液質(zhì)聯(lián)用檢測人體血漿中的奧司他韋和奧司他韋羧酸

液質(zhì)聯(lián)用檢測人體血漿中的奧司他韋和奧司他韋羧酸1.摘要采用HPLC法進(jìn)行人體血漿中的奧司他韋及其活性代謝物奧司他韋羧酸濃度測定。方法:ACEExcel5C182.1*50mm色譜柱，水相：0.1%甲酸水溶液，有機(jī)相：乙腈，流速0.4mL/min，柱溫為35℃。實驗用樣品則需要進(jìn)行甲醇提取進(jìn)樣，監(jiān)測模式為MRM，進(jìn)行內(nèi)標(biāo)法定量分析（奧司他韋-d3/奧司他韋羧酸-d3為內(nèi)標(biāo)）。結(jié)果：經(jīng)驗證的奧司他韋的線性定量范圍為0.500ng/mL~200ng/mL，奧司他韋羧酸的線性定量范圍為2.00ng/mL~800ng/mL。奧司他韋高、中、低3個濃度質(zhì)控樣品的平均提取回收率為95.13%、94.22%、91.89%，內(nèi)標(biāo)平均提取回收率為89.53%，奧司他韋羧酸高、中、低3個濃度質(zhì)控樣品的平均提取回收率為95.54%、95.87%、91.46%，內(nèi)標(biāo)平均提取回收率為88.83%，表明在本方法的定量范圍內(nèi)奧司他韋和奧司他韋羧酸具有足夠、相對均一的提取回收率，且內(nèi)標(biāo)具有較高的回收率。結(jié)論：本方法對于測定人血漿中奧司他韋和奧司他韋羧酸濃度的可靠性。2.關(guān)鍵詞奧司他韋和奧司他韋羧酸；流感；LC-MS/MS；血漿濃度3.引言流行性感冒（以下簡稱流感）是流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，流感病毒屬于正粘病毒科，為單股、負(fù)鏈、分節(jié)段RNA病毒。根據(jù)核蛋白和基質(zhì)蛋白不同，分為甲、乙、丙、丁四型。目前感染人的主要是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亞型及乙型流感病毒中的Victoria和Yamagata系。甲型和乙型流感病毒每年呈季節(jié)性流行，其中甲型流感病毒可引起全球大流行。全國流感監(jiān)測結(jié)果顯示，每年10月我國各地陸續(xù)進(jìn)入流感冬春季流行季節(jié)。流感的治療主要包括對癥治療以及抗病毒治療，抗病毒藥物主要包括神經(jīng)氨酸酶抑制劑、血凝素抑制劑、M2離子通道阻滯劑等。神經(jīng)氨酸酶抑制劑對甲型、乙型流感均有效[1]。磷酸奧司他韋是流感神經(jīng)氨酸酶抑制劑，經(jīng)水解轉(zhuǎn)化為活性成分奧司他韋羧酸鹽，抑制流感神經(jīng)氨酸酶，從而阻斷子代病毒顆粒的釋放。該藥適用于2周齡及以上的患者出現(xiàn)癥狀2天內(nèi)的急性簡單流感的治療和1周歲以上人群的流感預(yù)防。推薦劑量為成人及青少年（13歲以上）每次75mg，每日2次，持續(xù)5天。

磷酸奧司他韋是其活性代謝產(chǎn)物的藥物前體，其活性代謝產(chǎn)物（奧司他韋羧酸鹽）是強(qiáng)效的選擇性的流感病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑。神經(jīng)氨酸酶是病毒表面的一種糖蛋白酶，其活性對新形成的病毒顆粒從被感染細(xì)胞中釋放和感染性病毒在人體內(nèi)進(jìn)一步播散至關(guān)重要。同時也有報道指出神經(jīng)氨酸酶對病毒進(jìn)入未感染細(xì)胞也具有一定作用。4.實驗部分4.1儀器和試藥島津公司UPLC-30A超高效液相系統(tǒng)，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司TripleQuad-5500三重四級桿質(zhì)譜儀，配ESI（電噴霧離子源）。鹽酸奧司他韋和奧司他韋羧酸標(biāo)準(zhǔn)品，來源：TLCPharmaceuticalStandards，批號：RS210604、4496-011A3；奧司他韋-d3/奧司他韋羧酸-d3（內(nèi)標(biāo)），來源：TLCPharmaceuticalStandards，批號：2556-054A3、2556-098A10；乙腈（Merck），HPLC級；甲醇（Merck），HPLC級；甲酸（Dikma），HPLC級；超純水（MilliporeMilli-Q），實驗室自制。血漿由湖南益陽康雅醫(yī)院提供。4.2分析條件液相條件：色譜柱為ACEExcel5C182.1*50mm，柱溫35℃，流動相0.1%甲酸水溶液-乙腈，流速0.4mL/min，進(jìn)樣體積4μL。質(zhì)譜條件：ESI（電噴霧離子源），正離子檢測，其中離子電壓控制在5500V，去集簇電壓70V，多反應(yīng)檢測（MRM）方式定量，奧司他韋313.2→225.1，奧司他韋羧酸285.2→138.1，奧司他韋-d3316.2→228.2，奧司他韋羧酸–d3288.3→138.1。4.3溶液的配制精密稱取奧司他韋和奧司他韋羧酸對照品，用適量的甲醇溶解，使用校正因子，分別配制成濃度為1mg/mL的奧司他韋和奧司他韋羧酸儲備液。將奧司他韋和奧司他韋羧酸依次配制成25.0/100、50.0/200、150/600、800/3200、1600/6400、6000/24000、9000/36000和10000/40000ng/mL溶液。取奧司他韋-d3和奧司他韋-d3對照品，用適量的甲醇溶解，配制成濃度為1.mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液IS-A，用甲醇溶液稀釋至200/1000ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作溶液IS?C[1-5]。2.4血漿樣品處理取血漿樣品490μL，加入奧司他韋和奧司他韋羧酸對照品系列溶液10μL，配制成相當(dāng)于奧司他韋和奧司他韋羧酸血漿濃度為0.500/2.00，1.00/4.00，3.00/12.0，16.0/64.0，32.0/128，120/480，180/720，200/800ng/mL的血漿樣品，依次加入內(nèi)標(biāo)工作液IS?C10

μL（200

ng/mL），390μL的甲醇溶液，渦旋5min，在4000rpm、4℃條件下離心5分鐘，使用移液工作站移取上清液100μL至96孔板中，加入200μL甲醇：水（1:9）溶液稀釋，渦旋3分鐘，在4000rpm、4℃條件下離心5分鐘后進(jìn)行分析。5方法與結(jié)果蛋白沉淀法提取分析物和內(nèi)標(biāo)，采用反相色譜柱將奧司他韋和奧司他韋羧酸和內(nèi)標(biāo)從生物基質(zhì)中分離，使用串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀的電噴霧離子化方式（ESI）對分析物進(jìn)行定量分析。取空白血漿100mL，按2.4“血漿樣品處理”項下操作，通過分析物/內(nèi)標(biāo)的峰面積比值進(jìn)行回歸分析。奧司他韋和奧司他韋羧酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線滿足方法驗證的線性要求，且標(biāo)準(zhǔn)樣品滿足方法驗證的相關(guān)接受標(biāo)準(zhǔn)。奧司他韋標(biāo)準(zhǔn)樣品的批間準(zhǔn)確度偏差在-3.80%和11.67%之間，批間精密度在1.44%和4.51%之間；奧司他韋羧酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的批間準(zhǔn)確度偏差在-4.50%和11.67%之間，批間精密度在1.90%和3.95%之間。色譜圖由analystTM軟件1.6.3版自動采集。用分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比和標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程（使用加權(quán)最小二乘法，權(quán)重因子1/x2），軟件自動計算濃度。經(jīng)驗證，1.本專題考察了6個不同來源空白人血漿，分別配制了空白樣品（不含分析物和內(nèi)標(biāo)的處理過的基質(zhì)樣品）、內(nèi)標(biāo)空白樣品（含內(nèi)標(biāo)的處理過的基質(zhì)樣品）、定量下限；此外使用不同來源空白人血漿的混合基質(zhì)配制內(nèi)標(biāo)空白樣品和不含內(nèi)標(biāo)的奧司他韋/奧司他韋羧酸定量上限樣品及混合空白基質(zhì)加入單個待測物（不加其它待測物及內(nèi)標(biāo)）的定量上限樣品。在6個不同來源空白人血漿樣品中未檢測到奧司他韋、奧司他韋羧酸或內(nèi)標(biāo)、內(nèi)標(biāo)空白樣品中未檢測到奧司他韋和奧司他韋羧酸、不含內(nèi)標(biāo)的奧司他韋/奧司他韋羧酸定量上限樣品中未檢測到內(nèi)標(biāo)，僅含待測物奧司他韋（不加待測物奧司他韋羧酸及內(nèi)標(biāo)）的定量上限樣品未檢測到奧司他韋羧酸及內(nèi)標(biāo)，僅含待測物奧司他韋羧酸（不加待測物奧司他韋及內(nèi)標(biāo)）的定量上限樣品未檢測到奧司他韋及內(nèi)標(biāo)。結(jié)果表明不同來源的基質(zhì)對奧司他韋和奧司他韋羧酸的測定不存在干擾，且奧司他韋、奧司他韋羧酸以及內(nèi)標(biāo)之間也不存在相互干擾。本方法未見顯著進(jìn)樣殘留；2.連續(xù)測定3天，考察3個分析批次，每批次各考察考察了奧司他韋和奧司他韋羧酸高、中、幾何中、低4個濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度6個樣品。奧司他韋和奧司他韋羧酸高、中、幾何中、低4個濃度質(zhì)控樣品批內(nèi)準(zhǔn)確度偏差在-6.57%到13.33%之間，批內(nèi)精密度在0.94%到5.56%之間，批間準(zhǔn)確度偏差在-3.88%到8.67%之間，批間精密度在2.97%到4.08%之間。3.奧司他韋高、中、低3個濃度質(zhì)控樣品的平均提取回收率為95.13%、94.22%、91.89%，內(nèi)標(biāo)平均提取回收率為89.53%，奧司他韋羧酸高、中、低3個濃度質(zhì)控樣品的平均提取回收率為95.54%、95.87%、91.46%，內(nèi)標(biāo)平均提取回收率為88.83%，表明在本方法的定量范圍內(nèi)奧司他韋和奧司他韋羧酸具有足夠、相對均一的提取回收率，且內(nèi)標(biāo)具有較高的回收率。4.溶血效應(yīng)、高脂效應(yīng)考察了人血漿溶血現(xiàn)象在高、低濃度質(zhì)控樣品（每個濃度4個樣品）中奧司他韋真實濃度的影響。提取后溶血樣品、高脂樣品的準(zhǔn)確度的真實值在±15%之內(nèi)且精密度%CV≤15%，均滿足相應(yīng)的接受標(biāo)準(zhǔn)，表明人血漿溶血現(xiàn)象對奧司他韋血漿樣品真實濃度無影響。溶血效應(yīng)、高脂效應(yīng)考察了人血漿溶血現(xiàn)象在高、低濃度質(zhì)控樣品（每個濃度4個樣品）中奧司他韋羧酸真實濃度的影響。提取后溶血樣品、高脂樣品的準(zhǔn)確度的真實值在±15%之內(nèi)且精密度%CV≤15%，均滿足相應(yīng)的接受標(biāo)準(zhǔn)，表明人血漿溶血現(xiàn)象對奧司他韋羧酸血漿樣品真實濃度無影響[3]。6小結(jié)本方法中，鹽酸奧司他韋和奧司他韋羧酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)控樣品使用K2-EDTA為抗凝劑的人血漿配制，奧司他韋-d3和奧司他韋羧酸-d3分別作為奧司他韋和奧司他韋羧酸的內(nèi)標(biāo)。采用蛋白沉淀法從100L血漿中提取分析物和內(nèi)標(biāo)，采用反向色譜柱將奧司他韋和奧司他韋羧酸和內(nèi)標(biāo)從生物基質(zhì)中分離，并使用串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀的電噴霧離子化方式（ESI）對分析物進(jìn)行定量分析。經(jīng)驗證的奧司他韋的線性定量范圍為0.500ng/mL~200ng/mL，奧司他韋羧酸的線性定量范圍為2.00ng/mL~800ng/mL。本研究對測定人血漿中奧司他韋和奧司他韋羧酸的LC?MS/MS法進(jìn)行了全面方法驗證。方法驗證結(jié)果證明了本方法對于測定人血漿中奧司他韋和奧司他韋羧酸濃度的可靠性。此方法的選擇性、準(zhǔn)確度、精密度、基質(zhì)效應(yīng)、耐用性、定量下限、溶血效應(yīng)、高脂效應(yīng)及全血穩(wěn)定性均滿足接受標(biāo)準(zhǔn)。參考文獻(xiàn)[1].流行性感冒診療方案(2020年版)[J].中國病毒病雜志,2021,11(01):1-5.DOI:10.16505/j.2095-0136.2020.0085[2].磷