現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗儀器及實驗技術(shù)

基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)(14周)

基因轉(zhuǎn)移技術(shù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細胞系。

將外源基因轉(zhuǎn)移到受體菌或細胞內(nèi)，在細基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)的分類

胞內(nèi)實現(xiàn)轉(zhuǎn)入基因的擴增或表達的技術(shù)。它是重化學(xué)方法：磷酸鈣沉淀法

組DNA、基因功能研究、基因治療的關(guān)鍵技術(shù)DEAE-葡聚糖

之一1.磷酸鈣沉淀法

目的基因與磷酸鈣等物質(zhì)混合，形成沉淀的

方式：轉(zhuǎn)化感染轉(zhuǎn)染DNA微細顆粒，吸附在細胞膜表面，由細胞內(nèi)

轉(zhuǎn)化(Transformation)：將質(zhì)粒或其它外源DNA吞作用進入到靶細胞的細胞中，并整合到受體細

導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主菌，并使其獲得新的表型胞基因組中，在適當(dāng)條件下得以表達

的過程方法簡單，但轉(zhuǎn)化效率低

感染(Infection):、噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細胞Ca2(PO4)2+DNA-混合微細顆粒

病毒為載體的重組DNA分子，在體外包裝成具2.DEAE-葡聚糖和聚季胺鹽轉(zhuǎn)染法

有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，然后才能感染9DEAE-葡聚糖或聚季胺鹽均可同帶負電的

適當(dāng)?shù)募毎⒃诩毎麅?nèi)擴增DNA分子聚合,形成復(fù)合物，與靶細胞作用而傳

轉(zhuǎn)染(Transfection):是轉(zhuǎn)化和感染兩個詞構(gòu)成的遞進入細胞內(nèi)

新詞，指真核細胞主動攝取或被動導(dǎo)入外源0DEAE-葡聚糖具有促進靶細胞攝取DNA的

DNA片段而獲得新的遺傳表型的過程。如電穿作用

孔、磷酸鈣共沉淀、脂質(zhì)體等物理方法：脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染

電擊轉(zhuǎn)染法

基因敲除(knockoutofgene)：利用基因打基因槍技術(shù)

靶技術(shù)，用無功能的外源基因轉(zhuǎn)入細胞與基因組顯微注射法

中同源序列進行同源重組，把具有功能的同源序1.電穿孔法(electroporotion)

列置換出來，造成功能基因的缺失或失活，這一將細胞置于高壓脈沖電場中，通過瞬間高壓脈沖

技術(shù)叫基因敲除電壓使細胞產(chǎn)生可逆性的穿孔(打孔)，周圍基

基因敲進(knockinofgene)：利用基因同質(zhì)中的外源DNA可滲進細胞，進而表達

源重組，將外源有功能的基因轉(zhuǎn)入基因組中不存電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)原理

在或已失活的細胞中與其基因組中同源序列進電擊轉(zhuǎn)染技術(shù)是利用電轉(zhuǎn)導(dǎo)儀在一定的電壓、脈

行同源重組，在細胞內(nèi)獲得表達，這一技術(shù)稱為沖時間等參數(shù)下，將外源基因?qū)氲郊毎械?/p>

基因敲進一種有效方法。它是將細胞置于脈沖電場中，瞬

統(tǒng)稱為基因打靶技術(shù)(Genetargeting)間高壓脈沖，這就有可能可逆性地在細胞膜上打

出微孔(打孔)

常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類：具有操作簡單，耗時少，節(jié)省成本等優(yōu)點，但對

瞬時轉(zhuǎn)染：外源DNA/RNA不整合到宿主染色體細胞的損傷較大，對電壓非常敏感，所以需要有

中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)一個合適的電壓，既能使外源基因?qū)胗?/p>

生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟盡可能讓最少量細胞受損傷

動子和其它調(diào)控元件的分析影響電擊轉(zhuǎn)染的因素：

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染：也稱永久轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整脈沖電壓：最適電壓約在200伏左右

合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體電導(dǎo)電路的電容：電壓脈沖等于電容量和緩沖液

(episome)存在。外源DNA整合到染色體中概電阻的乘積。

率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細胞能整合，通常需要緩沖液的鹽度：高鹽度減小了電場的阻力，導(dǎo)致

通過一些選擇性標記，新霉素抗性基因，潮霉素電脈沖的作用時間變短，產(chǎn)生的膜孔直徑變小

B磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPH),胸昔激酶(TK)等反復(fù)DNA濃度：DNA濃度上升，轉(zhuǎn)導(dǎo)率上升

細胞數(shù)量：合適電壓與細胞的大小成反比然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組、缺

溫度失、復(fù)制或易位等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的

2.脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染染色體內(nèi)

脂質(zhì)體是由雙分子層組成的閉合囊泡，通過細胞體外利用打靶載體對ES細胞進行基因敲除或敲

的內(nèi)吞或吞噬作用，將所攜帶的目的基因?qū)肴?，再將ES細胞顯微注射入囊胚中，移植宿主

細胞中顯微注射法轉(zhuǎn)外源基因沒有長度上

脂質(zhì)復(fù)合體沒有免疫原性，組織毒性較小，而且的限制，目前已證明數(shù)百kb之DNA片段均可以

轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體也易于制備，因此脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染已成成功產(chǎn)制出轉(zhuǎn)基因動物。其缺點是設(shè)備精密而昂

為現(xiàn)今用于基因轉(zhuǎn)移的最常用方法貴、操作技術(shù)需要長時間的練習(xí)，以及每次只能

陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的原理注射有限的細胞。

將DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，然后經(jīng)脂4.“基因槍”技術(shù)

質(zhì)體與細胞膜的融合或者細胞的內(nèi)吞作用導(dǎo)入“基因槍”技術(shù)又稱：

陽離子脂質(zhì)體的表面帶有正電荷，其介導(dǎo)的粒子轟擊(particlebombardment),

轉(zhuǎn)染是基于和陽離子脂質(zhì)體之間的離子相互作高速粒子噴射技術(shù)(High-velocity

用,DNA通過形成一個脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物再被particlemicroprojection)

細胞捕獲并最后表達or基因槍轟擊技術(shù)(genegunbombardment)

脂質(zhì)體復(fù)合物進入細胞的方式美國Cornel大學(xué)生物化學(xué)系John.C.Santord等

吸附1983年研究成功，1987年應(yīng)用

細胞內(nèi)吞作用介導(dǎo)的融合基因槍根據(jù)動力系統(tǒng)可分為火藥引爆、高壓放電

直接與細胞質(zhì)膜融合和壓縮氣體驅(qū)動三類。其基本原理是通過動力系

兩個關(guān)鍵性特點使得Lipofectamine2000的轉(zhuǎn)染統(tǒng)將帶有基因的金屬顆粒(金?；蜾X粒)，將

步驟快速簡便DNA吸附在表面，以一定的速度射進植物細胞

?DNA-陽離子脂質(zhì)體試劑的復(fù)合體可以直接加(細胞、組織或器官)，由于小顆粒穿透力強，

入到細胞培養(yǎng)基中故不需除去細胞壁和細胞膜而進入基因組，實現(xiàn)

今轉(zhuǎn)染后不需要除去Lipofectamine2000試劑。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的

對于96孔板培養(yǎng)，不再需要提前一天進行細胞已在煙草、水稻、小麥、黑麥草、廿蔗、棉花、

鋪板，而可以直接在平板中制備復(fù)合物，然后將大豆、菜豆、洋蔥、番木瓜、甜橙、葡萄等多種

細胞懸浮液加入到復(fù)合物就可以了，這樣進一步作物上成功；初步應(yīng)用：基因治療和抗體制備

減少了轉(zhuǎn)染時間基因槍法(Biolistic-bombardment)：多用于植物細

陽離子脂質(zhì)體試劑轉(zhuǎn)染注意事項胞或體內(nèi)直接轉(zhuǎn)導(dǎo)

有血清時的轉(zhuǎn)染在開始準備DNA和陽離子脂生物學(xué)方法：逆轉(zhuǎn)錄病毒感染

質(zhì)體試劑稀釋液時要使用無血清的培養(yǎng)基，因為腺病毒感染

血清會影響復(fù)合物的形成慢病毒感染

培養(yǎng)基中的抗生素抗生素一般對于真核細胞無是通過病毒為載體(vector),將外源基因通過重

毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細胞的通透性，組技術(shù)與病毒重組，然后去感染受體細胞

使抗生素可以進入細胞。降低了細胞的活性，導(dǎo)目前最常用的病毒載體有：逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、

致轉(zhuǎn)染效率低慢病毒等

脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染與電穿孔技術(shù)合用用作載體的“病毒”都是經(jīng)過人工改造的假病毒，

如果將脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物與電穿孔技術(shù)聯(lián)用,需要在體外包裝成具有感染性的完整病毒顆粒，

將有助于提高基因傳遞的靶向性和腫瘤部位的才可感染宿主細胞

基因攝取量病毒感染細胞后，其基因組RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄

3.顯微注射法(microinjection)產(chǎn)生雙鏈DNA拷貝，插入宿主染色體形成前病

顯微注射法(microinjection)是利用管尖極毒(provirus),前病毒轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的正鏈既是病毒

細(0.1至0.5um)的玻璃微量注射針，將外源RNA,再與前病毒編碼的外殼蛋白包裝成新的病

基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細胞中，毒顆粒

完整的病毒顆粒具有插入宿主染色體必需的陽離子脂質(zhì)體通過電荷的相互作用與細胞吸附VV

全套酶系統(tǒng)，適用于介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移磷酸鈣共沉淀共沉淀、細胞的吞噬作用

電穿孔膜上打孔的形式

目前應(yīng)用最多的最成功的是逆轉(zhuǎn)錄病毒

DEAE-葡聚糖通過電荷的相互作用與細胞吸附V

(retrovirus)

聚季鍍鹽通過電荷的相互作用與細胞吸附

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體優(yōu)點

基因槍技術(shù)膜穿刺VV

①高效感染宿主細胞，轉(zhuǎn)染率可達100%

②病毒基因和所載的外源基因都可能表達細胞核直接微注膜穿刺V

③宿主范圍廣，可同時感染大量細胞并長期存射

留

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體缺點

①病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右

片段

②病毒隨機插入靶細胞基因組中，因病毒

具有強大的啟動子和增強子，能使插入點附近的

基因過度表達或失活，插入外源基因可能不適當(dāng)

的表達

③逆轉(zhuǎn)錄病毒有潛在致病性，使受體細胞

癌變

根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒的缺點，人們有目的地將其

改造，保留其優(yōu)點，除去癌基因和病毒基因，?；蜣D(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

留ETR和W包裝信號研究基因功能

轉(zhuǎn)基因動(植)物的制備

各轉(zhuǎn)染方法與細胞相互作用的機制以及它們傳疾病的基因治療

遞分子的類型基因工程藥物的生產(chǎn)

轉(zhuǎn)染的方法與細胞相互作用的機制傳遨、靜野1和壞境凈化

DNA|RNA寡核甘酸|蛋白質(zhì)

轉(zhuǎn)染方法瓦理應(yīng)用特點

相時簡便、結(jié)果可重復(fù)

DEAE-右旋糖昔帶正電的DEAE-右旋糖昔與懶帶負電的蟋瞬根轉(zhuǎn)染但沛細胞有一定的毒聊用

法骨架相互慨形雌復(fù)合物被細胞內(nèi)吞

轉(zhuǎn)染腌^血清

不適用于原代細胞

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

賺的去鼾簡便但轂性差

磷酸鉆DNA復(fù)合物吸附細胞膜被細胞內(nèi)吞牌機轉(zhuǎn)染

有些細胞不適用

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染適用性廣但細胞致死藕，耐細胞用量

麟孔法

高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形瞬時的染大，需根據(jù)不同細胞類型優(yōu)化電算孔實驗條

成的小孔導(dǎo)入

所有細胞件

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染適用性廣轉(zhuǎn)染效率氤

陽離子性的脂質(zhì)帶正電的螭體與陵帶負電的廉基團形成

的性轉(zhuǎn)染重復(fù)性好但轉(zhuǎn)染時嬲血情

體法復(fù)合物被細胞內(nèi)吞

所有細胞轉(zhuǎn)染效期細胞類型變化大

可用于難轉(zhuǎn)染的細胞,原代細胞，體內(nèi)細胞

逆轉(zhuǎn)等

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

家病但攜帶基因不能太大

特定宿主細胞

痛毒介導(dǎo)毒通過侵染宿主細胞將外源基因整合到染色體細胞覷鐮期

4°需考慮安全因素

腺疥瞬時轉(zhuǎn)染可用于難轉(zhuǎn)染的細胞

毒特定宿主細胞需考慮安全因素

主要內(nèi)容：的基因組。

I基因組、基因2、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是單順反子

II核酸即一個結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄、翻譯成一個mRNA分

III核酸的結(jié)構(gòu)與功能子，一條多肽鏈。

w核酸酶與限制性核酸內(nèi)切酶3、存在大量重復(fù)序列

VDNA序列分析（DNA一級結(jié)構(gòu)測定）即在整個DNA中有許多重復(fù)出現(xiàn)的核甘酸

VI基因組序列解析順序，重復(fù)序列長度可長可短，短的僅含2個

VII基因組序列解析舉例核苜酸，長的多達數(shù)百、乃至上千。重復(fù)頻率也

VIDRNA測序不盡相同。

高度重復(fù)序列：

I基因組、基因長度：幾個?幾千個bp；拷貝數(shù)：幾百個?

基因組就是一個物種中所有基因的整體組上百萬個首尾相連，串聯(lián)排列，集中分布于染色

成。體的特定區(qū)段（如端粒，著絲粒等），也稱衛(wèi)星

任何一條染色體上都帶有許多基因，一條高DNA。序列中G-C含量高于DNA的其它結(jié)構(gòu)。

等生物的染色體上可能帶有成千上萬個基因，-中度重復(fù)序列：

個細胞中的全部基因序列及其間隔序列統(tǒng)稱為一般分散于整個基因組中；長度和拷貝數(shù)差

基因組（genomes）。別很大。rRNA、tRNA、組蛋白等的基因，大多

基因組有兩層意義：遺傳物質(zhì)和遺傳信息。為中度重復(fù)序列。在中度重復(fù)序列中，有一類可

要揭開生命的奧秘，就需要從整體水平研究移動的片段，稱為逆轉(zhuǎn)座子。

基因的存在、基因的結(jié)構(gòu)與功能、基因之間的相單拷貝或低度重復(fù)序列：

互關(guān)系。在整個基因組中只出現(xiàn)一次或很少幾次的核

各物種基因組特點：甘酸序列。在真核細胞中，除組蛋白以外，其它

病毒基因組結(jié)構(gòu)特點所有蛋白質(zhì)都是由DNA中這種單拷貝序列決定

1、基因組相對較小且大小相差較大。的。該序列大小不等，每一個順序決定一個蛋白

2、不同病毒只含一種不同結(jié)構(gòu)核酸。質(zhì)的結(jié)構(gòu)，稱之為結(jié)構(gòu)基因。動物中約占50%；

3、由連續(xù)的或不連續(xù)的多核苜酸鏈組成。植物中約占20%,因此所含信息量最大。在人基

4、基因重疊（包含型、交叉型）。因組中占約60?65%。

5、大部分用來編碼蛋白質(zhì)（相關(guān)基因簇、單4、有很多不編碼區(qū)域

倍體基因組、與寄主基因組結(jié)構(gòu)特征相似）。5、基因是不連續(xù)的

細菌基因組結(jié)構(gòu)特點在真核生物結(jié)構(gòu)基因的內(nèi)部存在許多不編碼

1、染色體基因組通常只由一條環(huán)狀雙鏈DNA蛋白質(zhì)的間隔序列（interveningsequences）,稱為

組成。內(nèi)含子（intron）,編碼區(qū)則稱為外顯子（exon）。內(nèi)

2、具有操縱子結(jié)構(gòu)。含子與外顯子相間排列，轉(zhuǎn)錄時一起被轉(zhuǎn)錄下

3、重復(fù)序列少。來，然后RNA中的內(nèi)含子被切掉，外顯子連接

4、內(nèi)含子所占比例小。在一起成為成熟的mRNA,作為指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成

5、具有編碼同工酶的同基因。的模板。

6、基因不重會。6、具有多個復(fù)制起點

7、具有多種功能的識別區(qū)域。

8、在基因或操縱子序列末端具有特殊終止序列?；?/p>

真核生物基因組結(jié)構(gòu)特點DNA上具有特定功能的一個片斷，負責(zé)一種

1、體細胞的基因組是雙份的特定性狀的表達。一般來講，一個基因只編碼一

真核生物基因組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染個蛋白質(zhì)。

色體，儲存于細胞核內(nèi)，除配子細胞外，體細胞是遺傳信息的物理和功能單位，包含產(chǎn)生一

內(nèi)的基因組是雙份的（即雙倍體），即有兩份同源條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核甘酸序

列。核酸類物質(zhì)RNA的重要功能：

基因分類：二、核酸的化學(xué)組成及其基本結(jié)構(gòu)單位核甘酸

編碼RNA的基因，如rRNA、snRNA基因等。元素組成：C、H、0、N、P

編碼蛋白質(zhì)的基因。P元素的含量較多并且恒定，約占9?11%。因

此可通過定磷法測定核酸含量。

DNA：兩條互補鏈。由ATCG4個堿基形成的堿基（噪聆或喀嚏）、戊糖（核糖或脫氧核糖）和磷

字符串。酸是核酸（DNA、RNA）的基本構(gòu)件分子。

RNA：單鏈結(jié)構(gòu)。由AUCG4個堿基形成的核苜酸是核酸的基本組成單位。

字符串。

蛋白質(zhì)：一條或多條肽鏈。每個肽鏈是由20種III核酸的結(jié)構(gòu)與功能

氨基酸形成的長鏈，即20個字母形成的字符一、核酸的一級結(jié)構(gòu)

串。核酸中核甘酸的連接方式

翻譯：每3個堿基翻譯成一個氨基酸。核甘酸通過3',5'-磷酸二酯鍵連接起

來，以磷酸-糖-磷酸-糖...形成核酸骨架

n核酸核酸的表示方式

一、核酸的概念和重要性若不特別注明，核酸的表示方式一般規(guī)定從5'

DNA是主要遺傳物質(zhì)：存在細胞核（95%）和端書寫至3'端

線粒體、葉綠體（5%）中DNA、RNA的一級結(jié)構(gòu)

RNA的功能多樣性：存在胞質(zhì)（90%）和細胞核酸的一級結(jié)構(gòu)是核酸中各核甘酸通過

核（10%）中3',5'磷酸二酯鍵連接而成的無分支的多核背

酸鏈。即核甘酸排列順序。

核酸的概念：核酸是酸性的大分子物質(zhì)，在活細

胞中與堿性蛋白結(jié)合，以核蛋白形式存在。二、DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)

核酸分為脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)特征

（RNA）兩類，DNA所含核甘酸分子數(shù)比RNA大（1）DNA分子由兩條反向平行的多聚脫氧核普

得多。酸鏈（簡稱DNA單鏈）組成。兩條鏈沿著同一根

DNA為線性、雙螺旋分子或閉合環(huán)狀分子。軸平行盤繞，形成右手雙螺旋結(jié)構(gòu)。螺旋中的兩

RNA分為三個類型，即核蛋白體RNA（rRNA,條鏈方向相反，即其中一條鏈的方向為5'-

占總RNA80%）、《t（!RNA（mRNA,i%、RNA5%）3',而另一條鏈的方向為3'-5'。

和轉(zhuǎn)移RNA（tRNA,占總RNA15%）。（2）嗯吟堿和喀咤堿基位于螺旋的內(nèi)側(cè)，磷酸

和脫氧核糖基位于螺旋外側(cè)。堿基環(huán)平面與螺旋

軸垂直，糖基環(huán)平面與堿基環(huán)平面成90。角。

（3）螺旋橫截面的直徑約為2nm,每條鏈相鄰

脫氧核糖核酸和核糖核酸異同的對比兩個堿基平面之間的距離為0.34nm,每10個

核甘酸對形成一個螺旋，其螺矩（即螺旋旋轉(zhuǎn)一

核酸重要性：圈）高度為3.4nm。

DNA是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，負責(zé)遺傳信息的貯存（4）雙螺旋的力是鏈間的堿基對所形成的氫鍵。

和發(fā)布，遺傳基因就是DNA鏈上的若干核甘酸堿基的相互結(jié)合具有嚴格的配對規(guī)律，A-T,G-C

所組成的片段。結(jié)合，這種配對關(guān)系，稱為堿基互補。AT間形

RNA負責(zé)遺傳信息的表達，直接參與蛋白質(zhì)生成兩個氫鍵，GC間三個氫鍵。在DNA分子

物合成，轉(zhuǎn)錄DNA所發(fā)布的遺傳信息，并將之中，喋吟堿基的總數(shù)與喀咤堿基的總數(shù)相等。

翻譯給蛋白質(zhì)，使生命機體的生長、發(fā)育、繁殖⑸沿中心軸觀察，雙螺旋結(jié)構(gòu)上有兩條螺形凹

和遺傳得以繼續(xù)進行。槽，一條較深寬，稱為大溝（寬1.2nm,深

0.85nm）；另一條淺窄,稱為小溝（寬0.6nm,

深0.75nm)。超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix或supercoil)

大溝暴露出噪吟的C6N7和喀嚏C4C5及DNA雙螺旋鏈扭曲或再盤繞所形成空間結(jié)

其取代基團；小溝一側(cè)暴露出瞟吟C2和啥咤構(gòu)。

C2及其取代基團。大溝與小溝對于DNA與蛋正超螺旋(positivesupercoil)

白質(zhì)的相互識別極其重要。DNA雙螺旋鏈盤繞過多時所形成的超螺旋。

負超螺旋(negativesupercoil)

DNA二級結(jié)構(gòu)的多態(tài)性DNA雙螺旋鏈盤繞不足時所形成的超螺旋。

DNA二級結(jié)構(gòu)的多態(tài)性，是指DNA不僅具意義

有多種形式的雙螺旋結(jié)構(gòu)，而且還能形成三鏈等DNA超螺旋結(jié)構(gòu)整體或局部的拓撲學(xué)變化

其它結(jié)構(gòu)，說明DNA的結(jié)構(gòu)是動態(tài)的，而不是及其調(diào)控對于DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄過程具有

靜態(tài)的。關(guān)鍵作用。

核酸的構(gòu)型的多樣性是由于核酸主干鏈上

各鍵和堿基的旋轉(zhuǎn)造成的，是特定的堿基序列導(dǎo)原核生物DNA的三級結(jié)構(gòu)

致的結(jié)果。絕大多數(shù)原核生物DNA都是共價封閉的環(huán)

B-DNA螺旋狀雙螺旋。如果再進一步盤繞則形成麻花狀的超

DNA在92%相對濕度的鈉鹽中的構(gòu)型，是細螺旋三級結(jié)構(gòu)。

胞正常狀態(tài)下DNA存在的主要構(gòu)型。真核生物中的核小體結(jié)構(gòu)

A-DNA螺旋在真核生物中，雙螺旋的DNA分子圍繞一蛋

DNA在75%相對濕度的鈉鹽中的構(gòu)型。白質(zhì)八聚體進行盤繞，從而形成特殊的串珠狀結(jié)

C-DNA螺旋構(gòu)，稱為核小體。

DNA在66%相對濕度的鋰鹽中的構(gòu)型。核小體結(jié)構(gòu)屬于DNA的三級結(jié)構(gòu)。

Z-DNA螺旋核小體由DNA和組蛋白構(gòu)成。組蛋白有5

左手的DNA螺旋，這種螺旋可能在基因表種，HLH2A,H2B、H3、H4各兩分子構(gòu)成一

達或遺傳重組中起作用。個八聚體，其外再由雙螺旋DNA繞其旋轉(zhuǎn)1.75

圈(為DNA的三級結(jié)構(gòu))，約含140bp,稱為核

三、DNA的三級結(jié)構(gòu)小體的核心顆粒(coreparticle),兩個核心顆粒之

DNA的三級結(jié)構(gòu)是指DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)通間由一段雙螺旋DNA鏈(約60bp)相連，稱為連

過進一步扭曲和折疊所形成的更加復(fù)雜的構(gòu)象,接部。組蛋白H1結(jié)合在此部位。若干個核小體

超螺旋是三級結(jié)構(gòu)的主要形式。再螺旋形成核小體纖維，再進一步螺旋化形成染

自從1965年Vinograd等人發(fā)現(xiàn)多瘤病毒的色體。從雙螺旋DNA到染色體，DNA總共壓縮

環(huán)形DNA的超螺旋以來，現(xiàn)已知道絕大多數(shù)原了約8000?10000倍.

核生物都是共價封閉環(huán)(covalentlyclosed四、特殊的DNA結(jié)構(gòu)

circle,CCC)分子，這種雙螺旋環(huán)狀分子再度螺旋

化成為超螺旋結(jié)構(gòu)(superhelix或supercoil)o五、DNA的功能

有些單鏈環(huán)形染色體(如d>x174)或雙鏈線形染色DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信

體(如人噬菌體)，在其生活周期的某一階段，將息，并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺

其染色體變?yōu)槌菪问?。對于真核生物來說，傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個體生命活動的信息基礎(chǔ)。

雖然其染色體多為線形分子，但其DNA均與蛋基因從結(jié)構(gòu)上定義，是指DNA分子中的特定區(qū)

白質(zhì)相結(jié)合，兩個結(jié)合點之間的DNA形成一個段，其中的核甘酸排列順序決定了基因的功能。

突環(huán)(loop)結(jié)構(gòu)，類似于CCC分子，同樣具有超

螺旋形式。六、RNA的結(jié)構(gòu)與功能

超螺旋按其方向分為正超螺旋和負超螺旋兩種。RNA的主要種類與功能

真核生物中，DNA與組蛋白八聚體形成核小體RNA是單股核酸分子，多核甘酸鏈自身折

結(jié)構(gòu)時，存在著負超螺旋。研究發(fā)現(xiàn)，所有的疊、纏繞，以堿基互補配對原則，在許多區(qū)域形

DNA超螺旋都是由DNA拓撲異構(gòu)酶產(chǎn)生的。成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其二級結(jié)構(gòu)中有許多修飾堿基。

真核細胞mRNA的結(jié)構(gòu)特點結(jié)構(gòu)。

真核生物mRNA的前體是核不均-RNA經(jīng)過切tRNA的“三葉草”形結(jié)構(gòu)包括：氨基酸臂、DHU

除內(nèi)含子、拼接外顯子的加工，形成成熟的臂與環(huán)、反密碼臂與環(huán)、可變環(huán)和TWC臂與環(huán)

mRNAo五部分。

大多數(shù)真核mRNA的5'末端均在轉(zhuǎn)錄后加上一(1)氨基酸接受區(qū)

個7-甲基鳥昔，同時第一個核甘酸的C2也是包含有tRNA的3'-末端和5'-末端，3'-

甲基化，形成帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppNm-o末端的最后3個核甘酸殘基都是CCA,A為核

大多數(shù)真核細胞mRNA在3'-末端有一段長約甘。氨基酸可與其成酯，該區(qū)在蛋白質(zhì)合成中起

20?200核甘酸的polyAopolyA是在轉(zhuǎn)錄后經(jīng)攜帶氨基酸的作用。

polyA聚合酶的作用而添加上去的。(2)反密碼區(qū)

5'-cap的功能與氨基酸接受區(qū)相對的一般含有7個核甘酸殘

防止mRNA被核酸酶降解?；膮^(qū)域，其中正中的3個核甘酸殘基稱為反密

為mRNA翻譯活性所必需。碼

與蛋白質(zhì)合成的正確起始有關(guān)。(3)二氫尿喀嚏區(qū)

polyA的功能該區(qū)含有二氫尿口密噓。

保護mRNA,免受核酸外切酶的作用。(4)T^C區(qū)

與翻譯有關(guān)，沒有polyA翻譯活性降低。該區(qū)與二氫尿喀嗟區(qū)相對，假尿嗑噬核苜一

與mRNA從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)有關(guān)。胸腺喀嗟核糖核背環(huán)(TwC)由7個核甘酸組成，

通過由5對堿基組成的雙螺旋區(qū)(TwC臂)與

mRNA的功能tRNA的其余部分相連。除個別例外，幾乎所有

把DNA所攜帶的遺傳信息，以密碼子的形式，IBNA在此環(huán)中都含有TwC。

按堿基互補配對原則，抄錄并傳送至核糖體，m(5)可變區(qū)

以決定其合成蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序。位于反密碼區(qū)與TwC區(qū)之間，不同的tRNA

mRNA分子中帶有遺傳密碼，其功能是為蛋白質(zhì)該區(qū)變化較大。

的合成提供模板。

mRNA分子中每三個相鄰的核甘酸組成一組，tRNA二級結(jié)構(gòu)的特殊情況

在蛋白質(zhì)翻譯合成時代表一個特定的氨基酸，這1980年牛心線粒體tRNAser只有63個核苜酸，

種核甘酸三聯(lián)體稱為遺傳密碼(coden)沉降常數(shù)3S,缺少D環(huán)和D臂，呈二葉草型。

近年來發(fā)現(xiàn)2種線蟲線粒體tRNA也不是標準的

轉(zhuǎn)移RNA的結(jié)構(gòu)與功能三葉草結(jié)構(gòu)。

tRNA一級結(jié)構(gòu)的特點tRNA的三級結(jié)構(gòu)

Mr較小(Mr25000),沉降常數(shù)為4S。tRNA的三級結(jié)構(gòu)為倒L型。反密碼子環(huán)和

各種tRNA的鏈長很接近，一般含73~93個核氨基酸臂兩個功能區(qū)位于倒L型的兩個端點，二

甘酸。氫尿喀咤區(qū)和TwC區(qū)構(gòu)成倒L型的拐角。

tRNA是保守性最強的RNA,分子中約20多個在tRNA二級結(jié)構(gòu)中未配對的某些并不互補的堿

位置上的核甘酸是不變和半不變的?；鶇⑴c了三級結(jié)構(gòu)中特殊的氫鍵作用，tRNA鏈

各種tRNA的3'端為CCA；5'端大多數(shù)為pG,中的核糖-磷酸骨架與某些堿基甚至其他的骨架

少數(shù)為pC?之間也能產(chǎn)生作用。

tRNA分子中含有較多的修飾成分，達

10%-20%。tRNA的主要功能

tRNA的作用是多方面的，它通過高度專一的氨

tRNA二級結(jié)構(gòu)特點酰-tRNA合成酶識別、活化、攜帶相應(yīng)的氨基酸，

tRNA是單鏈核酸，但其分子中的某些局部也可將氨基酸轉(zhuǎn)運到核糖體上，識別mRNA上相應(yīng)

形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。tRNA的二級結(jié)構(gòu)由于局部雙的密碼子，按照mRNA上的密碼順序，將相應(yīng)

螺旋的形成而呈現(xiàn)“三葉草”形，故稱為“三葉草”的氨基酸裝配到蛋白質(zhì)的特定位點。

所有的tRNA折疊后形成大小相似及三維構(gòu)象相限制性核酸內(nèi)切酶來自于細菌，主要降解非

似的三級結(jié)構(gòu)，這有利于攜帶氨基酸的tRNA進細菌體內(nèi)的外源未經(jīng)特殊修飾的雙鏈DNA,對

入核糖體的特定部位。自身起保護作用。它識別及切割的位點常具有回

文結(jié)構(gòu)。

核糖體RNA的結(jié)構(gòu)與功能限制性內(nèi)切酶的特征

rRNA是細胞中含量最多的RNA,占總量的具有嚴格的堿基專一性，有專一的識別順序、切

80%。rRNA的主要功能是與蛋白質(zhì)一起構(gòu)成核點。

蛋白體，作為蛋白質(zhì)生物合成的場所。產(chǎn)物具粘性未端或平整末端。

許多rRNA的級結(jié)構(gòu)及由一級結(jié)構(gòu)推導(dǎo)粘性末端-指切割產(chǎn)物片段兩端突出的單鏈

出來的二級結(jié)構(gòu)都已闡明，但是對許多rRNA的具有互補序列。

功能迄今仍不十分清楚。

限制性內(nèi)切酶的命名

其他小分子RNA

細胞的不同部位存在著許多其他種類的小分子限制性核酸內(nèi)切酶的類型

RNA,如:I型

核內(nèi)小RNA(snRNA)催化反應(yīng)需要ATP,同時具有限制酶和甲基

核仁小RNA(snoRNA)化酶兩種活性，切點距識別序列約lOOObp。

胞質(zhì)小RNA(scRNA)H型

催化性小RNA(ribozyme)反應(yīng)不需要ATP,在所識別的特殊核甘酸序

小片段干涉RNA(micRNA)列內(nèi)或附近切割DNA鏈，通常識別位點是由4

IV核酸酶與限制性核酸內(nèi)切酶或6核甘酸組成的回文結(jié)構(gòu)。酶分子本身由兩個

一、核酸酶的分類完全一致的亞基組成，分子量小于80ku,Mg2+

按底物專一性：是唯一的輔助因子。

核糖核酸酶(RNase)和脫氧核糖核酸酶是目前被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的一類酶。

(DNase)III型

按作用方式：反應(yīng)需要ATP,同時具有限制酶和甲基化酶

核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶兩種活性，切點距識別序列約10-25bp。

按磷酸二酯鍵斷裂的方式：

水解3'-OH與磷酸之間的酯鍵，產(chǎn)物為5'VDNA序列分析(DNA一級結(jié)構(gòu)測定)

-核甘酸；水解5'-OH與磷酸之間的酯鍵，產(chǎn)物測序:確定一條染色體/DNA片斷上的堿基順序。

3'-核昔酸。序列測定技術(shù)：

其它：如雙鏈酶、單鏈酶等經(jīng)典方法：

英國Sanger：1975年加減法-Sanger雙脫

二、核酸酶的功能氧鏈終止法(Sanger,1977)

生物體內(nèi)的核酸酶負責(zé)細胞內(nèi)、外催化核酸的降美國Maxam-Gilbert：DNA化學(xué)降解法/

解；化學(xué)斷裂法(Maxam&Gilbert,1977)

參與DNA的合成與修復(fù)及RNA合成后的剪接新技術(shù)方法：

等重要；雜交測序法

基因復(fù)制和基因表達過程負責(zé)清除多余的、結(jié)構(gòu)質(zhì)譜法

和功能異常的核酸，同時也可以清除侵入細胞的單分子測序法

外源性核酸：原子探針顯微鏡測序法

在消化液中降解食物中的核酸以利吸收；流式細胞儀測序法

體外重組DNA技術(shù)中的重要工具酶。大規(guī)模平行實測法

DNA芯片法

三、限制性核酸內(nèi)切酶

一、Sanger雙脫氧鏈終止法（末端終止法、酶堿基處發(fā)生斷裂。

法）喀咤：腓與哌嚏配合使用，在喀咤堿基處發(fā)

在模板指導(dǎo)下，DNA聚合酶不斷將dNTP加生斷裂。

到引物的3'-0H末端，使引物延長，合成出新3.凝膠電泳分離，放射自顯影檢測。

的互補的DNA鏈，如果加入雙脫氧三磷酸核甘

（ddNTP）,由于雙脫氧核糖的3'位置上缺少一個三、雜交法（Sequencingbyhybridization,SBH）

羥基，故不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，用特定長度的具有所有可能堿基序列的寡

即形成一種全部具有相同5'-引物端和以核甘酸探針與未知序列的DNA片段雜交。根據(jù)

ddNMP殘基為3'端結(jié)尾的一系列長短不一片某些探針形成的完全雙鏈，推知目的DNA的堿

段的混合物。由于雙脫氧核甘酸在每個DNA分基序列。

子中摻入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳

區(qū)分長度差一個核甘酸單鏈DNA,從而讀取四、DNA芯片測序

DNA核甘酸序列。將各種排列順序的寡核甘酸點播在芯片上，

1.模板與引物雜交。每個點播的寡核甘酸在排列的方陣中都有指定

加入相同的單鏈DNA模板、引物、4種dNTP的位置。待檢測的DNA分子與芯片溫浴，凡是

及DNA聚合酶。合成新的互補DNA鏈。能雜交的寡核甘酸都會在確定位置發(fā)出信號，然

2.引物的延長和合成阻斷后根據(jù)獲取的信息將寡核背酸的順序進行對比

平行進行四組反應(yīng)，每組試管分別加入DNA組裝，拼接成完全的DNA順序。

聚合酶、dNTP、標記底物/標記引物。

每組另外再分別加入一定比例的2',3'五、自動化測序

-ddNTP（如ddA、ddG、ddC、ddT）,使反應(yīng)隨與鏈終止法測序原理相同，只是用不同的熒

機終止于ddNTP處。光色彩標記ddNTP,如ddATP標記紅色熒光，

3.任意選取一種脫氧核苜酸為同位素標記物，便ddCTP標記藍色熒光，ddGTP標記黃色熒光，

于檢測。ddTTP標記綠色熒光。由于每種ddNTP帶有各

4.加熱