TNAIA 0352-2024 植物源性食品中番茄源性成分的檢測實時熒光PCR法

ICSCCSA032

T/NAIA團 體 標 準T/NAIA0352-2024植物源性食品中番茄源性成分的檢測實時熒光PCR法IdentificationoftomatoingredientsinfoodsofplantoriginReal-timePCRmethod2024-12-25發(fā)布 2025-01-01實施寧夏化學(xué)分析測試協(xié)會??發(fā)布T/NAIA0352-2024T/NAIA0352-2024II前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則 第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由寧夏化學(xué)分析測試協(xié)會提出并歸口。中心。本文件主要起草人：岳苑、馮秀娟、何淑楨、蘇洋、高俊峰、姚博偉，魏嘉雯、賀生芳。T/NAIA0352-2024T/NAIA0352-2024PAGEPAGE1植物源性食品中番茄源性成分的檢測實時熒光PCR法范圍本文件規(guī)定了植物源性食品中番茄源性成分的實時熒光PCR檢測方法。本文件適用于植物源性食品中番茄源性成分的Taqman探針實時熒光PCR定性檢測。檢出限（LOD）1%（質(zhì)量分數(shù)）。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27403 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。實時熒光PCR Real-timePCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，通過熒光信號的積累實時監(jiān)控整個PCR擴增過程。Ct值 Cyclethreshold每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。原理提取試樣中基因組DNA，以DNA為模板，利用番茄特異性引物及探針進行實時熒光PCR擴增檢測，同時設(shè)置陽性、陰性及空白對照。根據(jù)擴增的Ct值，判定試樣中是否含有番茄源性成分。試劑與材料除另有規(guī)定外，試劑為分析純或生化試劑。實驗用水符合GB6682的要求。所有試劑均用無DNA酶污染的容器分裝。引物與探針內(nèi)參照（18SrRNA）引物：5′-CCTGAGAAACGGCTACCA-3′5′-CGTGTCAGGATTGGGTAAT-3′探針：VIC-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-BHQ1番茄源性成分引物：5′-AGACCACGAGAACGATATTTGC-3′5′-TTCTTGCCTTTTCATATCCAGACA-3′探針：FAM-CTCTTTGCAGTCCTCCCTTGGGCT-BHQ1DNA提取試劑盒：提取步驟及使用注意事項參見附錄A。PCR反應(yīng)預(yù)混液1.5mL離心管，PCR八聯(lián)管。微量可調(diào)移液器配制吸頭：10μL，100μL，1000μL。儀器設(shè)備PCR儀。高速離心機（>12000r/min）。核酸蛋白測定儀。0.5μL～10μL10μL～100μL100μL～1000μL。恒溫加熱器。分析天平（0.1mg）。高壓滅菌器。干熱滅菌器。檢驗步驟樣品前處理總則對樣品進行前處理，處理后的樣品分成三等，包括待檢樣品、復(fù)檢樣品、留存樣品。制備固態(tài)樣粉碎后收集到50mL離心管或密封袋中，半固態(tài)與液態(tài)混勻后分裝于50mL離心管或密封袋中，4～8℃保存。DNA提取在樣本制備區(qū)進行，采用等效的植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取。每個樣品應(yīng)制備2個測試樣品提取DNA。DNA濃度測定和定量將DNA溶液做適當稀釋,使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計分別檢測260nm和280nm處的吸光值。1OD260nm=50μg/mL雙鏈DNA或38μg/mL單鏈DNA。DNA的濃度按照式(1)計算，當OD260/OD280比值在1.5~2.1之間時，適宜于PCR擴增。擴增前將所有樣品DNA稀釋至10ng/uL~50ng/μL。??×??×50式中：

??=

1000 ………………（1）C——DNA濃度，單位為ng/μLA——260nm處的吸光值N——稀釋倍數(shù)50——1OD260nm=50μg/mL雙鏈DNAPCR檢測擴增試劑準備PCR1PCR（參見附錄中取出相應(yīng)的實時熒光PCR心5s后再用。每個樣品設(shè)置2個平行重復(fù)。表1 實時熒光PCR反應(yīng)體系試劑成分體積（μL）2×預(yù)混液12.5引物混合液1探針1樣品DNAddH2O1至25注1：空白對照實驗時，用ddH2O替代樣品DNA。注2：陰性對照實驗時，用非目標源性成分替代樣品DNA。注3：陽性對照實驗時，用相應(yīng)番茄的DNA替代樣品DNA。PCR反應(yīng)程序?qū)崟r熒光PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃30s；95℃5s、60℃30s，40個循環(huán)，在每次循環(huán)的退火時收集光。檢測結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線和Ct值判定結(jié)果。結(jié)果判定與表述質(zhì)量控制以下條件有一條不滿足時,試驗視為無效:VIC熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值<30.0；FAM熒光信號檢出，Ct值≥40.0；FAM熒光信號檢出，Ct值≥40.0；FAM熒光信號檢出，且出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值≤35.0；結(jié)果判定在符合9.1的情況下，檢測結(jié)果如下判定：Ct值≤35.0，則判定為被檢樣品陽性；Ct值≥40.0，則判定為被檢樣品陰性；35.0＜Ct值＜40.0Ct35.0＜Ct值＜40.0，則判定Ct值≥40.0，測判定被檢樣品陰性。結(jié)果表述結(jié)果為陽性者，表述為“檢出番茄源性成分”。結(jié)果為陰性者，表述為“未檢出番茄源性成分”。檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403-2008附錄D執(zhí)行。附錄A（資料性）植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）的提取步驟和注意事項DNA以某植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）為例。提取步驟（以干燥樣品為例）稱取10mg～50mg樣品于1.5mL600μLCSPL有組織塊。65℃孵育30min，期間渦旋混勻樣品2次。600μL氯仿：異戊醇（24:1），高速渦旋混勻20s，≥10000×g離心10min。在新的1.5mL離心管中加入150μLCXDBuffer和300μL無水乙醇，振蕩混勻。小心移取300μL上清液到離心管中，確保不要轉(zhuǎn)移到任何沉淀，振蕩混勻。把HiBindDNA結(jié)合柱套在2.0mL收集管中，將離心管中所有液體轉(zhuǎn)移至柱子中。室溫10000×g離心1min以結(jié)合DNA上柱，棄去濾過液。將HiBindDNA700μLDNAWashBuffer（已用無水乙醇稀釋）至柱子中，室溫10000×g離心1min，棄去濾過液。至少重復(fù)步驟2.7一次。將HiBindDNA結(jié)合柱重新套回收集管中，≥10000×g離心空柱2min以干燥