司研制的疫苗正在進(jìn)行臨床Ⅰ期試驗(yàn)(表2)。2021/6/2712Vigoo以160、320和640U劑量加以氫氧化鋁佐劑的福爾馬林滅活疫苗隨機(jī)接種包括12～36月齡兒童和6～11月齡嬰兒在內(nèi)的12000名受試者。結(jié)果顯示，疫苗仍然具有較好的疫苗效能，可使約90%的受試者能抵御HFMD，80%的抵御皰疹性咽峽炎或相關(guān)神經(jīng)癥狀。Sinovac分別以400U加以氫氧化鋁佐劑的疫苗或安慰劑隨機(jī)接種10077名受試者，其疫苗效能可達(dá)88%以上。CAMS則對(duì)12000名6～71月齡的嬰兒和兒童隨機(jī)接種了100U疫苗或安慰劑，疫苗也顯示出了良好的安全性和免疫原性，但具體信息不詳NHＲI研制的疫苗不僅對(duì)EV71B1、B5和C4A亞型具有較強(qiáng)的中和活性，對(duì)柯薩奇病毒A16也有一定的交叉中和活性在Ⅲ期試驗(yàn)中2021/6/2713中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所全球首個(gè)針對(duì)腸道病毒71型（EV71）感染所致手足口病的創(chuàng)新疫苗通用名稱：腸道病毒71型滅活疫苗（人二倍體細(xì)胞）英文名稱：EnterovirusType71Vaccine,Inactivated（HumanDiploidCell）（1）疫苗毒種是我國(guó)流行株，具有良好的免疫原性和抗原交叉反應(yīng)性。（2）細(xì)胞基質(zhì)采用人胚肺二倍體細(xì)胞，有效保證在兒童群體中使用的安全性。（3）生產(chǎn)技術(shù)采用細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，有效提高疫苗產(chǎn)能和質(zhì)量。（4）建立的疫苗保護(hù)性評(píng)價(jià)嬰猴動(dòng)物模型，為開展疫苗保護(hù)性效果的系統(tǒng)分析和評(píng)價(jià)創(chuàng)造基礎(chǔ)條件。（5）對(duì)不同基因型毒株的交叉保護(hù)試驗(yàn)，進(jìn)一步證明該疫苗對(duì)多數(shù)基因型別的EV71感染均具有保護(hù)效果。（6）疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的相關(guān)研究，為進(jìn)一步闡明EV71感染致病機(jī)制及疫苗免疫學(xué)機(jī)理提供了大量數(shù)據(jù)和資料。是目前國(guó)內(nèi)外新型疫苗研發(fā)中的重要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)。2021/6/2714北京科興生物制品有限公司自主研發(fā)的預(yù)防用生物制品1類新藥益爾來福獲批通用名稱：腸道病毒71型滅活疫苗（Vero細(xì)胞）英文名稱：EnterovirusType71Vaccine,Inactivated（VeroCell）全球首創(chuàng)預(yù)防用生物制品1類新藥對(duì)EV71所致手足口病的保護(hù)率高達(dá)94.6%對(duì)EV71所致手足口病重癥和住院病例保護(hù)率為100%?穩(wěn)定性良好，有效期長(zhǎng)達(dá)3年不添加防腐劑與穩(wěn)定劑，進(jìn)一步降低安全風(fēng)險(xiǎn)全球最高標(biāo)準(zhǔn)控制Vero細(xì)胞宿主蛋白與DNA殘留2021/6/27152021/6/2716滅活疫苗仍然存在問題123EV71免疫保護(hù)機(jī)制復(fù)雜，除體液免疫外，細(xì)胞免疫也發(fā)揮著重要的作用。然而，滅活疫苗主要誘導(dǎo)的是體液免疫，細(xì)胞免疫不夠充分。滅活疫苗生產(chǎn)和運(yùn)輸成本高昂。疫苗效力較高而疫苗價(jià)格較低的常規(guī)免疫才符合我國(guó)的成本效益，這可能會(huì)制約滅活疫苗的應(yīng)用。EV71本身存在抗體依賴性增強(qiáng)感染現(xiàn)象，不恰當(dāng)?shù)囊呙缃臃N有可能會(huì)增加重癥病例的風(fēng)險(xiǎn)。2021/6/2717參考文獻(xiàn)[1].梁燕,趙紅玲,劉龍丁,廖蕓,董承紅,納銳雄,etal.腸道病毒71型滅活疫苗的規(guī)模化制備和免疫原性研究[J].中國(guó)病毒病雜志.2012(06).[2].梁爭(zhēng)論.我國(guó)腸道病毒71型滅活疫苗研發(fā)現(xiàn)狀[J].中國(guó)病毒病雜志.2012(06).[3].馬潔,鄧永強(qiáng),秦成峰,秦鄂德.腸道病毒71型疫苗研究進(jìn)展[J].軍事醫(yī)學(xué).2015(07).[4].王一平,姚昕,毛群穎,梁爭(zhēng)論.腸道病毒