2025病原微生物宏基因組測序生物信息分析及報告質(zhì)量控制專家共識_第1頁
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文檔簡介

2025病原微生物宏基因組測序生物信息分析及報告質(zhì)量控制專家共識mNGS)以其測序通量高和測序非靶向的特點在臨床疑難、混合、罕見和新發(fā)病原微生物感染的診治中發(fā)揮了重要作用。及報告的臨床可靠性和診斷價值,中華醫(yī)學(xué)會測序后所獲數(shù)據(jù)的生物信息分析和判讀的技術(shù)要求,包括數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)庫構(gòu)建、數(shù)據(jù)分析方法和報告解讀與審一、共識形成方法(一)循證專家遴選本共識由中華醫(yī)學(xué)會檢驗醫(yī)學(xué)分會組織編寫,遴選來自國內(nèi)23家醫(yī)療機(jī)性(applicability的評級(rankings簡稱STAR委員會的專家共35名,分為循證組(18名)和撰寫組(27名)2組,分別負(fù)責(zé)循證文獻(xiàn)調(diào)研、使用者調(diào)查、專家函詢、證據(jù)收集和共識的起草、修訂以及互審和完稿。函詢及論證會專家納入標(biāo)準(zhǔn):(1)從事感染性病原微生物高通量測序檢測和應(yīng)用相關(guān)專業(yè)領(lǐng)域工作;(2)10年及以上相關(guān)工作經(jīng)歷;(3)碩士及以上學(xué)歷;(4)自愿參與本研究。(二)循證過程及結(jié)果1.循證方法:共召開4次線上和2次現(xiàn)場專家論證會和3輪專家函詢。度、推薦意見描述、推薦意見和修改意見等36項,正文經(jīng)過10輪修訂,匯總后形成6稿。通過函詢獲得新的意見和建議,由全體專家充分討論,針對每條推薦意見的細(xì)節(jié)查閱文獻(xiàn)、推敲語句,確識終稿。2.制訂函詢問卷:基于共識第3稿,設(shè)計專家函詢問卷;函詢后組織專家會議,共有30位專家參加了現(xiàn)場和線上結(jié)合的研討會。3.函詢結(jié)果:兩輪函詢專家積極系數(shù)均為100%,專家權(quán)威系數(shù)均為0.88。每個指標(biāo)的重要性賦值均數(shù)均>3.5分,且第二輪指標(biāo)變異系數(shù)均<0.25,兩輪函詢肯德爾和諧系數(shù)分別為0.30和0.39,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。兩輪函詢發(fā)放問卷42份,問卷有效回收率為100%。第二、三輪函詢分別有40和20名專家提出修改意見。(三)證據(jù)等級和推薦強(qiáng)度的分級定義共識3個級別,I為同意率(即選擇同意的專家人數(shù)比例)>90%(即強(qiáng)推薦),Ⅱ為70%~90%(即推薦),Ⅲ為<70%(即該條推薦建議未達(dá)成1.病原微生物宏基因組測序:直接對機(jī)體環(huán)境中的所有微生物DNA或微生物群的單一性測序,而是通過對基因組的序列,通常包括接頭污染、低質(zhì)量的末端序列、含N堿基數(shù)量過多的時,因接頭退火錯誤、未連接接頭干擾和擴(kuò)增過程中DNA斷裂等原因引起測序接頭序列的錯誤連接,使原本具有樣本特異接到其他樣本上,從而導(dǎo)致測序數(shù)據(jù)不能正確拆分為對應(yīng)樣本的情況。4.宿主基因組序列:指宿主生物體內(nèi)的全部遺傳物質(zhì)的序列。病原微生物的宿主基因組序列通常指人類基因組核酸片段,這些片段可影響微生物群落組成的統(tǒng)計分析和檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。5.參考菌株基因組:微生物數(shù)據(jù)庫中可用于比對并鑒定微生物物種類別的參考基因組序列,是識別出導(dǎo)致感染性疾病的關(guān)鍵因素,或發(fā)現(xiàn)新的抗生素靶標(biāo)的依據(jù)。6.比對:指將測序所得序列與數(shù)據(jù)庫中已知物種參考基因組序列對比,從而識別樣本中的微生物物種和功能基因的過程[1。7.唯一比對序列數(shù):指特異且唯一比對到該物種基因組上的序列的數(shù)目。8.覆蓋度:針對單個微生物物種基因組,被測序序列覆蓋的基因組區(qū)域占該微生物基因組全長的比例,即覆蓋度(Coverage)=覆蓋區(qū)域長度/參考基因組總長[2]。9.測序深度:針對單個物種基因組,測序序列中比對上該基因組的總堿基數(shù)除以基因組被覆蓋序列的堿基數(shù)的數(shù)值。10.均一性:基因組的均一性是指在全基因組測序中,測序得到的數(shù)據(jù)在基因組各個區(qū)域分布的均勻程度。通常以物匹配的數(shù)據(jù)是真實匹配還是同源性或是非特異性干擾[3]。12.組裝:mNGS的組裝是指將從樣本中提取的大量短序列通過列拼接等算法重新組合,以恢復(fù)出病原微生物的完整基因組序列的過程。和確定自人體環(huán)境標(biāo)本中測序獲得的DNA序列可能屬于的物種類級別(如界、門、綱、目、科、屬)的過程。14.人體定植微生物:即人體微生物群或微生物菌群。指那些在人體特定部位(如腸道、皮膚、口腔等)定居并能持續(xù)生長和繁殖的微生物,包括在健康狀態(tài)下對人體是有益的,而在特定條件下,15.責(zé)任致病微生物:通常指檢測出的微生物中導(dǎo)致宿主(人類、動物)發(fā)三、病原微生物mNGS檢測數(shù)據(jù)要求(一)數(shù)據(jù)質(zhì)量要求(P)。常用Q20和Q30分別代表質(zhì)量值≥20和≥30的堿基所占總測序量的百分比[4]。Q20對應(yīng)的測序準(zhǔn)確率為99%,Q30對應(yīng)的測序準(zhǔn)確率為99.9%。通常要求,Q30質(zhì)量的數(shù)據(jù)≥85%[4]。根據(jù)已公析和微生物物種注釋分析前,首先要根據(jù)測序序列共識1在分析測序數(shù)據(jù)之前,應(yīng)首先逐一對單樣本測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制,去除序列過短和低質(zhì)量的序列,獲得的高質(zhì)列比對以去除干擾,剩余序列進(jìn)入后續(xù)的微生物檢測分析。證據(jù)等級A,(二)數(shù)據(jù)量要求測序數(shù)據(jù)量是指每個標(biāo)本測序所得序列或堿基數(shù)(bp),二者可互換,在mNGS中多用序列數(shù)表示。測序數(shù)據(jù)量的要求與預(yù)期用途(如微生物檢測、抗生素耐藥基因檢測、微生物組學(xué)分析等)、標(biāo)本中微生物與人源核在采用相同的標(biāo)本處理和核酸提取方法時,檢測所需測序數(shù)據(jù)量(以序列為單位)由臨床標(biāo)本中的人源細(xì)胞含量(通常在0.9×106~37×106細(xì)胞數(shù)/ml)和目標(biāo)病原微生物種類及其含量決定[8-10]。臨床標(biāo)本中病診斷的每個標(biāo)本中序列數(shù)要大于1000萬條(10M)[11]。依據(jù)文獻(xiàn)推薦腦脊液(cerebrospinalfluid,CSF)標(biāo)本測序量≥600萬條序列,血液標(biāo)本游離DNA測序量≥2400萬條序列時,靈敏度為48%,而上升至3300萬條序列時,靈敏度升至71%[12-14]。共識2為確保目標(biāo)病原微生物的檢出,單個樣本的mNGS測序數(shù)據(jù)量置可參考《病原宏基因組高通量測序性能確認(rèn)方案》[15]推薦最低數(shù)據(jù)測序后數(shù)據(jù)分析流程應(yīng)包括數(shù)據(jù)清洗、數(shù)據(jù)庫比對(一)數(shù)據(jù)清洗(1)去接頭序列:與建庫試劑所用接頭有關(guān),在分析時應(yīng)——對應(yīng)識別出并去除。(2)單堿基質(zhì)量評價:依據(jù)儀器的質(zhì)量值評價質(zhì)量,Q在28~40為正常區(qū)間,Q≥20且<28為警告區(qū)間,Q<20為錯誤區(qū)間。例如,當(dāng)測序序列的某一位置的錯誤率P=0.01,質(zhì)量值Q=20,那么該位置的堿基就處于警告區(qū)間。(3)低測序質(zhì)量序列過濾的方法:按質(zhì)量值條件去除和按滑動窗口截取,常用軟件有fastp、Trimmomatic等[17]。宜采用低于Q20堿基數(shù)上限不超過總序列長度10%或者滑動窗口平均質(zhì)量值低于Q20堿基區(qū)域截斷的方法。(4)宜去除序列中N堿基占比>2%或>1bp的序列。(5)低復(fù)雜序列包括PolyA序列和其他簡單重序列長度不少于50bp,數(shù)據(jù)有效比對率>70%?;诘谌夹g(shù)的過濾來源于宿主(人類),而mNGS的目標(biāo)核酸是微生物的核酸,因此,在mNGS干實驗過濾宿主基因組的方法是將去除低質(zhì)量后的測序數(shù)據(jù)與宿基因組參考序列數(shù)據(jù)庫應(yīng)包含參考基因組聯(lián)盟人類基因組37(/grc/human/data?asm=GRCh3和/或38(/grc/human/data)以及人線粒體參考基因組(https://www.hmtdb.uniba.it)[17]。為保證宿主基因組數(shù)據(jù)庫的完整性和特異性,宜補(bǔ)充選擇人端粒到端粒基因組(/marbl/CHM13)和標(biāo)準(zhǔn)基因組(https:///search/project/CNPhis0000542)[17]。在與人源基因組比對的過程中,應(yīng)謹(jǐn)慎處理與人類基因組部分比對方法宜使用開源生物信息比對軟件bwa、bwa-mem、bowtie、bowtie2、snap-aligner,可通過比對軟件的參數(shù)設(shè)置篩選比對相似度閾值≥95%的序列[17]。使用第三方軟件時,應(yīng)先對人類基因組標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)測試,并與上述生物信息軟件及參數(shù)對應(yīng)比較,以確定軟件的準(zhǔn)確性。檢標(biāo)本類型、實驗中是否采用去人源核酸技術(shù)來設(shè)定量的理論參考范圍[18]。3.評價宿主基因組序列去除效果的方法:(1)利用模擬對應(yīng)測序長度(SE50,SE75等)的人基因組測序數(shù)據(jù)軟件比對以去除。計算比對上的序列數(shù)與參考品中真實的序列數(shù),并計算兩者的差異。(2)合并人基因組和常見80種病原微生物(應(yīng)包含細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲等主要病原微生物)基因組數(shù)據(jù)[19],再對合并基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行測序數(shù)據(jù)模擬,異度。共識3mNGS去除宿主基因組宜采用bowtie2或者bwa-mem算法去除比對到人參考基因組CHM13、GRCh38的人源序列。軟件,需要采用模擬人基因組數(shù)據(jù)和微生物質(zhì)控數(shù)據(jù)評估。證據(jù)等級B,(二)微生物數(shù)據(jù)庫構(gòu)建響物種注釋的結(jié)果。但目前尚無充分包含人體病原微生物基因組信息(假陰性風(fēng)險)且無注釋錯誤或污染序列的公共數(shù)據(jù)庫(假陽性風(fēng)險),也無經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的或行業(yè)推薦的mNGS分析的參考數(shù)據(jù)庫。因此,構(gòu)建mNGS分析時使用的微生物參考數(shù)據(jù)DrugAdministration,FDA)監(jiān)管級別微生物序列數(shù)據(jù)庫(BioProject231221)中的微生物基因組序列。擴(kuò)大來源宜選用美國國家生物信息中上述公共參考數(shù)據(jù)庫中的微生物基因組可加入自構(gòu)建的微生物基因組數(shù)據(jù)庫,但其可靠性和準(zhǔn)確性應(yīng)經(jīng)嚴(yán)格性能確認(rèn),包括:(1)基因組數(shù)據(jù)應(yīng)來自樣本來源明確、物種信息明確的微生物測序后的組裝數(shù)據(jù);(2)如果與上述公開數(shù)據(jù)庫中的其他不同物種的代表基因組比較,相似度<5%的物種,可考慮為新發(fā)物種基因組;(3)同種微生物應(yīng)優(yōu)先選擇完整性較高的微生物基因組序列作為參考菌株基因組(優(yōu)先級:完成圖>骨架連接序基因組長度、含N堿基比例、污染片段等[18-20]。共識4為充分滿足微生物基因組數(shù)據(jù)庫的完整性,應(yīng)整合多個公共數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)庫,因此,數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建方法及質(zhì)量決庫的完整性、代表性和準(zhǔn)確性。微生物數(shù)據(jù)庫構(gòu)建方法應(yīng)包括:(1)微生物基因組數(shù)據(jù)獲取。在公開數(shù)據(jù)庫下載微生物基數(shù)據(jù)的完整性,通常可通過信息摘要算法5(Message-DigestAlgorithm5,MD5)值的一致性來判斷。(2)基因組數(shù)據(jù)質(zhì)量控制。使用基因組質(zhì)量評估工具,如checkM和QUAST,評估已下載的微生物基因組數(shù)據(jù)的完整性和污染序列,基因組完整性應(yīng)≥95%,污染度應(yīng)≤5%。還需過濾掉去除人源污染序列[18-19]。(3)參考基因組選擇。應(yīng)考慮基因組物種多個基因組進(jìn)行兩兩比對,基因組一致性≥95%則基因組物種分類注釋準(zhǔn)確。(4)同種微生物分類下,具有遺傳多樣性的不同亞型或株的基因組選擇??赏ㄟ^構(gòu)建泛基因組的方法將不同亞型或株的好兼容種內(nèi)多樣性的同時降低計算資源消耗[20]。共識5微生物數(shù)據(jù)庫構(gòu)建應(yīng)全面考慮物種選擇、基因組序列代表性、完病毒),物種內(nèi)的序列多樣性隨時間增加,變異后的物種耐藥表型和毒力行版本控制,應(yīng)采用嚴(yán)格質(zhì)控后的本地化基因每年1次,而特殊和流行病原微生物應(yīng)根據(jù)發(fā)生頻率和流行病學(xué)現(xiàn)狀實時更新[21-22]。每次數(shù)據(jù)庫更新應(yīng)根據(jù)本共識5對數(shù)據(jù)庫進(jìn)行評價。使用本地化服務(wù)器的實驗室,數(shù)據(jù)庫更新和分析(三)物種注釋析方法又可能降低靈敏度[22]。因此,宜采用不同的生物信息算法對測基于宏基因組高通量測序數(shù)據(jù)的微生物物種同分為以下三類。(1)基于K-mers分類算法的物種注釋,常見軟件有Kraken2、centrifuge等。不同k-mersmers分析速度快但特異性低、假陽性率高,較長的k-mers特異性高但增加假陰性和計算時間[23]。(2)經(jīng)典的序列比對,通過將序列比對質(zhì)量[24-25]。隨著微生物基因組的不斷更新和新物種的發(fā)現(xiàn),微生物基因組數(shù)據(jù)庫越來越龐大,分析效率隨之降低、計算資源消耗增加。常注釋結(jié)果的驗證。(3)基于標(biāo)記基因的分類方法,通過預(yù)先構(gòu)建有物種代蓋率的標(biāo)準(zhǔn)化而得到每個物種的相對豐度。其優(yōu)勢相對豐度較低的微生物注釋的假陰性較高。常見軟件有MetaPhlAn4、可采用先快速分類(如k-mer分類),再使用精確比對(如BLAST、Bowtie等)驗證分類結(jié)果的組合方法。這種組合方案融合了快速分類算度[26-27]。而對未被分類到任何物種的剩余序列,可先通過宏基因組組裝軟件如Megahit,進(jìn)行組裝,再將組裝后的序列與參考序列數(shù)據(jù)庫比較[28-29]。物種相對豐度是指該物種序列數(shù)在相應(yīng)大類物種(通常分為細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲4大類)中的分布比例。嚴(yán)格意義講是基于標(biāo)記基因的分類性,可將每百萬序列數(shù)中比對到某一微生物基因組的特異序列數(shù)(readspermillion,RPM)作為歸一化序列數(shù)指標(biāo)。進(jìn)一步,為比較同一樣本文庫中不同微生物的歸一化序列數(shù),可通過計算每百萬序列每1000bp的基因組長度下的歸一化序列數(shù),消除微生物五、數(shù)據(jù)解讀和結(jié)果報告要求實驗室建立mNGS檢測方法需先建立陽性判中各種來源的背景微生物和干實驗分析過程中由于序列錯配所致的假陽性(圖1)。陽性判斷值可基于以下數(shù)據(jù)維度設(shè)定:(1)檢測到的微生物特異的測序序列數(shù)據(jù);(2)標(biāo)準(zhǔn)化的RPM值;(3)覆蓋到相應(yīng)病原基因組上非重疊區(qū)域的序列數(shù)和覆蓋均一性;(4)臨床標(biāo)本中特定病原微生物的序列數(shù)相對于陰性/空白對照標(biāo)本中該微生物序列數(shù)的比值(RPM-r值),有研究將RPM-r=10作為腦脊液mNGS檢測的判斷閾值之一[12]。利用受試者工作特征曲線對具有已知結(jié)果的臨床標(biāo)本訓(xùn)練集進(jìn)差異[12],實驗室應(yīng)對擬檢測標(biāo)本類型及擬報告病原微生物的陽性判斷值并加以驗證[1](圖1)。第一步第一步背景菌過濾序列數(shù)唯一序列數(shù)覆蓋度篩除常見定植菌臨床指征篩選責(zé)任致病第二步絕對致病菌判別置信檢出原始微生物物種譜判別指標(biāo)基于已有的文獻(xiàn),在設(shè)置不同類型病原體陽性判斷值時應(yīng)考慮:(1)樣本水平檢出陽性內(nèi)參;(2)對于細(xì)菌、真菌和寄生蟲,可使用標(biāo)準(zhǔn)化后的序列計量值(如RPM值和RPM-r值)作為陽性判斷值[30]。不同類設(shè)置陽性判斷值,如真菌考慮臨床后期治療[31];(3)對于具有重要臨床意義的特殊病原體,可獨立設(shè)置較低陽性判斷值,如結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群檢測到1條序列即可考慮判斷為陽性[31]。但對于標(biāo)本中某個微生物檢測值處于檢測方法灰區(qū)時,宜用另一種特異性檢測方法如PCR和/或Sanger測序等加以復(fù)核確認(rèn);(4)對于病毒,建議至少應(yīng)覆蓋病毒參考基因組的3個非重疊區(qū)域才能判斷為陽性[32];(5)多個同屬物種檢出時,且都具有臨床意義時,應(yīng)根共識7對于原始微生物物種譜的解讀應(yīng)分為兩步,第一步是對檢出微生物置信度的判別,即判斷該微生物是否在該生物(二)背景微生物庫構(gòu)建源于試劑或?qū)嶒炇噎h(huán)境的背景微生物污染特別是低微生物載量標(biāo)本污染造成的假陽性對mNGS檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要[33]。不同的試劑或批次更換、實驗室內(nèi)人員流動、設(shè)備更微生物的變化[33-34]。因此,測定并明確試劑和實驗室環(huán)境來源的背原宏基因組高通量測序性能確認(rèn)方案》[15],基于統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的濕實驗方法,對多個僅含人源細(xì)胞的無模板陰性對照(notemplatecontrol,NTC)質(zhì)控樣本以及加入環(huán)境采樣后的NTC樣本進(jìn)行宏基因組測序,獲得各樣本中每個微生物的RPM值,并構(gòu)建每個微特征模型的偏差,判斷該物種是否為背景微生物[35]。通常情況下,如某物種RPM數(shù)值符合正態(tài)分布,可采用Z值(Z分?jǐn)?shù))模型識別背景微生物,即Z分?jǐn)?shù)越大說明該菌與背景菌特征差異越大,反之越接近于背胞的NTC標(biāo)本,并與當(dāng)前使用的試劑背景微生物庫進(jìn)行差異比較。如發(fā)現(xiàn)顯著改變,應(yīng)及時對所用試劑和實驗方案進(jìn)共識8通過與陰性質(zhì)控品中的微生物檢出與否和相對豐度比較,構(gòu)建背(三)人體定植微生物生物基線,一旦標(biāo)本物種相對豐度顯著高于基線時致病菌。mNGS檢測報告中的主要挑戰(zhàn)是區(qū)分檢出的微生物是真正的病原微生物還是非致病性微生物,如自然存在的微生態(tài)微生物。這一過程要求報告人員具備扎實的生物學(xué)的知識與經(jīng)驗,以便評估檢出微生物的臨床的mNGS結(jié)果報告標(biāo)準(zhǔn),但可依據(jù)微生物的特異性序列數(shù)、基因組覆蓋微生物與相關(guān)疾病之間的已知因果關(guān)系等因素,制定一套可執(zhí)行的解讀SOP,并持續(xù)驗證與改進(jìn),不斷提高準(zhǔn)確度[21]。對于復(fù)雜或難以判微生物學(xué)、臨床藥學(xué)和生物信息學(xué)等相關(guān)專業(yè)人員參與的多學(xué)科合作團(tuán)結(jié)合患者的臨床情況、影像資料和其他實驗室檢查結(jié)果綜合分析、討論,作出合理的病原學(xué)診斷。對不能保證準(zhǔn)確的檢測結(jié)果(如未驗證的病原體問,可利用BLAST手動核查可能出錯的序列注釋。序列數(shù)越多或相對豐度越高,該物種為病原體的可能性越大(在有菌部位定植物種除外),應(yīng)分別對細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲、特殊病原體(如分枝桿菌、奴卡菌、耶氏肺孢子菌、支原體、衣原體、立克次體等)進(jìn)行分析。序列數(shù)應(yīng)考慮不同物種基因組大小(病毒<細(xì)菌<真菌<寄生蟲)和核酸提取效率的難易程度(病毒<革蘭陰性菌<革蘭陽性菌<真菌<結(jié)核基因部分核酸序列與人類基因序列相似度較3.近源物種相似性的影響:分析時需高度重視近源物種間基因組相似性對結(jié)果的影響,特別是當(dāng)鑒定出的革蘭陰性桿菌數(shù)量多于細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果時,如大腸埃希菌和志賀菌、鏈球菌屬、奈瑟菌屬和芽孢菌屬下的同屬異種菌,須關(guān)注革蘭陰性菌中可移動遺傳元件(質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、原噬菌體、基因島等)的影響。4.病毒基因組結(jié)果的解讀處理:由于RNA病毒變異較快,對基因組覆蓋度較高的病毒基因組,宜采用組裝方法對病毒基因組組裝。檢出病毒株的組裝結(jié)果與同種不同株的病毒基因組進(jìn)行比對分析和進(jìn)化分析,通過進(jìn)化樹對病毒溯源。5.耐藥基因結(jié)果的分析與報告原則:如檢測到耐碳青霉烯類腸桿菌科、產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶腸桿菌科、耐萬古霉素腸球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等常見的多重耐藥菌相關(guān)的耐藥基因時,應(yīng)在報告中注明。由于耐藥基因與臨床實際藥敏結(jié)果并非——對應(yīng),因此,應(yīng)同時做藥敏試驗,最終結(jié)果以藥敏結(jié)果為準(zhǔn)。耐藥基因檢測還可結(jié)合結(jié)構(gòu)域的檢測,用于識別潛在的新型耐藥基因。一旦檢測到耐藥基因需要判斷是來自于染色體還是質(zhì)粒,可使用一些基于機(jī)器學(xué)習(xí)的軟件(如PlasFlow和cBar等)預(yù)測耐藥基因所在的片段重有質(zhì)粒相關(guān)基因以及與已知質(zhì)粒序列的相似程度來判斷耐藥基因所在的片段重疊群是否位于質(zhì)粒(相關(guān)軟件有SCAPP和

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