《高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種PCR檢測方法》標準及編制說明（征求意見稿）

2xxxx—xxx高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種PCR檢測方法本文件規(guī)定了高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種PCR檢測的引物、儀器設(shè)備、試劑耗材、檢測步驟、結(jié)果判定、防止交叉污染和廢棄物處理的措施等。本文件適用于高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌株的PCR檢測。下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求SN/T2102.1食源性病原體PCR檢測技術(shù)規(guī)范第1部分：通用要求和定義SC/T7014水生動物檢疫實驗技術(shù)規(guī)范SC/T7015染疫水生動物無害化處理規(guī)程SC/T7201.1魚類細菌病檢疫技術(shù)規(guī)程第1部分：通用技術(shù)下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種high-virulentPhotobacteriumdamselaesubsp.damselae美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種（Photobacteriumdamselaesubsp.damselae，PDD）是弧菌科發(fā)光桿菌屬美人魚發(fā)光桿菌（Photobacteriumdamselae）的一個亞種，廣泛分布于全球海洋環(huán)境中，可以感染魚類、甲殼類、軟體動物、海龜、鯨豚類等不同的海洋動物。該菌種不同菌株因攜帶的毒力基因不同，對宿主呈現(xiàn)出高致病性、低致病性和無致病性。本文件界定的高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種是指感染宿主后能引起發(fā)病，最短可在1天內(nèi)造成魚類等宿主死亡并引發(fā)流行性疾病的菌株。3xxxx—xxx4.1hlyB基因的特異引物正向序列hlyB-F:5'-ACTCGCTTACTTGAATCGGAAAT-3'反向序列hlyB-R:5'-TCACGAAAGACATTGAGCATC-3'4.2dly基因的特異引物正向序列dly-F:5'-TTTGGACGAGCGGTCCATTT-3'反向序列dly-R:5'-GGAGCCCAATCTTGACCAGG-3'5.1儀器設(shè)備無菌操作臺、臺式離心機、恒溫金屬浴、PCR儀、漩渦振蕩器、生物安全柜、微量移液器、核酸電泳儀、凝膠成像儀、高壓滅菌鍋等。5.2試劑耗材超純水、2×PCRMix（含dNTP、Mg2+、DNA聚合酶）、SYBRGreenI染料、ROX參比染料、組織裂解液（含1%TritonX-100、2mMEDTA、20mMTris-HCl、0.2%SDS、20mM硫酸銨、1%甜菜堿）、瓊脂糖（電泳級）、DNA分子量標準（DL2000Marker）等試劑。離心管、研磨棒、移液槍頭、PCR管等耗材。6.1待檢樣品的核酸模板制備參照《SC/T7201.1魚類細菌病檢疫技術(shù)規(guī)程第1部分：通用技術(shù)》和《SC/T7014水生動物檢疫實驗技術(shù)規(guī)范》的相關(guān)規(guī)定，檢查待檢病樣的外觀癥狀，并在無菌操作臺中對主要病灶部位進行無菌取樣。隨后剪取0.1g~0.2g病灶部位的組織樣品置于1.5mL離心管中，用研磨棒研磨，加入200μL組織裂解液和300μL滅菌的超純水，充分振蕩混合均勻后，置于恒溫金屬浴上37℃保持5min~10min，使組織充分裂解（也可采用具有同等DNA抽提效果4xxxx—xxx的其他方法或使用商品化DNA提取試劑盒）。隨后，用離心機8000rpm離心2min，獲取上清液，吸取10μL上清液至一個新的無菌離心管中，并加入90μL超純水對上清液進行稀釋，振蕩混勻后即作為待檢樣品的DNA核酸模板。6.2PCR反應(yīng)體系的配置分別在200μL的PCR反應(yīng)管中制作兩個獨立的20μLPCR反應(yīng)體系。其中一個反應(yīng)體系標記為體系A(chǔ)，含有2×PCRMix混合物10μL，10μM的hlyB基因正向序列引物2μL，10μM的hlyB基因反向序列引物2μL，制備好的DNA模板4μL，加無菌超純水至總體積為20μL。另一個反應(yīng)體系標記為體系B，含有2×PCRMix混合物10μL，10μM的dly基因正向序列引物2μL，10μM的dly基因反向序列引物2μL，制備好的DNA模板4μL，加無菌超純水至總體積為20μL。分別在A、B兩個反應(yīng)體系中加入4μL6.1小節(jié)中制備好的DNA核酸模板，即完成PCR反應(yīng)體系的配置。陰性對照反應(yīng)體系以等體積無菌超純水替代DNA模版。反應(yīng)體系配置完成后，振蕩均勻并瞬時離心后，迅速將反應(yīng)管置于PCR儀中。6.3PCR擴增6.3.1PCR反應(yīng)條件按照如下條件進行PCR反應(yīng)：95℃預(yù)變性2min；95℃變性10s，60℃退火40s，72℃延伸20s，擴增40個循環(huán)。隨后，保持72℃延伸10min。6.3.2PCR產(chǎn)物的電泳分別將體系A(chǔ)和體系B的10μLPCR反應(yīng)產(chǎn)物，以及陰性對照的PCR產(chǎn)物點樣于1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳。6.3.3結(jié)果觀察將完成電泳后的瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移至凝膠成像儀器中觀察結(jié)果，并拍照記錄。7.1檢測結(jié)果成立的條件5xxxx—xxx體系A(chǔ)的PCR產(chǎn)物電泳后在344bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，體系B的PCR產(chǎn)物電泳后在695bp的位置上出現(xiàn)一條特異性條帶，兩個體系的特異性條帶需同時出現(xiàn)且陰性對照PCR產(chǎn)物電泳后均未出現(xiàn)條帶（見附錄A），則檢測結(jié)果成立。否則，檢測結(jié)果不成立。7.2結(jié)果判定7.2.1在檢測結(jié)果成立的前提下，檢測結(jié)果判定為陽性，即該樣品為高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種感染。7.2.2如果被檢測樣品體系A(chǔ)中的PCR產(chǎn)物電泳后在344bp的位置出現(xiàn)一條特異性條帶，但體系B中的PCR產(chǎn)物電泳后在695bp的位置沒有出現(xiàn)特異性條帶，且陰性對照PCR產(chǎn)物電泳后未出現(xiàn)條帶，則該樣品被美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種感染，但該菌株不具有高致病性。7.2.3如果被檢測樣品體系A(chǔ)中的PCR產(chǎn)物電泳后在344bp的位置、體系B中的PCR產(chǎn)物電泳后在695bp的位置都沒有出現(xiàn)特異性條帶，或者被檢測樣品體系A(chǔ)中的PCR產(chǎn)物電泳后在344bp的位置沒有出現(xiàn)特異性條帶，但體系B中的PCR產(chǎn)物電泳后在695bp的位置出現(xiàn)一條特異性條帶，則該樣品不是被美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種感染。7.2.4如果陰性對照的相應(yīng)位置出現(xiàn)特異性條帶，可能是陰性對照存在污染或是實驗過程操作失誤，無論體系A(chǔ)或體系B在相應(yīng)位置是否出現(xiàn)特異性條帶，均需再次重復(fù)進行檢測。上述結(jié)果的判定標準可參見表1。表1檢測結(jié)果的判定標準體系A(chǔ)（檢測hlyB基因）體系B（檢測dly基因）陰性對照結(jié)果判定++-樣品被高致病性PDD感染+--樣品被PDD感染，但不具有高致病性---樣品不是被PDD感染-+-+++檢測失敗，需重新進行檢測+-+-++--+8.1為防止交叉污染所采取的措施應(yīng)按照《SN_T2102.1-2008食源性病原體PCR檢測技術(shù)規(guī)范第1部分：通用要求和定義》的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。檢測過程中產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)按照《GB19489-2008實驗室生物安全通用要求》的相關(guān)規(guī)定進行無害化處理。6xxxx—xxx8.2被檢測的病樣樣品在檢測完成后應(yīng)按照相關(guān)規(guī)定進行無害化處理。xxxx—xxx美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種不同毒力株P(guān)CR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖圖1美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種hlyB基因的PCR產(chǎn)物電泳圖1-25：不同來源美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌株；26：陰性對照；M：DNA分子量標準。圖2美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種dly基因的PCR產(chǎn)物電泳圖1-2：高致病性的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌株；3-25：低致病性或無致病性的美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌株；26：陰性對照；M：DNA分子量標準。xxxx—xxx①PDD菌株的hlyB基因全長序列及用于本標準檢測的部分序列（下劃線部分，加粗斜體部分為檢測用引物序列）CACGCAGCCATTGAAGCAGCTCGTxxxx—xxx②PDD菌株的dly基因全長序列及用于本標準檢測的部分序列（下劃線部分，加粗斜體部分為檢測用引物序列）xxxx—xxx《高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種PCR檢5xxxx—xxx《高致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種PCR檢測方法》編制說明1.項目背景，包括產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀、立項背景及必要性等。菌科發(fā)光桿菌屬美人魚發(fā)光桿菌（Photobacteriumdamselae）的一個亞種，廣泛分布于發(fā)病，對人也有一定的致病性。PDD首次分離于1971年發(fā)生的一起“未知海洋弧菌”雜志。20世紀90年代，Smith等人將其歸為發(fā)光桿菌屬，并重新命名為美人魚發(fā)光桿piscicida）同種。PDD不僅是多種海水養(yǎng)殖動物的病原，還可對人類導(dǎo)致機會性感染。魚類在感染PDD之后的典型特征為局部出血和體表潰瘍性損傷，而人類傷口在感染成一些潛在的公共衛(wèi)生風險，應(yīng)引起足夠的重視PDD的致病性主要由四種不同的毒素決定，分別是由毒力質(zhì)粒pPHDD1編碼的damselysin（Dly）和phobalysinP（PhlyP），以及由染色體編碼的phobalysinC(PhlyC)PlpV由毒力基因plpV編碼，是一種A2-磷脂酶；PhlyP和PhlyC都是穿孔毒素，分別由毒6xxxx—xxx之間的加強作用，以及兩種磷脂酶（Dly和PlpV）與兩種穿孔毒素（PhlyP和PhlyC）之到目前為止，我國境內(nèi)PDD感染海水養(yǎng)殖動物的文獻報道集中于少量的發(fā)病案例濱對蝦（Penaeusvannamei）等，沒有表現(xiàn)出明顯的地域或宿主特異性。以山東省長島促進中心的調(diào)研報告導(dǎo)致約30%的網(wǎng)箱養(yǎng)殖業(yè)主近幾年放棄養(yǎng)殖、空置網(wǎng)箱，經(jīng)濟力強的菌株可以導(dǎo)致實驗魚在極短的時間內(nèi)就全部死亡，而其他的一些PDD菌株注射依據(jù)，不同PDD菌株在全球范圍內(nèi)也表現(xiàn)了表7xxxx—xxx高致病性PDD是導(dǎo)致網(wǎng)箱養(yǎng)殖許氏平鲉敗血性皮膚潰瘍癥的主要致病原，而海水環(huán)境疾病。因此，建立針對高致病性PDD菌株菌株的差異化檢測，對于深遠海養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中實現(xiàn)對疾病的精準根據(jù)國家標準全文公開系統(tǒng)和中國農(nóng)業(yè)標準網(wǎng)的搜索，僅查找到國家標準《飼料進我國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐，具有突出2.工作簡況，包括任務(wù)來源、協(xié)作單位、主要工作過程、編寫組成員及其所做的主要工作等。得科技股份有限公司和山東信達基因科技有限公司作為協(xié)作單位共同完成。其中，中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所負責完成標準的編制以及標準化測試、適用性評價等工作。山東信得科技股份有限公司和山東信達基因科技有限公司，主要負責為更好地完成標準的制訂工作，標準起草團xxxx—xxx1部分：通用要求和定義》等標準以及國家和農(nóng)業(yè)3）標準編制組收集了國內(nèi)外相關(guān)資料，在國內(nèi)的海水魚類養(yǎng)殖場、原良種場、網(wǎng)箱養(yǎng)殖企業(yè)、深遠海養(yǎng)殖企業(yè)進行了系統(tǒng)的流行病學調(diào)查，與相關(guān)技術(shù)人員進行了深入的交流，并充分征求科研、管理等相關(guān)部門人員的意見，在總結(jié)各方面意見包括中國海洋大學、江蘇海洋大學、寧波大學、西南大學、海南大學、中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所、中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所、山東省海洋科學研究院等，咨詢專家為長期從事水產(chǎn)養(yǎng)殖研究的高級專業(yè)技術(shù)人員，對標準征求意見稿提出初步的意見和建議，征求意見的時間不少于30天。標準起草小組于10月底收到了全部20為專家的返回意見，并對返回的意見進行匯總和整理，按照專家意見對標準征求意見稿進行修訂，對標準征求意見稿完善后提交秘書處，組織相關(guān)專家編寫組成員主要負責標準制訂工作的組織、協(xié)調(diào)，相關(guān)資料的查閱、收集，標準文本及編制說明的起草、撰寫，組織召開研討會，通過現(xiàn)場考察、電子郵件、傳真、姓名工作單位承擔的工作9xxxx—xxx張正中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所主持，方案設(shè)計、收集資料、檢驗項目的確認，分析方法設(shè)計，標準文本和編制說明的起草于永翔中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所協(xié)助完成標準技術(shù)參數(shù)檢測與驗證、征求意見稿與標準編制說明寫作王印庚中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所協(xié)助完成標準設(shè)計，協(xié)助完成征求意見稿與標準送審稿編制羅展山東信得科技股份有限公司參與標準編制說明編寫，協(xié)助完成標準技術(shù)參數(shù)驗證王春元中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所協(xié)助完成標準征求意見稿與編制說明編寫，完成標準專家意見征集與匯總馬廣斌山東信達基因科技有限公司協(xié)助完成標準技術(shù)參數(shù)驗證和應(yīng)用趙永偉山東信達基因科技有限公司協(xié)助完成標準技術(shù)參數(shù)驗證和應(yīng)用張世佳山東信得科技股份有限公司協(xié)助完成標準技術(shù)參數(shù)驗證和應(yīng)用陳偉華中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所參與完成了PCR檢測體系和參數(shù)的實驗驗證3.標準編制原則和確定標準主要內(nèi)容（如技術(shù)指標、參數(shù)、公式、性能要求、試驗方法、檢驗規(guī)則等）的論據(jù)（包括試驗、統(tǒng)計數(shù)據(jù)修訂標準時，應(yīng)當列出新、舊標準水平的對比。產(chǎn)動物病原檢測、疫病診斷的規(guī)章及規(guī)范性文件要求。標準起草過程中，按照GB/T1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草制定，為新制訂標準。標準文本中能直接引用的標準盡量引用，相關(guān)內(nèi)xxxx—xxx的引用文件，其最新版本（包括所有的修改Photobacteriumdamselaesubsp.damselae）光桿菌屬美人魚發(fā)光桿菌（Photobacteriumdamselae）的一個亞種，廣泛分布于全球海hlyB基因的特異性引物，以及用于檢測位于菌株毒性質(zhì)粒上dly基因hlyB基因是一部分致病性細菌溶血素毒力系PDD菌株攜帶有高致病性的毒力基因。兩對PCR特異引xxxx—xxx正向序列hlyB-F:5'-ACTCGCTT反向序列hlyB-R:5'-TCACGAAAGACA反向序列dly-R:5'-GGAGCCCAAT①待檢樣品及陰性、陽性對照組的核酸模板制備：詳細描述了對待檢病樣樣品的②PCR反應(yīng)體系的配置：確定了分別用于檢測hlyB基因和dly基因的兩個獨立的PCR反應(yīng)體系，以及陰性、陽性對照組PCR反應(yīng)③PCR擴增：確定了進行hlyB基因和dly基因PCR檢測的反應(yīng)條件參數(shù)、產(chǎn)物電泳①檢測結(jié)果成立的條件：詳細描述了被檢樣品判定為高致病性PDD感染的條件，即hlyB基因PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測后在344bp的位置出現(xiàn)特異性條帶，dly基因PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測后在695bp的位置出現(xiàn)特異性條帶，且陰性對照PCR擴增產(chǎn)物電泳后均未②結(jié)果判定的方法：對檢測結(jié)果可能出現(xiàn)的多種情況及其結(jié)果判定進行了詳細說xxxx—xxx且陰性對照未出現(xiàn)條帶，可判定為PDD感dly基因任意一個未出現(xiàn)特異性條帶，證明本次檢測存在操作失誤，再次4.主要試驗（或驗證）的分析、綜述報告，技術(shù)經(jīng)濟論證，預(yù)期北、天津、山東、江蘇、浙江、福建、海南7個省市，分離自大菱鲆、褐牙鲆、半滑舌測高致病性PDD菌株的鑒別基因。其中，位于染色體上的xxxx—xxx成。隨后，從實驗室的菌種庫中挑選出23株不同的細菌菌株（表1）進行了hlyB基因引物特異性的檢測，實驗結(jié)果顯示只有3株P(guān)DD菌株在344bp的位置出現(xiàn)條帶，其余的20株非PDD菌株均未出現(xiàn)條帶，證明所設(shè)計的h序號菌株拉丁名編號來源1美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種Photobacteriumdamselaesubsp.damselaePDD1605實驗室分離2美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種Photobacteriumdamselaesubsp.damselaePDD1608實驗室分離3美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種Photobacteriumdamselaesubsp.damselaePDD1808實驗室分離4輪蟲弧菌vibriorotiferianusVR1實驗室分離5輪蟲弧菌vibriorotiferianusVR2實驗室分離6輪蟲弧菌vibriorotiferianusVR3實驗室分離7哈維氏弧菌VibroharveyiVHBZ0001購自北微所8哈維氏弧菌VibroharveyiVHBZ0002實驗室分離9哈維氏弧菌VibroharveyiVHBZ0003實驗室分離10鰻弧菌VibrioanguillarumVABZ0001購自北微所VibrioanguillarumVABZ0002實驗室分離12燦爛弧菌VibriosplendidusVSBZ0001購自北微所13燦爛弧菌VibriosplendidusVSBZ0002實驗室分離14副溶血弧菌VibrioparahaemolyticusVPBZ0001購自北微所15副溶血弧菌VibrioparahaemolyticusVPBZ0002實驗室分離16溶藻弧菌VibrioalginolyticusVABZ0003購自北微所17溶藻弧菌VibrioalginolyticusVABZ0004實驗室分離18費氏弧菌VibriofischeriSm02112702A購自北微所19大菱鲆弧菌VibrioscophtalmiVS1實驗室分離20嗜環(huán)弧菌VibriocyclitrophicusVC1實驗室分離21大腸桿菌EscherichiaColiTrans1-T1實驗室分離22大腸桿菌EscherichiaColiTrans1-T2實驗室分離xxxx—xxx23大腸桿菌EscherichiaColiTrans1-T3實驗室分離挑選出25株不同來源的PDD菌株，其中包括已經(jīng)完成全基因組解析和致病力驗證的2株測，結(jié)果如圖1和圖2所示，25株P(guān)DD菌株的h有其中的2株高致病性菌株的dly基因引物出現(xiàn)了特異性條帶，證實本標準的技術(shù)思路可xxxx—xxxRxxxx—xxx約養(yǎng)殖成本，同時也有利于保護養(yǎng)殖水域的生態(tài)環(huán)境5.標準涉及的相關(guān)知識產(chǎn)權(quán)說明。①國家發(fā)明專利，強致病性和非強致病性美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種的快速鑒定③上海海洋大學碩士學位論文，不同美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種菌株對許氏平鲉致病力差異分析，論文作者施琳妮，論文提交時間2019年。④上海海洋大學碩士學位論文，兩種海水魚類致病菌現(xiàn)場快速檢測技術(shù)的建立與應(yīng)用，論文作者陳京，論文提交時間2020年。上述知識產(chǎn)權(quán)全部為本標準起草人團隊完成并獲得，6.采用國際標準和國外先進標準的程度，以及與國際、國外同類標準水平的對比情況，或與測試的國外樣品有關(guān)數(shù)據(jù)的對比情況。溶血性弧菌的檢測》（GB/T26426-2010）、《食品微生物檢驗副溶血性弧菌檢驗》（GB4789.7-2013）等內(nèi)容相近但適用對象不同的標準。因此，本標準屬于新制訂的標xxxx—xxxSN/T2102.1-2008等有關(guān)水生動物病原檢疫、染病動物無害化處理等方面的行業(yè)標準，7.與現(xiàn)有相關(guān)法律法規(guī)及相關(guān)標準的協(xié)調(diào)性。本標準符合《中華人民共和國漁業(yè)法》和《中華人民共8.重大意見分歧的處理經(jīng)過和依據(jù)。9.貫徹標準的要求和措施建議（包括組織措施、技術(shù)措施、過渡本標準的發(fā)布，將為海水養(yǎng)殖生產(chǎn)中精準的檢測PDD感染建立有章可循的技術(shù)標xxxx—xxx同時，團隊成員將結(jié)合自身的科研工作，加強對不同海水養(yǎng)殖系統(tǒng)內(nèi)高致病性PDD菌性PDD菌株的留存狀況和致病風險進行排查，從而推動本標準內(nèi)容在養(yǎng)殖企業(yè)中得以有效的實施，降低高致病性PDD菌株感染海水養(yǎng)殖動物發(fā)病的概率，減少因病損失。10.其他應(yīng)予說明的事項。主要參考文獻[1]劉瀟,張正,王麗芳,等.海南地區(qū)與環(huán)渤海灣美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種水產(chǎn)動物分離株的表型與遺傳特征分析[J].微生物學報,2021,61(07):2101-2111.[2]FouzB,LarsenJL,NielsenBB,etal.CharacterizationofVibriodamselastrainsisolatedfromturbotScophthalmusmaximusinSpain[J].DiseasesofAquaticOrganisms,1992,12(3):155-166.[3]TakahashiH,MiyaS,KimuraB,etal.Diff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