血中碳氧血紅蛋白的分光光度法

血中碳氧血紅蛋白的分光光度法1.適用范圍：血中碳氧血紅蛋白的定量測定。2.原理：血液中含有四種血紅蛋白成分，即還原血紅蛋白（Hb），氧合血紅蛋白（HbO2）、碳氧血紅蛋白HbCO及微量的變性血紅蛋白HbMet。用連二亞硫酸鈉將HbO2和HbMet還原成Hb，則血液中只存在HbCO和Hb兩種成分。HbCO和HVB的最大吸收波長分別在420nm和430nm。測出被檢血樣在兩個波長下的吸光度,在利用HbCO與Hb兩個波長下的摩爾吸光系數(shù)計算HbCO的百分濃度。3.方法重要參數(shù)3.1線性范圍：測定范圍為2%-70%HbCO；3.2精密度：相對標準偏差為1.9%-5.6%（HbCO濃度為9.9%，36.6%，56.8%，n=6）。3.3準確度：血樣加已知濃度血測定回收率為95.8%（3個濃度，n=8）。檢出限：本法的最低檢測濃度為2%HbCO（按取10μl血樣計）。3.5全程測定時間：60min。4.器材與試劑4.1器材4.1.1采血吸管。4.1.2小玻璃管,25mm×4mm,帶帽。4.1.3試管，10ml,具有口塞，實際能盛15ml至滿。4.1.4液體快速混合器。4.1.5分光光度計。4.2試劑實驗用水為蒸餾水。4.2.1硫酸。4.2.2甲酸，85%（m/m）。4.2.3連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）。4.2.4氮氣，高純。4.2.5氧氣，高純。4.2.6一氧化碳純氣，鋼瓶裝或自制。制備方法：在裝有滴液漏斗和氣體導(dǎo)出管的燒瓶中加入甲酸，然后緩慢滴入濃硫酸，產(chǎn)生的CO通過氫氧化鈉洗氣瓶及另一空瓶后，通入樣品液中。操作應(yīng)在良好的通風(fēng)櫥內(nèi)進行。4.2.7氫氧化鈉溶液，20g/L。4.2.8血液稀釋液，0.02mol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)溶液。4.2.9肝素溶液，5g/L。5.操作步驟5.1摩吸光系數(shù)的測定：摩爾吸光系數(shù)不易測定，但在本法計算中，可用同一濃度的血樣制得Hb及HbCO，測其在420nm及430nm下的吸光值來代替，作為常數(shù)。測定方法如下：取不吸煙健康人血（肝素抗凝），用水稀釋5倍。取0.3ml加血稀釋液至90ml，通氧氣30min。從中取4份，每份15ml于試管中，其中2份通氮氣10min,以除于過剩的氧，得到HbO2液。另兩份同純一氧化碳氣10min，得到HbCO液。立即將HbO2、HbCO制備液分別轉(zhuǎn)入內(nèi)盛60mg連二亞硫酸鈉的試管中，混勻，放置10min后測量。讀取430nm和420nm波長處的吸光值，代替摩爾吸光系數(shù)（以下簡稱吸光常數(shù)）。5.2樣品處理和測定：將冷藏的血樣于室溫放置，用液體快速混合器混勻。迅速取10μl（二個平行樣），加入內(nèi)盛15ml血液稀釋液的試管中（若采樣后隨即分析，可直接取10μl血放入內(nèi)盛15ml血液稀釋液的試管中），加入60mg連二亞硫酸鈉，輕輕混勻，放置10min。用10mm比色杯，以試劑空白為參比，測其在420nm和430nm波長處的吸光度。6.計算按式（9-39）計算血中HbCO的濃度：式中：C——血中HbCO的濃度，%；A420——血樣在420nm波長處的吸光度讀數(shù)；A430——血樣在430nm波長處的吸光度讀數(shù)據(jù)；k1——HbCO在420nm波長處的吸光常數(shù)；k2——HbCO在430nm波長處的吸光常數(shù)；k3——Hb在430nm波長處的吸光系數(shù)7.說明7.1本法測定所依據(jù)的Hb與HbCO含量比例與血紅蛋白含量高低無關(guān)，因此取血量不需要很準確。吸光度常數(shù)測定后只要儀器波長穩(wěn)定，可較長時間的使用。7.2空氣中有大量氧氣，所以血樣及制成的待測液接觸空氣越少越好。實驗證明含HbCO20%及近飽和的HbCO待測液，其容器上端空氣分別為5ml-6ml及20ml時，較裝滿或近滿者，測定結(jié)果HbCO平均下降4.5%及10.2%（n=6）。7.3非高純級的鋼瓶氧氣和氮氣含有微量的一氧化碳。制備HbO2時應(yīng)通過加熱至80oC-100oC的1cm*10cm霍加拉特管除去。7.4連二亞硫酸鈉遇水易分解，應(yīng)避光密封保存，臨用現(xiàn)稱。如試劑放置過久可按下法標定：用預(yù)先盛有15ml250g/L堿性溶液的30ml高型稱量瓶，稱取約1g樣品（稱量至0.002g）。待樣品充分溶解后移于250ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻，明吸出25.0ml置于錐形瓶中。加5ml5%(v/v)