DB50T 1254-2022 山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒EvaGreen熒光定量PCR檢測方法　　

ICS11.220CCSB41DB50重慶市市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB50/T1254—2022本文件按照GB/T1.1－2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由重慶市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會提出并歸口。本文件起草單位：重慶市畜牧科學(xué)院、西南大學(xué)、重慶市酉陽土家族苗族自治縣畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心。本文件主要起草人：陳靜、葉超、方仁東、何瑋、徐遠(yuǎn)東、范彥、黃德均、趙金紅、孫曉燕、黎年1DB50/T1254—2022山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒EvaGreen熒光定量PCR檢測方法本文件規(guī)定了山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒EvaGreen熒光定量PCR檢測方法的縮略語、原理、試劑和耗材、儀器和設(shè)備、樣品采集、運輸與保存、操作步驟、結(jié)果判定、實驗室生物安全要求等內(nèi)容。本文件適用于山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒核酸的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T22915口蹄疫病毒熒光RT-PCR檢測方法NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。cDNA互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementaryDNA）Ct值每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（Cyclethreshold）DEPC焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）ENTV-2山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒（Enzooticnasaltumorvirus2ofgoats）gDNA基因組DNA（genomicDNA）gDNase基因組脫氧核糖核酸酶（Genomicdeoxyribonuclease）PBS磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferedSolution）PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）qPCR熒光定量PCR（QuantitativePCR）RNA核糖核酸（RibonucleicAcid）5原理2DB50/T1254—2022根據(jù)山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒基因特定的序列設(shè)計合成一對特異性引物，該對引物能針對ENTV-2目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生雙鏈DNA片段，在qPCR反應(yīng)體系中加入的EvaGreen熒光染料能與雙鏈DNA片段結(jié)合而產(chǎn)生熒光信號，通過檢測PCR反應(yīng)液中的熒光信號強(qiáng)弱，實現(xiàn)對目的基因的準(zhǔn)確定量。隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物與熒光信號的增長呈現(xiàn)對應(yīng)關(guān)系。6試劑和耗材6.1除特別說明外，本文件所用試劑均為分析純，所有試劑均用無RNA酶污染的容器（用DEPC水處理后高壓滅菌）分裝。6.2RNA提取試劑：Trizol、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、DEPC水，或其他同等效果的商品化試劑盒。6.3反轉(zhuǎn)錄試劑：5×gDNABuffer（含gDNase）、FQ-RTPrimerMix、FastKingRTEnzymeMix、10×KingRTBuffer；或其他同等效果的商品化試劑盒。6.4反應(yīng)液：EvaGreen熒光定量PCR反應(yīng)液。6.5特異性引物：ENTV-2-F：GAGGCAAATTGAGGCGTTGAT；ENTV-2-R：CCCGTTCTGCATTCG-CTGTAG（靶序列見附錄A）。6.6陰性對照：DEPC水。6.7陽性對照：質(zhì)粒pMD-19T-ENTV-2。6.8PBS溶液：按照GB/T22915中PBS溶液配制的規(guī)定執(zhí)行。6.91.5mL離心管（無RNA酶）。6.100.2mLPCR管。6.11醫(yī)用棉簽。7儀器和設(shè)備7.1熒光定量PCR儀。7.2高速冷凍離心機(jī)。7.3恒溫水浴鍋。7.4超凈工作臺。7.5生物安全柜（A2級）。7.6微量可調(diào)移液器（2.5μL，10μL，100μL，1mL）及配套帶濾芯吸頭。7.7超低溫冰箱。7.8常規(guī)冰箱。7.9制冰機(jī)。7.10瞬時離心機(jī)。7.11渦旋振蕩儀。8樣品采集、運輸與保存8.1采集與運輸樣品采集及運輸按照NY/T541的規(guī)定執(zhí)行。山羊鼻腔內(nèi)有鼻液的直接用醫(yī)用棉簽采集，無鼻液的用蘸有PBS溶液的醫(yī)用棉簽采集，拭子放入1.5mL離心管內(nèi)，做好標(biāo)識，再將離心管放入塑料自封袋內(nèi)，然后放入裝有冰袋的保溫箱，24h內(nèi)運輸至實驗室。3DB50/T1254—20228.2保存按照GB/T22915的規(guī)定執(zhí)行。采集或處理好的樣品在0℃~4℃條件下保存不應(yīng)超過24h；如需長期保存，應(yīng)置-80℃冰箱，避免反復(fù)凍融。9操作步驟9.1樣品處理在生物安全柜中，向裝有拭子的1.5mL離心管中加入滅菌PBS溶液0.5mL，在渦旋振蕩器上振蕩15s，吸出全部PBS懸液備用。9.2病毒RNA的提取9.2.1吸取上述樣品處理后的PBS懸液0.2mL置入新的1.5mL離心管，加入0.7mLTrizol，渦旋振蕩15s，室溫靜置10min。9.2.2加入0.2mL三氯甲烷，渦旋振蕩15s，4℃12,000rpm離心10min，取上清液。9.2.3加入0.5mL的異丙醇混勻，4℃12,000rpm離心10min，棄去上清液。9.2.4加入1ml75%乙醇，4℃12,000rpm離心10min，棄去上清液。9.2.5室溫靜置干燥，加入20μLDEPC水溶解沉淀，直接用于實驗或置-80℃超低溫冰箱保存。9.3反轉(zhuǎn)錄9.3.1模板RNA應(yīng)在冰上解凍，表1和表2中所用試劑應(yīng)在室溫下解凍，然后使用前分別渦旋振蕩混勻，離心15s，置于冰上備用。9.3.2基因組DNA（gDNA）去除反應(yīng)體系的配制：在超凈工作臺中，將表1中的試劑依次加入PCR管中，渦旋振蕩混勻，離心15s，在恒溫水浴鍋中42℃孵育3min，作為反轉(zhuǎn)錄的RNA模板。表1gDNA去除反應(yīng)體系253表2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系22154DB50/T1254—20229.3.3反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的配制：在超凈工作臺中，將表2中的試劑依次加入PCR管中，渦旋振蕩混勻，離心15s。9.3.4RNA樣品的反轉(zhuǎn)錄：42℃15min，95℃3min，反應(yīng)結(jié)束后，置冰上冷卻，得cDNA用于后續(xù)實驗，或放入-20℃冰箱中儲存。9.4熒光定量PCR檢測9.4.1熒光定量PCR反應(yīng)體系使用EvaGreen熒光定量PCR反應(yīng)液SsoFast?EvaGreen?Supermix進(jìn)行PCR。ENTV-2-F和ENTV-2-R濃度均為10μM，反應(yīng)體系具體見表3。表3熒光定量PCR反應(yīng)體系 ——9.4.2熒光定量PCR反應(yīng)條件預(yù)變性95℃2min；變性95℃5s，60℃30s（收集信號共40個循環(huán)；熔解曲線條件：95℃注：或采用其他同等效果的EvaGreen熒光定量PC10結(jié)果判定10.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對照無Ct值，無特異性擴(kuò)增曲線，無熔解峰；陽性對照Ct值應(yīng)≤28.0，有特異性擴(kuò)增曲線，熔解曲線只在82℃有一個熔解峰，實驗成立，否則，實驗無效。10.2結(jié)果描述及判定10.2.1陰性結(jié)果無Ct值，無特異性的擴(kuò)增曲線，無熔解峰，判定被檢樣品中山羊鼻內(nèi)腫瘤病毒核酸為陰性。10.2.2陽性結(jié)果Ct值小于35.0，出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增曲線，熔解曲線只有一個峰，且在82℃,判定被檢樣品中山羊鼻內(nèi)腫瘤病毒核酸為陽性。10.2.3可疑樣品判定5DB50/T1254—202235.0≤Ct值≤40.0的樣品應(yīng)復(fù)檢，復(fù)檢的結(jié)果仍為35.0≤Ct值≤40.0，熔解曲線只有一個峰，且在82℃,判定為陽性；無Ct值者判定為陰性。11實驗室生物安全要求實驗操