小麥快速發(fā)育、分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)規(guī)程

小麥快速發(fā)育、分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)規(guī)程分子標(biāo)記（輔助目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)育與聚合）、田間輔助選育等技術(shù)要求。本文件適用于快速創(chuàng)制小麥種質(zhì)及培育小麥新品種。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性應(yīng)用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4404.1-2008糧食作物種子第1部分：禾谷類(lèi)GB/T40188-2021畜禽分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)規(guī)程DB2017/0005-2022溫室玉米加代育種生產(chǎn)操作規(guī)程DB21/T2339-2014百合鱗片組織培養(yǎng)擴(kuò)繁技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。小麥快速發(fā)育（RapidWheatdevelopment）利用人工氣候室，依據(jù)小麥生長(zhǎng)發(fā)育特點(diǎn)，去除小麥籽粒灌漿與后熟的發(fā)育階段，加速營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，從而縮短小麥生長(zhǎng)發(fā)育周期。4前期準(zhǔn)備4.1儀器4.1.1DNA提取儀器核酸提取磨樣機(jī)、水浴鍋、移液器（1ML、100ul、10ul）、渦旋儀、低溫高速離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速>10000rpm）和通風(fēng)櫥等。4.1.2PCR檢測(cè)儀器PCR儀、電泳槽及凝膠成像系統(tǒng)。4.2小麥種植所需設(shè)施、生產(chǎn)資料4.2.1主要設(shè)施設(shè)備光溫可控溫室：可控溫度15℃~35℃;光通量密度.>100μmol/m2·s，采光或光照時(shí)間>14h。人工氣候箱：可控溫度6℃~25℃,光通量密度.>100μmol/m2·s。栽培盆規(guī)格：直徑25cm*高21cm育種田：土壤類(lèi)型為粘土具有良好的肥力，pH值適中（通常在6.0-7.5之間排水良好，無(wú)鹽堿化現(xiàn)象；隔離條件，為了防止不同品種之間的交叉污染，育種田應(yīng)與其他小麥田保持一定的隔離距離，通常建議至少100米以上。4.2.2生產(chǎn)資料育苗基質(zhì)、穴盤(pán)、穴盤(pán)托等、磷酸二氫鉀等常用肥料，百菌清、吡蟲(chóng)啉、菊酯類(lèi)等常用抑菌防蟲(chóng)藥物。5方案確定5.1分子標(biāo)記的篩選及親本的確定根據(jù)育種目標(biāo)，利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)（如：）或文獻(xiàn)獲得目標(biāo)基因標(biāo)記信息及供體親本，并對(duì)這些標(biāo)記的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證。5.2親本的選擇受體親本選擇：當(dāng)?shù)刈匀缓驮耘鄺l件的推廣品種，系譜及遺傳背景明確，綜合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)好，且具有較好的配合力，只有少數(shù)需改良性狀缺陷（質(zhì)量或主效基因控制的性狀）。供體親本選擇：系譜及遺傳背景明確，綜合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)好，含有與受體親本互補(bǔ)性狀的質(zhì)量或主效基因。5.3育種途徑的確定5.3.1轉(zhuǎn)育單個(gè)基因轉(zhuǎn)育單個(gè)基因，室內(nèi)單交(A/B)再連續(xù)回交3-4次(BCn)，然后自交2次，BCnF3代以后分子標(biāo)記輔助田間選擇。5.3.2多個(gè)基因聚合2個(gè)基因聚合親本各含一個(gè)目標(biāo)基因，室內(nèi)單交(A/B)后自交2次，F(xiàn)3代以后分子標(biāo)記輔助田間選擇。3個(gè)基因聚合每個(gè)親本各含一個(gè)目標(biāo)基因，采用復(fù)交的方式。一個(gè)親本分別與另外兩親本雜交，雜交后代再雜交(A/B//A/C)，然后自交2次，F(xiàn)3代以后分子標(biāo)記輔助田間選擇。6快速發(fā)育（幼胚培養(yǎng)）6.1幼穗的選取取授粉后15d左右的小麥幼穗，選取麥穗中部的6個(gè)小穗，去除包被的穎殼備用。6.2幼粒的消毒在超凈工作臺(tái)中，用1.5%的次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒10～15min，再用滅菌ddH2O沖洗6.3幼胚的獲取用鑷子捏住胚乳以固定籽粒，在籽粒頂部找到胚的位置，用另外一只鑷子在胚的左右兩端稍用力擠壓，從而獲得完整的幼胚（15d左右的小麥胚為淡黃色）。取胚的過(guò)程在無(wú)菌超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。6.4胚苗的培養(yǎng)將剝離的完整胚，盾片向下接種于PM培養(yǎng)基（附錄A）中，每個(gè)三角瓶（30ml的PM培養(yǎng)基）接種7～10個(gè)幼胚。接種好的幼胚在25°C、16h/d光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。6.5幼苗的春化將培養(yǎng)3d的胚苗放入6～8°C、16h/d光照培養(yǎng)箱中，春化30d。6.6溫室內(nèi)小麥栽培管理6.6.1供試土壤取田間中等肥力土與蛭石1:1比例，施入底肥，混拌均勻備用。田間土壤要求：土壤質(zhì)地為壤土或輕壤土，有機(jī)質(zhì)含量在1.5%～2.5%之間；土壤pH值在6.0～7.5之間；全氮含量在0.1%～0.2%之間；有效磷含量一般要求在15～30mg/kg之間；速效鉀含量在100～150mg/kg之間。6.6.2施肥管理施肥處理N、P2O5、K2O用量分別為0.3g/kg、0.2g/kg和0.13g/kg；磷肥、鉀肥和60%的氮肥在拌土?xí)r施入，40%的氮肥作為追肥。6.6.3小麥?zhǔn)覂?nèi)管理采用栽培盆種植，每盆裝供試土壤10kg，每盆定苗8株，于20°C～25°C、16h/d光照栽培，在小麥苗期及拔節(jié)期溫度控制在15°C～22°C之間，孕穗期及以后溫度控制在20~30°C之間，土壤含水量控制在60%-80%之間。7分子標(biāo)記輔助育種（轉(zhuǎn)育與聚合）7.1調(diào)節(jié)親本花期相遇父本分三批次種植于溫室，每批次種植間隔5d；母本與第二批次父本同時(shí)種植。7.2DNA的提取目標(biāo)基因轉(zhuǎn)育和聚合過(guò)程中，對(duì)雜交后代通過(guò)春化的幼苗按單株編號(hào)，移栽前取部分葉片，采用常規(guī)的SDS方法或商業(yè)試劑盒提取DNA。7.3分子標(biāo)記檢測(cè)依據(jù)公共數(shù)據(jù)庫(kù)（如：）或文獻(xiàn)獲得的目標(biāo)標(biāo)記信息，設(shè)計(jì)引物及確定反應(yīng)條件，記錄檢測(cè)數(shù)據(jù)。7.4選擇目標(biāo)基因純合的個(gè)體根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，保留含有目標(biāo)基因的幼苗進(jìn)入下一輪雜交或回交，直到聚合到全部的目標(biāo)基因，自交2代獲得目標(biāo)基因純合的個(gè)體，期間通過(guò)分子標(biāo)記檢測(cè)淘汰不含目標(biāo)基因的單株。8分子標(biāo)記田間輔助選育F3/BCnF3及以后世代在田間選擇，主要通過(guò)分子檢測(cè)與田間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)相結(jié)合選優(yōu)淘劣，在田間選擇上，更側(cè)重于農(nóng)藝性狀的綜合表現(xiàn)。8.1單株選擇F3/BCnF3～F4/BCnF4點(diǎn)播，選擇株高、生育期、成穗數(shù)、結(jié)實(shí)性等農(nóng)藝性好的優(yōu)良植株，按單株收獲，再通過(guò)比較種子大小、飽滿度等進(jìn)一步選優(yōu)淘劣。8.2株行比較F5/BC3F5代種植成株行，每單株種3行，冬前按行內(nèi)混合取樣，提取DNA進(jìn)行目標(biāo)基因檢測(cè)。田間調(diào)查時(shí)及在收獲前后根據(jù)快速育種目標(biāo)選優(yōu)淘劣。8.3產(chǎn)量比較試驗(yàn)及技術(shù)成果的應(yīng)用篩選出的綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的品系，進(jìn)行兩個(gè)年度的產(chǎn)量比較試驗(yàn)，產(chǎn)量等綜合農(nóng)藝性狀好品系，根據(jù)其品系特點(diǎn)可參加國(guó)家及省不同組別的相關(guān)小麥審定試驗(yàn)；對(duì)于聚合多個(gè)優(yōu)異基因，但農(nóng)藝性狀稍差的品系作為育種中間材料進(jìn)行保存。（資料性）A.1符號(hào)、代號(hào)、縮略語(yǔ)本文件所涉及的主要符號(hào)、代號(hào)、縮略語(yǔ)的全稱(chēng)及中文釋義如下：ddH2Odoubledistilledwater雙蒸水MASMark-assitedselection分子標(biāo)記輔助選擇SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸鈉A.2PM培養(yǎng)基制作A.2.1實(shí)驗(yàn)室常用儀器、器具培養(yǎng)箱、高溫高壓滅菌鍋、移液器、稱(chēng)量天平、冰箱(4℃,-20℃,-80℃)、pH測(cè)量?jī)x、鑷子、組培瓶、酒精燈，以及PM培養(yǎng)基、蒸餾水、瓊脂粉等。A.2.2PM培養(yǎng)基配方NH4NOKHPOHBOCHNOCHCNSCHNOCHNOFeSOOCHONOCHOA.2.3制作步驟①配制溶液向容器內(nèi)加入所需蒸餾水的一部分，按照配方稱(chēng)取各種藥品，并依次加入（前面的藥品充分溶解后再添加后面的藥品最后補(bǔ)足所需水分。對(duì)難溶的物質(zhì)，需加熱溶解，加熱過(guò)程所蒸發(fā)的水分，應(yīng)在全部