3.2基因工程的基本操作程序++課件高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第三章第二節(jié)

基因工程的基本操作程序一、目的基因的篩選與獲取從社會中來1997年，我國政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲棉。到2015年，我國已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲棉新品種100多個，減少農(nóng)藥使用量40萬噸，增收節(jié)支社會經(jīng)濟效益450億元。問題：你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的機制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要那些步驟？3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞蘇云金桿菌與載體拼接

普通棉花（無抗蟲特性）

棉花細(xì)胞抗蟲棉提取表達(dá)Bt基因?qū)隑t基因重組DNA分子1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建4.目的基因的檢測與鑒定原核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)示意圖真核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)示意圖目的基因的篩選與獲取原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼1.基因的結(jié)構(gòu)編碼區(qū)：編碼蛋白質(zhì)的合成非編碼區(qū)：不能編碼蛋白質(zhì)，調(diào)控遺傳信息的表達(dá)包括：編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游原核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)示意圖真核細(xì)胞基因的結(jié)構(gòu)示意圖目的基因的篩選與獲取1.基因的結(jié)構(gòu)啟動子：RNA聚合酶結(jié)合位點，

轉(zhuǎn)錄起始的信號終止子：終止RNA的合成外顯子：內(nèi)含子：能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列非編碼序列=非編碼區(qū)+內(nèi)含子

真核細(xì)胞與原核細(xì)胞中基因表達(dá)過程示意圖

【思考1】：如果把一個真核生物的基因?qū)朐思?xì)胞中表達(dá)，一定會產(chǎn)生原來的蛋白質(zhì)嗎？成熟mRNA相應(yīng)酶去除內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄翻譯真核基因：編碼區(qū)（外顯子+內(nèi)含子）多肽鏈前體mRNA蛋白質(zhì)加工一般不能產(chǎn)生原來的蛋白質(zhì)①原核生物細(xì)胞里沒有相應(yīng)的酶來去除內(nèi)含子；②原核生物沒有真核的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等）目的基因的篩選與獲取【思考2】:如果把真核基因?qū)朐思?xì)胞中表達(dá)，不考慮蛋白質(zhì)加工的問題，如何產(chǎn)生與原來結(jié)構(gòu)相同的蛋白質(zhì)？去除內(nèi)含子成熟mRNA轉(zhuǎn)錄真核基因：編碼區(qū)（外顯子+內(nèi)含子）前體mRNA相應(yīng)酶mRNA單鏈提取逆轉(zhuǎn)錄酶DNA單鏈DNA雙鏈酶把真核基因的cDNA導(dǎo)入到原核細(xì)胞中表達(dá)。這種雙鏈DNA是不含內(nèi)含子的DNA，叫做cDNA目的基因的篩選與獲取2.目的基因的概念：用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因；主要是編碼特定蛋白質(zhì)的基因，也可以是具有調(diào)控作用的因子如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。資料：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲蛋白），破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲?？茖W(xué)家將“殺蟲基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。目的基因目的基因的篩選與獲取目的基因的篩選與獲取3.篩選與獲取目的基因的方法篩選：從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。DNA測序儀核苷酸序列比對氨基酸序列比對美國國家生物信息中心目的基因的篩選與獲取3.篩選與獲取目的基因的方法目的基因獲取方法人工合成從基因文庫中獲取利用PCR獲取和擴增目的基因如何獲取目的基因？（1）人工合成DNA合成儀前提：基因比較小、核苷酸序列已知方法：通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接合成目的基因目的基因的篩選與獲取3.篩選與獲取目的基因的方法

（化學(xué)合成法、逆轉(zhuǎn)錄法）目的基因的篩選與獲取3.篩選與獲取目的基因的方法（2）從基因文庫中獲取基因組文庫部分基因文庫（主要是cDNA文庫）基因文庫：基因組文庫：含有某種生物全部基因片段的重組DNA的克隆群體。部分基因文庫：含有某種生物部分基因片段的重組DNA的克隆群體。建立基因組文庫某生物所有DNA特定的限制酶基因組所有基因每個基因和載體結(jié)合重組DNA分子導(dǎo)入受體菌基因組文庫建立cDNA基因文庫某種生物的成熟mRNA單鏈DNA雙鏈DNA片段（cDNA）導(dǎo)入受體菌中儲存cDNA文庫逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶與載體連接目的基因的篩選與獲取3.篩選與獲取目的基因的方法（3）利用PCR獲取和擴增目的基因概念：PCR全稱為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。原理：

DNA半保留復(fù)制（體外）復(fù)習(xí)：DNA半保留復(fù)制的過程，觀看視頻，總結(jié)條件與特點條件原料：游離的脫氧核苷酸（A、T、G、C）模板：DNA的兩條鏈酶：DNA解旋酶、DNA聚合酶等能量：ATP復(fù)制原則堿基互補配對原則（保證復(fù)制的準(zhǔn)確進(jìn)行）特點半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制思考：結(jié)合體內(nèi)DNA復(fù)制過程，思考進(jìn)行PCR需要哪些條件？目的基因的篩選與獲取復(fù)制方向子鏈的5’--3’端思考：結(jié)合體內(nèi)DNA復(fù)制過程，思考進(jìn)行PCR需要哪些條件？目的基因的篩選與獲取體內(nèi)復(fù)制在DNA復(fù)制中的作用體外復(fù)制解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸高溫DNA母鏈四種脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶引物目的基因的篩選與獲取3.篩選與獲取目的基因的方法（3）利用PCR獲取和擴增目的基因條件:緩沖液、DNA模板、4種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸。DNA雙鏈解旋之后DNA聚合酶無法直接聚合游離的脫氧核苷酸，必須由引物提供3’端之后才能開始連接脫氧核苷酸。由于DNA雙鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模孕枰?種引物。目的基因的篩選與獲取3.篩選與獲取目的基因的方法（3）利用PCR獲取和擴增目的基因5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’引物13’5’引物23’5’5’3’3’5’引物25’3’引物15’3’引物13’5’引物23’5’引物25’3’引物1目的基因過程：變性→復(fù)性→延伸總結(jié)：PCR技術(shù)擴增過程a、變性（超過90℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，

斷裂，形成

。

b、復(fù)性（下降到50℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板通過堿基互補配對，形成局部

。c、延伸（上升到72℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，溶液中的

在

的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則，合成與模板互補的新的DNA鏈，子鏈方向為

。氫鍵單鏈DNA雙鏈結(jié)構(gòu)4種脫氧核苷酸5′端→3′端耐高溫的DNA聚合酶利用PCR獲取和擴增目的基因（常用）反應(yīng)的結(jié)果：以_______方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）

指數(shù)2n采用

來鑒定PCR的產(chǎn)物。瓊脂糖凝膠電泳第一次循環(huán)90℃以上，DNA雙鏈解開50℃左右，引物與DNA結(jié)合72℃左右，新DNA合成3’5’5’3’5’5’3’5’5’5’第二次循環(huán)5’3’5’5’3’5’高溫變性、低溫復(fù)性中溫延伸第二次循環(huán)3’5’高溫變性、低溫復(fù)性第三次循環(huán)3’5’中溫延伸第三次循環(huán)3’5’比較PCR技術(shù)與體內(nèi)DNA復(fù)制項目PCR技術(shù)體內(nèi)DNA復(fù)制不同點場所解旋方式酶引物特點能量溫度條件結(jié)果細(xì)胞外（主要在PCR儀內(nèi)）細(xì)胞內(nèi)（主要在細(xì)胞核內(nèi)）耐高溫的DNA聚合酶解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋解旋酶、DNA聚合酶小段RNA或單鏈DNA分子一小段RNA體外迅速擴增生物體內(nèi)邊解旋邊復(fù)制dNTPATP在較高溫度下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)溫和的條件短時間形成大量DNA片段形成完整的DNA分子第三章第二節(jié)

基因工程的基本操作程序二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因表達(dá)載體的構(gòu)建（核心）1.基因表達(dá)載體的作用1.使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，且可以遺傳給下一代；2.使目的基因能夠在受體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用。2.基因表達(dá)載體的組成RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。人們所需要的基因基因的尾端（一段特殊的DNA片斷）終止mRNA的轉(zhuǎn)錄DNA復(fù)制所需結(jié)構(gòu)3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出_________。（2）用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）再加入適量___________，將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）。限制酶黏性末端同一種限制酶切口DNA連接酶相同的黏性末端基因表達(dá)載體的構(gòu)建【思考1】使用一種DNA限制酶進(jìn)行切割，是否只會得到目的基因與載體結(jié)合的這一種重組DNA？載體目的基因自連片段間的連接目的基因自連質(zhì)粒自連目的基因與質(zhì)粒連接目的基因與目的基因連接質(zhì)粒與質(zhì)粒連接11’22’122’1’22’1’1基因表達(dá)載體的構(gòu)建【思考2】如何防止目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化以及目的基因的反向連接？雙酶切EcoRⅠEcoRⅠBglⅡ防止質(zhì)粒重新環(huán)化防止質(zhì)粒與目的基因反向連接防止目的基因自身環(huán)化基因表達(dá)載體的構(gòu)建第三章第二節(jié)

基因工程的基本操作程序三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1、

轉(zhuǎn)化：指目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程。

轉(zhuǎn)化的實質(zhì)是將目的基因整合到受體細(xì)胞基因組中。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞2.轉(zhuǎn)化的方法：導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動物細(xì)胞導(dǎo)入原核細(xì)胞花粉管通道法、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法顯微注射法、病毒介導(dǎo)法Ca2+處理法（感受態(tài)法）Ca2+轉(zhuǎn)化法（導(dǎo)入微生物）使用Ca2+處理可使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。（感受態(tài)細(xì)胞）過程微生物作為受體細(xì)胞的優(yōu)點：繁殖快，單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對較少，易于培養(yǎng)操作Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞操作程序：取受精卵顯微注射胚胎移植為什么常選用受精卵作為受體細(xì)胞呢？提純基因表達(dá)載體①體積大，易操作。②全能性高，易培養(yǎng)成完整個體。顯微注射法（導(dǎo)入動物細(xì)胞）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞病毒介導(dǎo)法（主要用于導(dǎo)入動物細(xì)胞）

科學(xué)家也用病毒DNA與目的基因一起構(gòu)建的載體，去感染受體動物細(xì)胞，也能使目的基因?qū)雱游锛?xì)胞內(nèi)。如用腺病毒載體，搭載新冠病毒S基因，進(jìn)入人體內(nèi)，使人體產(chǎn)生對S蛋白的免疫記憶。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞花粉管通道法（我國獨創(chuàng)）②在植物授粉后一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通過花粉管通道進(jìn)入胚囊。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；適用生物：開花植物將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有的

Ti質(zhì)粒上的

T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且將其整合到該受體細(xì)胞染色體DNA上兩次拼接兩次轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞的選擇：①轉(zhuǎn)基因植物用

；②轉(zhuǎn)基因動物用

(一般不能用體細(xì)胞)；

原因是：

。③微生物常用

等。微生物作為受體細(xì)胞的優(yōu)點是

。④要合成糖蛋白、有生物活性的分泌蛋白等則受體細(xì)胞為

，原因是

；⑤一定不能用哺乳動物成熟的紅細(xì)胞，原因是

。真核細(xì)胞分泌蛋白等需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等的加工受精卵有發(fā)育的全能性無核，無器，不能合成蛋白質(zhì)體細(xì)胞(葉、芽、根)或受精卵受精卵大腸桿菌、酵母菌繁殖快，單細(xì)胞，遺傳物質(zhì)相對較少，易于培養(yǎng)操作第三章第二節(jié)

基因工程的基本操作程序四、目的基因的檢測與鑒定1.分子水平的檢測與鑒定類型檢測內(nèi)容方法檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA鑒定目的基因是否翻譯形成蛋白質(zhì)PCR擴增DNA分子雜交技術(shù)PCR擴增分子雜交技術(shù)抗原-抗體雜交技術(shù)目的基因的檢測與鑒定【拓展】基因探針（1）定義：（2）特點：①應(yīng)是單鏈，若為雙鏈，必須先行變性處理成單鏈。②應(yīng)帶有容易被檢測的標(biāo)記。它可以包括整個基因，也可以僅僅是基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)而來的RNA。（3）核酸雜交：可以用于檢測目的基因：將待測DNA與目的基因探針混合，如果發(fā)生了核酸雜交，則說明有目的基因。是一段帶有檢測標(biāo)記（熒光或同位素標(biāo)記），且順序已知的，與目的基因能互補的核酸序列（DNA或RNA）?；パa的兩條核酸單鏈通過復(fù)性形成雙鏈的過程。①.檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因方法1：PCR擴增DNA半保留復(fù)制原理：基本思路：1.制作出與目的基因序列相同的有同位素標(biāo)記的DNA片段（基因探針），并用PCR擴增；2.提取受體細(xì)胞全部DNA并用PCR擴增，與基因探針置于同一培養(yǎng)液；3.高溫變性處理，使之全部變?yōu)閱捂?，觀察是否出現(xiàn)雜交DNA片段。方法2：DNA分子雜交技術(shù)堿基互補配對原理：目的基因的檢測與鑒定②.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA方法：PCR擴增或DNA分子雜交技術(shù)基本思路：1.制作出與目的基因序列相同的有同位素標(biāo)記的DNA(cDNA)片段（