T-SATA 079-2024 果蔬中天冬酰胺和谷氨酰胺含量測定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

ICS03.080.99CCSX00DeterminationofasparagineandglutamineinfruitsandvegetablesbyLC-MS/MSIT/SATA079—2024前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4原理 5試劑與材料 6儀器和設(shè)備 27分析步驟 28結(jié)果計算 49靈敏度、精密度 4附錄A（資料性）天冬酰胺和谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液及其內(nèi)標(biāo)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖 6T/SATA079—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由深圳市計量質(zhì)量檢測研究院提出。本文件由深圳市分析測試協(xié)會歸口。本文件起草單位：深圳市計量質(zhì)量檢測研究院、深圳市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心、深圳深檢集團醫(yī)學(xué)檢驗實驗室。本文件主要起草人：肖偉敏、葉新玉、王奇、孫亮、李子櫻、楊國武、趙云霞、唐淑軍、孫麗萍、劉成文、陳欣、張玉鑫、黃城益、顏沁、朱澤超、林偉杰、孫勝男。1T/SATA079—2024果蔬中天冬酰胺和谷氨酰胺含量測定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本文件規(guī)定了果蔬中天冬酰胺和谷氨酰胺的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。本文件適用于新鮮果蔬中天冬酰胺和谷氨酰胺的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T32465-2015化學(xué)分析方法驗證確認和內(nèi)部質(zhì)量控制要求3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4原理試樣經(jīng)灰色鏈霉菌蛋白酶酶解，并加入抗氧化劑丁基羥基苯甲醚處理，稀釋后用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。5試劑與材料除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682規(guī)定的一級水。5.1試劑5.1.1甲醇（CH3OH）：質(zhì)譜純。5.1.2甲酸（CH2O2）：色譜純。5.1.3乙醇（CH3CH2OH）：分析純。5.1.4濃鹽酸（HCl）。5.1.5丁基羥基苯甲醚（C11H16O2，BHA）。5.1.6灰色鏈霉菌蛋白酶（XIV型；來源于灰色鏈霉菌）：酶活力≥3.5U/mg。5.1.7三羥甲基氨基甲烷（Tris堿，C4H11O3N）。5.2試劑配制5.2.10.02%甲酸水溶液：吸取0.2mL甲酸至1L容量瓶中，定容至刻度，混勻。臨用前配置。5.2.2丁基羥基苯甲醚溶液（40mg/mL）：稱取4.00gBHA，用乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容至刻度。臨用前配置。5.2.3蛋白酶溶液（52.5U/mL稱取0.15g灰色鏈霉菌蛋白酶，用Tris緩沖液溶解并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中，定容至刻度。臨用前配置。5.2.4鹽酸溶液（1.0mol/L）：移取8.3mL濃鹽酸至100mL容量瓶中，加水定容至刻度。常溫保存，2T/SATA079—2024有效期1個月。5.2.5Tris緩沖液（0.05mol/L稱取6.06g三羥甲基氨基甲烷于1000mL燒杯中，加水800mL溶解，用1.0mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液pH至8.0±0.1，轉(zhuǎn)移至1L容量瓶中，用水定容至刻度。4℃保存，有效期1個月。5.3標(biāo)準(zhǔn)品5.3.1天冬酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（C4H8N2O3，CAS號：70-47-3）：純度≥99%，或經(jīng)國家認證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.3.2谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（C5H10N2O3，CAS號：56-85-9）：純度≥99%，或經(jīng)國家認證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.3.3天冬酰胺同位素內(nèi)標(biāo)（天冬酰胺水合物-15N2，C4H815N2O3·H2O，CAS：287484-32-6）：純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.3.4谷氨酰胺同位素內(nèi)標(biāo)（谷氨酰胺-15N2，C5H1015N2O3，CAS：204451-48-9）：純度≥98%，或經(jīng)國家認證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制5.4.1天冬酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液（2.00mg/mL）：準(zhǔn)確稱取100mg（精確至0.0001g）天冬酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用20%甲醇溶液溶解并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。4℃避光保存，有效期3個月。5.4.2谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液（2.00mg/mL）：準(zhǔn)確稱取100mg（精確至0.0001g）谷氨酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用20%甲醇溶液溶解并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。4℃避光保存，有效期3個月。5.4.3外標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（20.0μg/mL）：分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液各1.00mL至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。臨用前配置。5.4.4外標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（1.00μg/mL）：移取0.50mL外標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液（5.4.3）至10mL容量瓶中，用水定容至刻度。臨用前配置。5.4.5天冬酰胺-15N2內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液（2.00mg/mL準(zhǔn)確稱取114mg（精確至0.0001g）天冬酰胺水合物-15N2標(biāo)準(zhǔn)品，用20%甲醇水溶解并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。4℃避光保存，有效期3個月。5.4.6谷氨酰胺-15N2內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液（2.00mg/mL準(zhǔn)確稱取100mg（精確至0.0001g）谷氨酰胺-15N2標(biāo)準(zhǔn)品，用20%甲醇水溶解并轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度。4℃避光保存，有效期3個月。5.4.7同位素內(nèi)標(biāo)混合溶液（天冬酰胺-15N22.00μg/mL和谷氨酰胺-15N22.00μg/mL）：分別準(zhǔn)確移取1.00mL天冬酰胺-15N2和1.00mL谷氨酰胺-15N2儲備液于1L容量瓶中，用水定容至刻度。臨用前配置。5.4.8混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：分別準(zhǔn)確移取適量的外標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.4.4）和1.00mL同位素內(nèi)20.0ng/mL、50.0ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。臨用前配置。6儀器和設(shè)備6.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配置電噴霧電離源。6.2分析天平：感量0.000lg。6.3漩渦混合器。6.4恒溫水浴鍋。6.5廚房機械料理機。7分析步驟7.1樣品前處理3T/SATA079—2024選取新鮮蔬菜或水果樣品500g并粉碎均勻，準(zhǔn)確稱取混合均勻的試樣1.00g（精確至0.0001g）于20mL螺紋帶蓋玻璃瓶中，依次加入0.5mL蛋白酶溶液（5.2.3）、3.0mLTris緩沖液（5.2.5）、750μL（蔬菜）或250μL（水果）40mg/mLBHA溶液（5.2.2）和200μL甲醇，渦旋混勻。樣品溶液于37℃恒溫水浴酶解16h～18h。取出樣品溶液，冷卻至室溫，將酶解液全部轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻。離心或者過濾得到試樣清液。準(zhǔn)確吸取1.0mL試樣清液，稀釋5倍獲得試樣溶空白試驗：除不加試樣外，均按上述樣本分析步驟操作。7.2儀器參考條件7.2.1色譜條件液相參考色譜條件如下：a)色譜柱：五氟苯基柱（4.6mm×250mm，1.7μm）或性能相當(dāng)者;b)流動相A：0.02%甲酸溶液；流動相B：甲醇；梯度洗脫程序見表1;c)流速：0.5mL/min;d)柱溫：35℃;e)進樣體積：5μL。表1超高效液相色譜洗脫梯度參考條件7.2.2質(zhì)譜條件a)離子化模式：電噴霧正離子電離（ESI+）；b)掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；c)霧化器溫度：300℃;d)離子傳輸毛細管溫度：250℃;e)噴霧電壓：3500V；f)鞘氣流速：12.6L/min；g)輔助氣流速：3.0L/min；h)監(jiān)測離子對和定量離子對等信息詳見表2。表2質(zhì)譜參數(shù)天冬酰胺-N4T/SATA079—2024谷氨酰胺-N7.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將標(biāo)準(zhǔn)混合系列工作液分別注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，以目標(biāo)化合物與其同位素內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)系列工作液中目標(biāo)化合物的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)溶液多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖見附錄A中圖A.17.4定性和定量7.4.1保留時間被測試樣中目標(biāo)色譜峰與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時間相比較，相對誤差應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。7.4.2離子豐度比在相同測試條件下，試樣中的天冬酰胺和谷氨酰胺色譜峰保留時間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液相比，偏差范圍在±2.5%以內(nèi)，且檢測到的離子的相對豐度，應(yīng)當(dāng)與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)工作液相對豐度一致，其允許偏差不超過表3規(guī)定的范圍。表3定性時離子豐度比的最大允許偏差7.4.3試樣溶液的測定將處理完畢的試樣（7.1）按儀器參考條件（7.2）進行測定，得到相應(yīng)的樣品溶液的色譜峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中組分的濃度，平行測定次數(shù)不少于兩次。8結(jié)果計算將液相色譜-質(zhì)譜測得濃度代入下式計算含量：式中：X——試樣中天冬酰胺、谷氨酰胺的含量，單位為毫克每百克（mg/100gP——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣溶液中天冬酰胺、谷氨酰胺的濃度，單位為納克每毫升（ng/mLP0——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的空白試驗溶液中被測化合物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；V——試樣定容體積，單位為毫升（mL）；m——試樣質(zhì)量，單位為克（gf——試樣上清液稀釋倍數(shù)；100——單位換算系數(shù)；1000——單位換算系數(shù)。結(jié)果保留三位有效數(shù)字。9靈敏度、精密度5T/SATA079—20249.1靈敏度以3倍信噪比（S/N=3）對應(yīng)的目標(biāo)物濃度