基因診斷與治療

第八章基因診斷與基因治療第一節(jié)基因診斷

基因診斷(genediagnosis)是以DNA和RNA為診斷材料，通過檢查基因的存在、缺陷或表達(dá)異常，對人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程。一、基因診斷的概念基因診斷的根本原理是檢測DNA或RNA的結(jié)構(gòu)變化與否，量的多少及表達(dá)功能是否正常，以確定被檢查者是否存在基因水平的異常變化，以此作為疾病確診的依據(jù)。1、核酸分子雜交關(guān)于核酸分子雜交的根本原理和根本類型前面已講過。用于基因診斷的核酸分子雜交方法包括：

〔1〕Southern印跡法是最經(jīng)典的基因分析方法，不但能檢出特異的DNA片段，而且能進(jìn)行定位和測定分子量，可用于基因的酶切圖譜分析、基因突變分析等。〔2〕Northern印跡法可用于組織細(xì)胞中總RNA或mRNA的定性和定量分析。Southern印跡Northern印跡〔3〕斑點雜交可用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量分析。優(yōu)點：方法簡單、快速、靈敏、樣品用量少；缺點：是不能鑒定所測基因的分子量，特異性不高，有一定比例的假陽性。

〔4〕原位雜交可查明染色體中特定基因的位置，用于染色體疾病的診斷。原位雜交的結(jié)果是顯示有關(guān)核酸序列的空間位置狀況，因此可檢出含核酸序列的具體細(xì)胞，也可檢出基因和基因產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位。2、聚合酶鏈?zhǔn)椒错?PCR)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(singlestrandconformationpolymorphism，SSCP)檢測是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差異來檢測點突變的方法。3、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測基因突變可能導(dǎo)致基因上某一限制酶識別位點的喪失或其相對位置發(fā)生改變，以此酶消化待測DNA和野生型對照DNA，通過比較二者的酶切片段的長度、數(shù)量上的差異就可判斷待測DNA的突變情況。4、限制酶酶譜分析5、DNA序列測定〔二〕基因診斷的根本方法人類疾病的原因包括內(nèi)因和外因兩大類，內(nèi)因主要是指遺傳因素，即基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)狀況的改變。其中基因結(jié)構(gòu)的改變包括點突變、插入、缺失，重排、易位、基因擴(kuò)增、基因結(jié)構(gòu)多態(tài)性變異、前病毒插入等；外因是指外在的環(huán)境因素，如病原體的侵入等。因此，針對這些病因可采取相應(yīng)的基因診斷方法，主要的可從以下幾個方面著手：

①診斷的點突變：對于突變位點已被說明的一些遺傳病，可以采用PCR／ASO(allelespecificoligonucleotide，ASO，等位基因特異性寡核苷酸)探針法進(jìn)行檢測。在擴(kuò)增DNA片段后直接與相應(yīng)寡核苷酸探針雜交，即可明確診斷是否有突變以及突變是純合子還是雜合子。1、基因突變的診斷〔1〕點突變的診斷在該位點兩端設(shè)計引物1、2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到產(chǎn)物后進(jìn)行斑點雜交或狹縫雜交。針對該突變分別合成一對寡核苷酸片段作為探針〔待檢測的位點位于最中央〕：其中一個為正常探針，與正常序列互補(bǔ)；另一個是突變探針，與突變序列互補(bǔ)。3′突變位點5′引物2引物1寡核苷酸探針中央堿基與被探測的DNA上相應(yīng)堿基或匹配或錯配，對二者結(jié)合力影響最大。嚴(yán)格控制雜交及洗脫條件，使只有與靶序列完全互補(bǔ)的探針才能結(jié)合在等位基因片段上，而中央堿基與靶序列不匹配的探針那么不能結(jié)合在等位基因片段上。結(jié)果分析：a.如果從受檢者DNA擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物只與正常探針雜交，表示受檢者不存在這種突變基因；b.如果只有突變探針可以雜交，那么說明突變基因是純合子；c.假設(shè)正常探針與突變探針都可雜交，說明突變基因是雜合子；d.如果患者的DNA與正常探針以及所有突變基因的寡核苷酸探針均不能雜交，那么提示患者的缺陷基因不屬于先前已發(fā)現(xiàn)的突變類型，而很可能是一種新的突變類型。ATCG芯片設(shè)計探針定位新突變新突變〔雜合子〕〔純合子〕C→T正常C→TC→GC→A點突變檢測熒光亮點模式

可采用PCR／SSCP／sequencing方法。②診斷未知的突變〔2〕少數(shù)核苷酸缺失或插入的診斷可以采用檢測點突變的方法?！?〕大片段喪失或插入的診斷5′3′致病基因引物1引物2引物3引物4引物1和2：可確定有無缺失及缺失片段的相對大小。引物3和4：確定缺失部位。引物3和4的設(shè)計要通過研究來加以確定。對于一些較長的基因，設(shè)計兩端引物(1和2)進(jìn)行擴(kuò)增是不適宜的，PCR擴(kuò)增2kb以上的片段比較困難。在這種情況下可采用多重PCR的方法。利用PCR可以檢測基因重排，其前提是重排基因和重排位點的序列?！?〕基因重排(染色體易位)的診斷以待測基因的DNA片段或cDNA片段作為探針，采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⒒蚪MDNA進(jìn)行酶切，通過Southern印跡雜交分析。假設(shè)基因組中該基因(或DNA片段)的拷貝數(shù)發(fā)生改變，雜交后顯示的條帶位置會發(fā)生改變，對放射性自顯影條帶進(jìn)行吸光度掃描，可進(jìn)行基因定量。〔5〕基因擴(kuò)增的診斷

在人群中，個體間基因組的核苷酸序列存在著差異性，稱為DNA的多態(tài)性。突變、重排、單個核苷酸的插入或缺失可使DNA順序發(fā)生改變。其中有些可能造成限制酶切位點的增加、缺失或易位，致使DNA分子的限制酶切位點數(shù)目、位置發(fā)生改變。用限制酶切割基因組時，所產(chǎn)生的限制性片段的數(shù)目和每個片段的長度就不同，這就是限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)。能導(dǎo)致限制性片段發(fā)生改變的酶切位點又稱為多態(tài)性位點。

2、多態(tài)性分析〔1〕限制性片段長度多態(tài)性分析

①限制酶酶切圖譜直接分析法

適用于分析點多態(tài)性、核苷酸的缺失、插入或重組引起的多態(tài)性，可用于診斷疾病基因結(jié)構(gòu)多態(tài)性變異已經(jīng)明確的疾病。

RFLP分析法主要有限制酶酶切圖譜直接分析法和RFLP間接分析法。②RFLP間接分析法大多數(shù)由基因缺陷引起的遺傳性疾病的基因結(jié)構(gòu)、突變情況和基因產(chǎn)物等遺傳根底并不清楚，不能應(yīng)用限制酶酶切圖譜直接分析法進(jìn)行診斷，而需要采用基因連鎖分析。人類基因的基因內(nèi)或旁側(cè)序列存在許多重復(fù)序列(如微衛(wèi)星DNA2-6個堿基重復(fù)序列、小衛(wèi)星DNA6-12個堿基重復(fù)序列等)，由于重復(fù)單位的數(shù)目不同而形成多態(tài)性。已發(fā)現(xiàn)一些基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)異常與這些重復(fù)序列相關(guān)。對這些重復(fù)序列的多態(tài)性分析也成為基因診斷的重要依據(jù)。如果重復(fù)序列兩側(cè)的DNA序列，即可根據(jù)這些序列設(shè)計PCR引物，通過PCR產(chǎn)物的電泳分析來檢測重復(fù)序列的多態(tài)性?！?〕DNA重復(fù)序列多態(tài)性分析

結(jié)構(gòu)基因變異可引起疾病，基因表達(dá)過程發(fā)生異常亦可引起疾病。通過RNA診斷可對待測基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)進(jìn)行定性、定量分析，檢測其轉(zhuǎn)錄和加工的缺陷以及外顯子的變異等，既可用于疾病的診斷，也可用于基因治療效果的監(jiān)測。常用的診斷方法有如下幾種：

3、基因表達(dá)異常的診斷①斑點雜交或狹縫雜交：②RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)法:〔1〕mRNA的相對定量分析〔2〕mRNA的絕對定量分析可采用RT-PCR/競爭性PCR的方法〔3〕mRNA長度分析可采用Northern雜交法4、外源DNA檢測〔一〕遺傳性疾病的種類1、染色體病〔染色體或數(shù)目改變〕2、單基因病3、多基因病〔二〕遺傳性疾病基因診斷的策略三、遺傳病的基因診斷

現(xiàn)已證實，所有遺傳性疾病都是由于某種基因的缺失或變異所致。對這類疾病進(jìn)行基因診斷可采取兩種策略：直接診斷策略和間接診斷策略。

遺傳性疾病通常的檢測診斷方法：

1、DNA檢測與分析2、RNA檢測與分析〔三〕遺傳性疾病檢測方法〔一〕感染性疾病的種類1、病毒性疾病2、細(xì)菌性疾病3、寄生蟲疾病〔二〕感染性疾病基因診斷的策略四、感染性疾病的基因診斷〔二〕檢測方法〔以肝炎為例〕1、檢測腫瘤相關(guān)基因2、檢測腫瘤相關(guān)病毒的基因3、檢測腫瘤標(biāo)志物基因或mRNA。腫瘤的發(fā)生開展是多因素、多基因、多階段相互協(xié)同作用的癌變過程，其關(guān)鍵是人類細(xì)胞基因組本身出現(xiàn)異常。目前，腫瘤的基因診斷可采取以下策略。五、腫瘤的基因診斷〔一〕腫瘤基因診斷的策略1、ras癌基因的檢測2、抑癌基因p53的檢測3、其它基因的檢測〔二〕腫瘤相關(guān)基因的檢測六、基因診斷在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用〔一〕法醫(yī)學(xué)鑒定的分子根底基因組DNA核苷酸的差異〔DNA的多態(tài)性〕〔二〕DNA指紋與法醫(yī)學(xué)鑒定針對重復(fù)序列人工合成寡核苷酸短片段作為探針，與經(jīng)過酶切的人基因組DNA進(jìn)行Southern雜交，得到的雜交帶圖譜具有個體特異性。第二節(jié)基因治療

隨著在細(xì)胞分子水平上對疾病發(fā)病機(jī)制認(rèn)識的深入，基因治療已成為目前醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)最重要的研究領(lǐng)域之一。人類基因治療最初著眼于遺傳病。1990年開始對腺苷酸脫氨酶(ADA)缺陷所致的先天性免疫缺陷綜合癥進(jìn)行體細(xì)胞基因治療并初見成效。隨后基因治療研究逐漸廣泛開展于多種遺傳病(如血友病等)、惡性腫瘤、傳染病(如艾滋病)、心血管疾病和糖尿病等基因治療(genetherapy)是指通過在特定靶細(xì)胞中矯正缺陷基因，表達(dá)該細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，或采用特定方式關(guān)閉、抑制異常表達(dá)基因，到達(dá)治療疾病目的的治療方法。策略：基因置換基因添加基因干預(yù)在基因治療研究的早期，基因治療是將目的基因?qū)氚屑?xì)胞后與宿主細(xì)胞內(nèi)的基因組發(fā)生整合，成為宿主遺傳物質(zhì)的一局部，目的基因表達(dá)產(chǎn)物起到對疾病的治療作用。一、基因治療的概念二、基因治療研究的主要內(nèi)容與策略〔一〕基因標(biāo)記基因標(biāo)記(genelabeling)實驗是基因治療的前奏。標(biāo)記假定對患者有治療作用的細(xì)胞，用標(biāo)記實驗驗證兩個問題：①外源基因是否平安地轉(zhuǎn)移到患者體內(nèi)；②從患者體內(nèi)取出的細(xì)胞能否檢測到轉(zhuǎn)移基因的存在。neo外源基因G418

所謂基因置換(genereplacement)或稱基因矯正(genecorrection)，是指將特定的目的基因?qū)胩囟ǖ募?xì)胞，通過定位重組，以導(dǎo)入的正常基因置換基因組內(nèi)原有的缺陷基因。基因置換的目的是糾正缺陷基因，將缺陷基因的異常序列進(jìn)行矯正，對缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變?！捕郴蛑脫Q基因添加或稱基因增補(bǔ)(geneaugmentation)是通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因?；蛱砑佑袃煞N類型：一是針對特定的缺陷基因?qū)肫湎鄳?yīng)的正常基因，使導(dǎo)入的正?；蛘系交蚪M中，而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導(dǎo)入的正?；虮磉_(dá)正常產(chǎn)物，從而補(bǔ)償缺陷基因的功能；二是向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物到達(dá)治療疾病的目的。例如，將細(xì)胞因子基因?qū)肽[瘤細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，即屬于這一類型。(三)基因添加基因干預(yù)(geneinterference)是指采用特定的方式促進(jìn)或者抑制某個基因的表達(dá)，以到達(dá)治療疾病的目的。較常用的方法是采用反義核酸或反義核酸加核酶，抑制基因的表達(dá)。此類基因治療的靶基因往往是過度表達(dá)的癌基因或者是病毒的基因。(四)基因干預(yù)三、基因轉(zhuǎn)移的方法基因治療的步驟包括目的基因克隆、基因轉(zhuǎn)移和臨床試驗觀察等。其中基因轉(zhuǎn)移是基因治療的關(guān)鍵?；?qū)塍w內(nèi)按照轉(zhuǎn)移途徑的不同可分為直接體內(nèi)法〔invivo〕和間接體內(nèi)法〔exvivo〕。直接體內(nèi)法：將基因直接導(dǎo)入體內(nèi)的各種體細(xì)胞中。間接體內(nèi)法：將外源基因在體外轉(zhuǎn)染病人靶細(xì)胞后，再將轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)的方法。將基因?qū)爰?xì)胞的方法可以分為:

1.非載體法質(zhì)粒DNA注射、體內(nèi)電穿孔等。2.非生物載體法脂質(zhì)體、微粒子、基因活化基質(zhì)

3.非病毒性生物載體法配體、基因疫苗

4.病毒載體法逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、單純皰疹病毒載體等四、靶細(xì)胞的選擇選擇適宜的細(xì)胞作為基因轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞是基因治療成功的重要因素。選擇靶細(xì)胞需考慮的因素：1〕選擇目的基因表達(dá)的細(xì)胞最好是組織特異性細(xì)胞，或者表達(dá)后能分泌或以其他方式進(jìn)入靶細(xì)胞；2〕細(xì)胞易獲得，且生命周期較長；3〕細(xì)胞較易轉(zhuǎn)染；4〕離體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染和一定時間培養(yǎng)后再植回體內(nèi)仍較易成活。可供選擇的靶細(xì)胞有兩大類：生殖細(xì)胞和體細(xì)胞。

目前常用的靶細(xì)胞：骨髓造血干細(xì)胞具有再生殖能力，且與許多遺傳病有關(guān)皮膚成纖維細(xì)胞具有長期自我更新能力肌細(xì)胞目前唯一用于DNA直接轉(zhuǎn)移的組織細(xì)胞肝細(xì)胞與很多遺傳病有關(guān)，且是腫瘤高發(fā)部位。淋巴細(xì)胞與免疫缺陷疾病、腫瘤有關(guān)，容易取出和回輸血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物直接進(jìn)入血流。生殖細(xì)胞能徹底根治遺傳病，但存在平安性問題基因治療方案用于人體之前必須進(jìn)行三個階段的試驗，即體外研究、小鼠體內(nèi)研究和靈長類動物體內(nèi)研究，以保證對人體無害。〔一〕遺傳病的基因治療研究目前發(fā)現(xiàn)的單基因病至少已有6000余種，其中有臨床改變的遺傳病約3000種。隨著人們生活條件與醫(yī)療水平的提高，多種傳染病得到控制，而遺傳病的危害逐漸突出。應(yīng)用：人類歷史上第一種進(jìn)行基因治療的疾病是腺苷脫氨酶缺乏癥，該病的基因治療是一個較成功的范例。五、基因治療的應(yīng)用研究從1984年開始研究。1990年，美國RAC與FDA批準(zhǔn)了ADA缺陷的基因治療。臨床基因治療于當(dāng)年開始。第一個接受基因治療的是一個4歲女孩。患兒從1990年9月起的10個半月中，共接受了7次自體細(xì)胞輸注，同時每周注射PEG-ADA，患兒免疫功能增強(qiáng)，臨床病癥改善。腫瘤是一種非常復(fù)雜的疾病，因此，腫瘤基因治療的