第二章 高效液相色譜法課件

2025/1/117高效液相色譜法第二章

高效液相色譜法一、高效液相色譜法的特點二、流程及主要部件三、影響分離的因素四、高效液相色譜法的主要分離類型2025/1/117高效液相色譜法液相色譜儀（1）2025/1/117高效液相色譜法液相色譜儀（2）2025/1/117高效液相色譜法液相色譜儀（3）2025/1/117高效液相色譜法液相色譜儀（4）2025/1/117高效液相色譜法液相色譜儀（5）2025/1/117高效液相色譜法一、高效液相色譜法的特點

特點：高壓、高效、高速高沸點、熱不穩(wěn)定有機(jī)及生化試樣的高效分離分析方法。2025/1/117高效液相色譜法1．高效液相色譜法與氣相色譜法比較（1）應(yīng)用范圍不同氣相色譜僅能分析在操作溫度下能氣化而不分解的物質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計只有大約20%的有機(jī)物能用氣相色譜分析；而液相色譜適合分子量較大、難氣化、不易揮發(fā)或?qū)崦舾械奈镔|(zhì)、離子型化合物及高聚物的分離分析，大約占有機(jī)物的70~80%。（2）由于液體的擴(kuò)散性比氣體的小105倍，因此，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢，而在氣相色譜中氣體的傳質(zhì)速率要快得多。2025/1/117高效液相色譜法（3）液相色譜能完成難度較高的分離工作

①氣相色譜的流動相載氣是色譜惰性的，而在液相色譜中流動相液體也與固定相爭奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個因素。

②液相色譜固定相類型多，作為分析時選擇余地大；而氣相色譜并不可能的。

③液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇，而氣相色譜一般都在較高溫度下進(jìn)行的。（4）液相色譜中制備樣品簡單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測器，儀器比較復(fù)雜，價格昂貴。2025/1/117高效液相色譜法

2．高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法比較

高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點在于高速、高效、高靈敏度、高自動化。

例如對氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法需用20多小時才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個組分.2025/1/117高效液相色譜法小結(jié)綜上所述，高效液相色譜法是吸取了氣相色譜與經(jīng)典液相色譜的優(yōu)點，具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點。目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。高效液相色譜法的儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴(yán)格，這是它的主要缺點。2025/1/117高效液相色譜法二、流程及主要部件1.流程高壓輸液系統(tǒng)——進(jìn)樣系統(tǒng)——分離系統(tǒng)——檢測系統(tǒng)——數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)2025/1/117高效液相色譜法Agilent1100LC的主要部件2025/1/117高效液相色譜法2.主要部件(1)高壓輸液系統(tǒng)主要部件之一，包括貯液裝置、高壓輸液泵、過濾器、脫氣裝置等

高壓輸液泵壓力：150～350×105

Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動相高速通過時，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點之一?；疽螅簯?yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性2025/1/117高效液相色譜法(2)梯度淋洗裝置外梯度:利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。2025/1/117高效液相色譜法(3)進(jìn)樣裝置

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，也可配備自動進(jìn)樣裝置。其結(jié)構(gòu)如圖所示：2025/1/117高效液相色譜法(4)高效分離系統(tǒng)色譜分離系統(tǒng)包括色譜柱、固定相和流動相。色譜柱是其核心部分，柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。2025/1/117高效液相色譜法(5)高效液相色譜檢測器紫外光度檢測器（UVD）：最小檢測量10-9g·mL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用于梯度洗脫。最常用的檢測器。2025/1/117高效液相色譜法光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器：1024個二極管陣列，各檢測特定波長，計算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如圖所示。2025/1/117高效液相色譜法（6）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)色譜工作站的功能：色譜參數(shù)的選擇和設(shè)定；自動化操作儀器；色譜數(shù)據(jù)的采集和存儲，并作“實時”處理；對采集和存儲的數(shù)據(jù)進(jìn)行后處理；自動打印，給出一套完整的色譜分析數(shù)據(jù)和圖譜。同時也可把一些常用色譜參數(shù)、操作程序，及各種定量計算方法存入存儲器中，需用時調(diào)出直接使用。2025/1/117高效液相色譜法2025/1/117高效液相色譜法1.固定相及分離柱氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。選擇合適的固定相，降低填料粒度可顯著提高柱效，但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。選擇短柱、細(xì)內(nèi)徑提高分析速度；研制高效柱填料是一活躍領(lǐng)域。三、影響分離的因素2025/1/117高效液相色譜法2.流動相及流動相的極性

（1）可顯著改變組分分離狀況的流動相選擇在液相色譜中顯得特別重要。液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性淋洗液，即淋洗液的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。（3）若淋洗液的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。2025/1/117高效液相色譜法流動相組成流動相按組成不同可分為單組分和多組分；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑:

己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間。2025/1/117高效液相色譜法選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題：（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。2025/1/117高效液相色譜法四、高效液相色譜法的主要分離類型1.吸附色譜（液-固吸附色譜）“液-固色譜法”是利用各組分在固定相上吸附能力的不同而將它們分離的方法。以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。2.分配色譜（液-液分配色譜）早期通過在擔(dān)體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相，即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在擔(dān)體表面。2025/1/117高效液相色譜法3.離子交換色譜固定相為離子交換樹脂，流動相為無機(jī)酸或無機(jī)堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹脂上的交換基團(tuán)的交換能力的不同而得到分離。

可分離分析：核苷酸、碳水化合物、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、酶等

4.凝膠色譜（空間排阻色譜）按分子尺寸的差異進(jìn)行分離的一種液相色譜方法。以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠。2025/1/117高效液相色譜法五、高效液相色譜法的應(yīng)用1.在食品分析中的應(yīng)用1)食品營養(yǎng)成分分析：蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類等；2)食品添加劑分析：防腐劑、著色劑等；3)食品污染物分析：霉菌毒素等。2.在環(huán)境分析中的應(yīng)用

多環(huán)芳烴（特別是稠環(huán)芳烴）、農(nóng)藥殘留等。2025/1/117高效液相色譜法五、高效液相色譜法的應(yīng)用

3.在生命科學(xué)中的應(yīng)用

1)低分子量物質(zhì)，如氨基酸、糖類、維生素等的分離和測定。2)高分子量物質(zhì)，如蛋白質(zhì)和酶的純化、分離和測定。4.在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用