流式細胞術的原理課件

流式細胞術的原理BD生物科學王淑琦流式細胞術的原理概念Definition流式細胞術Flowcytometry(FCM)特異性強，靈敏度高，速度快，并能實現多參數分析檢測的對象主要是各種生物顆粒，包括大量的臨床樣本：外周血，骨髓，細胞穿刺液，洗脫液，實體組織，同時包括各種各樣的科研研究對象：培養(yǎng)細胞，藻類、染色體、原生動物cellsuspension細胞懸液在流動的狀態(tài)中被檢測各項特性流式細胞術的原理流式細胞儀的基本結構以及原理流式細胞術的原理流式細胞儀的基本結構以及工作原理雖然每款流式細胞儀有各自的特征性結構，但是其內部結構基本組成相同?；窘Y構一共分三部分：液流系統(tǒng)光學系統(tǒng)電子系統(tǒng)流式細胞術的原理液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)包括流動室flowchamber液流驅動系統(tǒng)InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid鞘液三大作用：避免堵塞噴孔約束樣本位于噴嘴中心、提高測量精度保持細胞活性流式細胞術的原理液流系統(tǒng)對靈敏度要求不是很苛刻的實驗，可調高樣本進樣速率，從而提高采樣分析速度。流式細胞術的原理光學系統(tǒng)主要由激發(fā)光源、光束成形及收集系統(tǒng)組成

弧光燈：氙燈、高壓汞燈價格便宜激發(fā)光譜廣但是單色性差-單一譜線上能量弱穩(wěn)定性差-功率不穩(wěn)定激光器：氣體激光器：氬離子（488nm）、氦氖（633nm）、氪離子（647nm）、氪氬（568nm）半導體激光器：價格低、結構簡單、使用壽命長。BDFACSCalibur采用的635nm染料激光器流式細胞術的原理光學系統(tǒng)激光器：單波長、高能量、發(fā)散角小、高穩(wěn)定性光照流式細胞術的原理光學系統(tǒng)激光在檢測細胞樣本前經過透鏡聚焦成為非常窄的高能量光束。激光光束的橫截面呈橢圓形光斑，所以除了集聚能量（細胞通過檢測區(qū)時就可以得到很強的信號），這樣還可以避免照射到其他細胞造成干擾。激光光束成形-透鏡聚焦流式細胞術的原理光學系統(tǒng)收集系統(tǒng)

如何將混合的熒光區(qū)分開來，分別進行收集呢？濾光片置于熒光探測器前，限定其接收的熒光的波長范圍流式細胞術的原理光學系統(tǒng)流式細胞術的原理電子系統(tǒng)流式細胞術的原理流式細胞儀的工作原理流式細胞術的原理散射光信號前向角散射光（FSC，ForwardScatter）：細胞相對大小及其表面積側向角散射光（SSC，SideScatter）：細胞顆粒度及細胞核相對復雜性流式細胞術的原理散射光信號流式細胞術的原理熒光信號特異熒光信號背景信號流式細胞術的原理熒光素什么是熒光及熒光素？某些物質在特定波長范圍內的光線照射下，可發(fā)出波長比照射光波長長的光線-即熒光。而這些受激發(fā)后能產生熒光的物質稱為熒光素。什么是熒光發(fā)生機理？室溫下的熒光素分子大部分處于穩(wěn)定的“基態(tài)”。當熒光素在激發(fā)光的照射下吸收足夠的光能后，躍遷到新的狀態(tài)，即“激發(fā)態(tài)”。處于激發(fā)態(tài)的熒光分子極不穩(wěn)定，它可以通過極短時間（納秒）內以發(fā)射一定波長的光量子的方式釋放所吸收的能量從而返回到基態(tài)。這一過程稱為熒光發(fā)射，也就是發(fā)光。流式細胞術的原理熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜所有的熒光素都有兩個特征光譜。激發(fā)光譜（Excitation，Ex）：-是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內的光線，也稱為吸收光譜。-我們一般標注的是吸收波峰，也就是最大吸收波長：Ex-Max發(fā)射光譜（Emission，Em）：-是指熒光素發(fā)射的一定波長范圍內的熒光。所有熒光都是寬譜發(fā)射。-一般標注的是發(fā)射波峰，即最大發(fā)射波長：Em-Max流式細胞術的原理FITC的激發(fā)與發(fā)射光譜常用染料FITC可被488nm激光激發(fā)，Em-Max：525nm，可以配用530/30接收通道488nm525nm流式細胞術的原理PI的激發(fā)與發(fā)射光譜常用染料PI同樣可被488nm激光激發(fā)，Em-Max：625nm，所以配用不同的585/42接收通道488nm625nm流式細胞術的原理APC的激發(fā)與發(fā)射光譜常用染料APC可被633nm激光激發(fā)，Em-Max：660nm，可以配用660/20接收通道633nm660nm流式細胞術的原理熒光染料的選擇儀器配置：激光器種類；光信號接收通道；減少發(fā)射光光譜重疊流式細胞術的原理補償——熒光染料寬譜發(fā)射的特征產生補償問題?！狿E滲漏到FITC通道的信號FL1-x%FL2—FITC滲漏到PE通道的信號FL2-x%FL1流式細胞術的原理先電壓，后補償雙色染色的實驗中先使用陰性管調電壓陰性對照（1）：細胞加上IgG1FITC,IgG1PE然后用單染管調補償單染管（2）：細胞+抗體AFITCor抗體BPE流式細胞術的原理調電壓

-尋找目標細胞群;-多色實驗中，分出陰陽性細胞群分界線調閾值-減少背景信號調補償-減去干擾信號調節(jié)電壓、閾值、補償流式細胞術的原理調整熒光接收器電壓電壓改變對數據顯示的影響流式細胞術的原理數據存儲ListMode列表模式：每個細胞的參數依次按順序排列存儲

FSCSSCFL1FL2EVENVENT210020024540EVENT3300600100700FITC/PE雙染樣本流式細胞術的原理數據顯示二維點圖（DotPlot）直方圖（Histogram）等高線圖（ContourPlot）密度圖（Density）三維圖（3DPlot）等·流式細胞術的原理樣本收集及處理制備單細胞懸液免疫熒光染色表型測定統(tǒng)計學分析流式細胞術操作流程流式細胞術的原理1.樣本制備流式細胞術的原理樣本來源血液骨髓淋巴結體液（尿液、腦脊液、胸腹腔積液）灌洗液（肺泡支氣管）加抗凝劑（EDTA），室溫保存，24h內實體組織機械法制備單細胞懸液，保持抗原活性，不宜用酶、表面活性劑流式細胞術的原理2.免疫熒光染色流式細胞術的原理染色方式的選擇直接染色—

標有熒光染料的抗體直接特異結合目標抗原。—首選的方式：方便快捷、經濟、準確、非特異結合少間接染色—標有熒光染料的二抗間接特異結合目標抗原?！谥苯尤旧荒軐崿F的情況下，選用的方式：非特異性結合相對增加。在流式試劑日益全面的情況下，越來越少的客戶選擇這種方式。僅適用于研究最新發(fā)現抗原的客戶。流式細胞術的原理熒光染料的選擇1，首先，了解目標抗原1）細胞表面抗原2）細胞內或是核內抗原（固定、透膜步驟）3）以上兩者兼?zhèn)?。先標記表面抗原，固定后，破膜標記胞內抗原?）細胞內細胞因子的測定。使用細胞內蛋白分泌抑制劑，如monensin、BFA，使得細胞因子不能分泌到細胞外。（活化、固定、透膜）2，了解熒光染料及其工作原理，做出準確的選擇。流式細胞術的原理熒光染料的種類熒光染料分為三大類1.小分子化合物：FITC、PacificBlue2.大分子熒光蛋白：AmCyan，PerCP，PE,APC3.串聯(lián)染料：

PerCP-Cy5.5，PE-Cy5流式細胞術的原理如何正確選擇與使用熒光素儀器配置：有哪些激光器與接收通道多色實驗中，盡量減少熒光素之間的相互干擾—

如APC與Cy5不能串聯(lián)使用，兩者光譜重疊大，補償不好調。盡量選擇應用廣、亮度高的熒光素—

熒光素的強弱用StainIndex染色指數來表示，數值越大，信噪比越高。多色實驗中，亮度高的熒光素搭配表達量低的目標抗原—

例如，PE，APC這類大分子蛋白相對亮度高。關注F/P比值—

尤其是使用小分子熒光素，一個抗體上會標記多個熒光素分子。在細胞本身自發(fā)熒光強的情況下，使用發(fā)射光波長大于600nm的熒光染料。避免使用串聯(lián)染料，不穩(wěn)定，可能發(fā)生降解。流式細胞術的原理BD網站提供每一種熒光素的激發(fā)以及發(fā)射光譜流式細胞術的原理常用的熒光素組合流式細胞術的原理臨床應用HIV診斷與治療白血病和淋巴瘤的免疫分型腫瘤的細胞周期