可見分光光度法和紫外分光光度法

第十三章 紫外-可見分光光度法分光光度法(spectrophotometry)：根據(jù)物質(zhì)的吸收光譜及光的吸收定律，對物質(zhì)進(jìn)行定性、定量分析的一種分析方法。

第一節(jié) 分光光度法的基本原理一、物質(zhì)對光的選擇性吸收

1、電磁輻射光 E=hμ=hc/λ

單色光：單一波長的光稱為單色光，

復(fù)色光：由不同波長組成的光稱為復(fù)色光。

光紅橙黃綠青蘭紫波長780-620620-590590-560560-500500-480480-430430-380光的互補(bǔ)性：若兩種顏色的光按適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度比混合可得白光，則這兩種光稱為互補(bǔ)色光。

2、物質(zhì)對光的選擇性吸收

M(基態(tài))+h

M*(激發(fā)態(tài))ΔE=E（激發(fā)態(tài)）-E（基態(tài)）=h

只有當(dāng)光子的能量(h

)與被照射物質(zhì)粒子的基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差(

E)相等時，才能被吸收。處于同一直線上的兩種色光為互補(bǔ)光。如藍(lán)光與黃光互補(bǔ)，青光與紅光互補(bǔ)等。

二、物質(zhì)的吸收光譜

吸收光譜：溶液對不同波長的光的吸收程度不同，以吸收程度（吸光度）為縱坐標(biāo)，以波長為橫坐標(biāo)作圖，所得曲線，即為吸收光譜或稱吸收曲線。最大吸收波長：吸收光譜中，吸光度最大處的波長為最大吸收波長，用

max表示。三、透光率和吸光度I0IaItI0=Ia

+It透光率的取值范圍：0-100%T越大，溶液對光的吸收程度越小。

吸光度的取值范圍：0~+∞

A愈大，溶液對光的吸收愈多。四、Lambert-Beer定律

A=εbc

A：吸光度，

b：吸收池厚度，單位，cm。

c：物質(zhì)的量濃度（mol.L-1）

ε：摩爾吸光系數(shù)，單位：L.mol-1.cm-1例已知某化合物的相對分子質(zhì)量為251，將此化合物用乙醇作溶劑配成濃度為0.150mmol

L-1的溶液，在480nm波長處用2.00cm吸收池測得透光率為39.8%，求該化合物在上述條件下的摩爾吸光系數(shù)。解由Lambert-Beer定律可得：說明1：Lambert-Beer定律只適用于單色光。說明2：吸光度具有加和性。

A═A1+A2+A3+……例12-2測試酶與腺苷酸(AMP)體系的吸光度如下：A(280nm)=0.46，A(260nm)=0.58，試計算每一組分的濃度。已知吸收池厚度為1.00cm。酶 ε(280nm)=2.96×104L.mol-1.cm-1 ε(260nm)=1.52×104L.mol-1.cm-1AMP ε(280nm)=2.4×103L.mol-1.cm-1

ε(260nm)=1.5×104L.mol-1.cm-1解設(shè)酶和AMP的濃度分別為y和z

為260nm0.58═1.52

104

1.00

y+1.5

104

1.00

z

為280nm0.46═2.96

104

1.00y+2.4

103

1.00

z解方程得：y═1.4

10-5mol

L–1z═2.5

10-5mol

L-1答： 酶的濃度為1.4

10-5mol

L–1 AMP的濃度為2.5

10-5mol

L-1。

第二節(jié) 紫外-可見分光光度法一、分光光度計光源→單色器→吸收池→訊號處理及顯示器1、光源：鎢燈，可發(fā)出320~3200nm的連續(xù)光譜，最適宜的波長范圍為360~1000nm。2、單色光器(monochromatro)3、吸收池：厚度有0.5、1.0、2.0、3.0、5.0cm等規(guī)格。4、檢測器：可見分光光度計用光電管、放大器、指示器。指示器一般有微安電表，記錄器，數(shù)字顯示和打印等。二、測定方法（一）標(biāo)準(zhǔn)曲線法配成一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的波長處用同樣厚度的吸收池分別測其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)作圖，可得一通過原點(diǎn)的直線，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）標(biāo)準(zhǔn)對照法用標(biāo)準(zhǔn)品配制一個已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定的波長處用同樣厚度的吸收池分別測定標(biāo)準(zhǔn)溶液和未知溶液的吸光度，用計算公式求出未知溶液的濃度。1、溶劑空白除被測物外無