DB50T 1407-2023 新城疫病毒免疫層析(膠體金)檢測(cè)技術(shù)規(guī)范　

ICS65.020CCSB41DB50重慶市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB50/T1407—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由重慶市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)提出、歸口并組織實(shí)施。本文件起草單位：重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、重慶理工大學(xué)。本文件主要起草人：曹蕓、董春霞、吳勝昔、黃恒、陳忠瓊、姚璐、藺露、凌洪權(quán)、向夢(mèng)玲、向夢(mèng)雪、孟麗娜。1新城疫病毒免疫層析(膠體金)檢測(cè)技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了新城疫病毒免疫層析(膠體金)的檢測(cè)原理、儀器與耗材、材料、樣品前處理、樣品2規(guī)范性引用文件僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T39707醫(yī)療廢物處理處置污染控制標(biāo)準(zhǔn)SN/T2984檢驗(yàn)檢疫動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)活動(dòng)生物安全要求細(xì)則3術(shù)語(yǔ)和定義4檢測(cè)原理過毛細(xì)作用向前移動(dòng)，抗原被包被于硝酸纖維膜(NC膜)上的羊抗新城疫病毒抗體(多克隆抗體)捕獲并截留，形成可見的紫紅色檢測(cè)線(簡(jiǎn)稱T線)。如果樣品中沒有抗原，則不能形成紅色的金標(biāo)結(jié)合物，流過T線時(shí)不發(fā)生捕獲截留，T線保持白色?？乖贵w反應(yīng)后未結(jié)合完的金標(biāo)抗體繼續(xù)層析與羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗體結(jié)合，形成第二條結(jié)合線(質(zhì)控線，簡(jiǎn)稱C線),若C線不顯示膠體金試紙卡結(jié)構(gòu)如圖1所示：2Ⅱ級(jí)生物安全柜(潔凈等級(jí)100級(jí)，對(duì)0.3μm顆粒過濾效率≥99.999%)、高速冷凍離心機(jī)(最高轉(zhuǎn)速22000r/min,溫度范圍：-20℃~+40℃)、高壓蒸汽滅菌器、電子天平(精確度0.001g)、6材料6.2.1可配制或采用商品化的PBS試劑(pH7.2)。7.2,分裝，121℃、15min高壓滅菌。試管壁，使附著的分泌物充分洗脫，置2℃~8℃,12,000r/min離心10min,取上清液待檢。樣品稱取組織塊0.5g,置于勻漿器中，加pH7.2PBS試劑1mL,研2℃~8℃,12,000r/min離心10min,取上清液待檢。尿囊液樣品置2℃~8℃,12,000r/min離心2min,取上清液待檢。反復(fù)凍融3次，將細(xì)胞培養(yǎng)液置2℃~8℃,12,000r/min離心2min,取上清液待檢。3DB50/T1407—2023水平放置5min～10min，觀察結(jié)果。9結(jié)果判定當(dāng)試紙卡出現(xiàn)兩條紫紅色條帶（T線和C線），結(jié)果判為陽(yáng)性，記為“＋”。陰性當(dāng)試紙卡僅出現(xiàn)一條紫紅色條帶（C線），結(jié)果判為陰性，記為“－”。無(wú)效如試紙卡未出現(xiàn)C線，不論是否出現(xiàn)T線，結(jié)果均判為無(wú)效。10廢棄物處理應(yīng)符合GB/T39707的規(guī)定。4DB50/T1407—2023新城疫病毒膠體金試紙卡的制備A.1單克隆抗體制備利用雜交瘤技術(shù)，通過細(xì)胞融合，篩選制成特異性新城疫病毒（NDV）單克隆抗體。該抗體針對(duì)NDV血凝素，決定了試紙卡的特異性。A.2多克隆抗體制備A.2.1羊抗NDV抗體用純化的NDV免疫山羊后，提取羊血清中的免疫球蛋白制成羊抗NDV抗體。該抗體可與金標(biāo)抗體——NDV抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，形成夾心抗原抗體復(fù)合物，用于膠體金試紙卡硝酸纖維膜（NC膜）的捕獲線。A.2.2羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗體用Balb/C小鼠的免疫球蛋白作為抗原，免疫山羊后，提取羊血清中的免疫球蛋白制成羊抗Balb/C小鼠免疫球蛋白抗體。該抗體用于硝酸纖維膜（NC膜）的質(zhì)控線，可與金標(biāo)抗體結(jié)合，以此檢驗(yàn)試紙卡的有效性。A.3金標(biāo)抗體制備用氯金酸制備30nm膠體金顆粒，將NDV單克隆抗體與膠體金顆粒按照18μg/mL進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記完后用牛血清白蛋白（BSA）進(jìn)行封閉。標(biāo)記好的金標(biāo)抗體用高速離心法進(jìn)行純化，去除游離抗體和蛋白及其它小分子物質(zhì)。采用1％BSA緩沖液將金標(biāo)抗體懸浮保存。懸浮后的金標(biāo)抗體在室溫條件下能保存一年以上。A.4膠體金結(jié)合墊制備將玻璃纖維膜浸泡于80mMNa2B4O7·10H2O，0.1％PVA，0.1％Tween?20，0.3％BSA的處理液中，于4℃條件下浸泡10～12h，37℃烘干4～5h。將制備的金標(biāo)抗體噴涂于處理過的玻璃纖維膜上，切成50mm寬度，即制成膠體金結(jié)合墊。A.5膠體金樣品墊制備樣品墊浸泡于80mMNa2B4O7·10H2O，0.1％PVA，0.1％Tween?20，0.3％BSA的處理液中，在37℃的溫度下干燥2h后，切成40mm寬度，用于過濾樣品中的有形成分，同時(shí)保證NDV抗原不變性。樣品墊置于試紙卡的最前端，樣品孔的下端。A.6試劑條板制備將處理好的膠體金樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、吸水墊紙按順序依次粘貼在試劑條板上。A.7NC膜噴樣在制備好的試劑條板的NC膜上分別噴涂捕獲抗體（羊抗NDV抗體）和質(zhì)控抗體（羊抗Balb/C球蛋白抗體），線寬1mm，噴完后于37℃下干燥。A.8試劑條