系統(tǒng)生物 第二章 先進(jìn)測量平臺學(xué)習(xí)資料

第二章先進(jìn)測量平臺色譜法：當(dāng)流動相中攜帶的混合物流經(jīng)固定相時(shí)，其與固定相發(fā)生相互作用。由于混合物中各組分在性質(zhì)和結(jié)構(gòu)上的差異，與固定相之間產(chǎn)生的作用力的大小、強(qiáng)弱不同，隨著流動相的移動，混合物在兩相間經(jīng)過反復(fù)多次的分配平衡，使得各組分被固定相保留的時(shí)間不同，從而按一定次序由固定相中流出。與適當(dāng)?shù)闹髾z測方法結(jié)合，實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離與檢測；兩相及兩相的相對運(yùn)動構(gòu)成了色譜法的基礎(chǔ)。色譜法分類:1)氣相色譜：流動相為氣體（稱為載氣）。按分離柱不同可分為：填充柱色譜和毛細(xì)管柱色譜；按固定相的不同又分為：氣固色譜和氣液色譜(2)液相色譜：流動相為液體（也稱為淋洗液）。按固定相的不同分為：液固色譜和液液色譜。電泳：在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定。利用電泳現(xiàn)象對化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。1981年，Jorgenson等用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)：高效毛細(xì)管電泳。高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：一、采用了<0.1mm內(nèi)徑的毛細(xì)管二、采用了高達(dá)數(shù)萬伏的電壓毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場電壓可以很高。高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬。電場作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和。正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向一致，在負(fù)極最先流出；中性粒子無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動方向相反。ν電滲流>ν電泳時(shí)，陰離子在負(fù)極最后流出，在這種情況下，不但可以按類分離，除中性粒子外，同種類離子由于受到的電場力大小不一樣也同時(shí)被相互分離。1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白；1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；生物芯片--微量點(diǎn)樣原理將預(yù)先制備好的核酸、多肽或蛋白質(zhì)燈生物大分子用特殊的自動化微量點(diǎn)樣裝置(精密機(jī)械手)以中等密度互不干擾地點(diǎn)印于經(jīng)過特殊處理的基片上，并使之與支持物牢固結(jié)合。微量點(diǎn)樣法一般分接觸法和噴墨法(非接觸法)兩種。2-19質(zhì)譜分析法是通過對被測樣品離子的質(zhì)荷比（m/z）的測定來進(jìn)行分析的一種分析方法。被分析的樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場或磁場的運(yùn)動行為的不同，把離子按質(zhì)荷比分開而得到質(zhì)譜，通過樣品的質(zhì)譜和相關(guān)信息，可以得到樣品的定性定量結(jié)果。1912年：Thomson研制了世界上第一臺質(zhì)譜儀;1922年：Aston固用質(zhì)譜法發(fā)現(xiàn)同位素并將質(zhì)譜法應(yīng)用于質(zhì)量分析而獲得諾貝爾獎(jiǎng)；2002年：Fenn和Tanaka發(fā)明了生物大分子的質(zhì)譜分析法而獲得諾貝爾獎(jiǎng)。單聚焦質(zhì)譜儀雙聚焦質(zhì)譜儀四極桿質(zhì)譜儀飛行時(shí)間質(zhì)譜儀離子阱質(zhì)譜儀傅立葉變換質(zhì)譜儀串聯(lián)質(zhì)譜儀2-97Theligase-mediatedsequencingapproachoftheAppliedBiosystemsSOLiDsequencer.InamannersimilartoRoche/454emulsionPCRamplification,DNAfragmentsforSOLiDsequencingareamplifiedonthesurfacesof1-μmmagneticbeadstoprovidesufficientsignalduringthesequencingreactions,andarethendepositedontoaflowcellslide.Ligase-mediatedsequencingbeginsbyannealingaprimertothesharedadaptersequencesoneachamplifiedfragment,andthenDNAligaseisprovidedalongwithspecificfluorescentlabeled8mers,whose4thand5thbasesareencodedbytheattachedfluorescentgroup.Eachligationstepisfollowedbyfluorescencedetection,afterwhicharegenerationstepremovesbasesfromtheligated8mer(includingthefluorescentgroup)andconcomitantlypreparestheextendedprimerforanotherroundofligation.2-98Principlesoftwo-baseencoding.Becauseeachfluorescentgrouponaligated8meridentifiesatwo-basecombination,theresultingsequencereadscanbescreenedforbase-callingerrorsversustruepolymorphismsversussinglebasedeletionsbyaligningtheindividualreadstoaknownhigh-qualityreferencesequence.2-122Approachestonanoporesequencing.(a)Strand-sequencingusingioniccurrentblockage.Atypicaltraceoftheioniccurrentamplitude(left)throughanα-hemolysinporeclearlydifferentiatesbetweenanopenpore(topright)andoneblockedbyastrandofDNA(bottomright)butcannotdistinguishbetweenthe~12nucleotidesthatsimultaneouslyblockthenarrowtransmembranechanneldomain(redbracket).(b)Exonuclease-sequencingbymodulationoftheioniccurrent.Anexonuclease(paleblue)attachedtothetopofanα-hemolysinporethroughageneticallyencoded(deepblue),orchemical,linkersequentiallycleavesdNMPs(gold)offtheendofaDNAstrand(inthiscase,onestrandofadouble-strandedDNA).AdNMP’sidentity(A,T,GorC)isdeterminedbythelevelofthecurrentblockadeitcauseswhendrivenintoanaminocyclodextrinadaptor(red)lodgedwithinthepore.Afterafewmilliseconds,thedNMPisreleasedandexitsontheoppositesideofthebilayer.(c)NanoporesequencingusingsyntheticDNAandopticalreadout.EachnucleotideinthetargetDNAthatistobesequencedisfirstconvertedintoalongerDNAstrandcomposedofpairsoftwodifferentcode-units(coloredorangeandblueforillustration);eachcode-unitisa12-base-longoligomer.AfterhybridizingtheconvertedDNAwithmolecularbeaconsthatarecomplementarytothecodeunits,thesebeaconsarestrippedoffusingananopore.ThesequenceoftheoriginalDNAisreadbydetectingthediscreteshort-livedphoton-burstsaseacholigoisstripped.(d)Strand-sequencingusingtransverseelectroncurrents.DNAisdriventhroughananoporefunctionalizedwithembeddedemitterandcollectortunnelingprobes(orange)andabackgate(black).TheamplitudeofthetunnelingcurrentsthattraversethroughthenucleotidesisexpectedtodifferentiateeachnucleobaseastheDNAiselectrophoreticallydriventhroughthepore(arrow).2-125SNP同一物種不同個(gè)體間染色體上遺傳密碼單個(gè)堿基的變化，主要表現(xiàn)為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性。SNP是人類可遺傳的變異中最常出現(xiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上，在人類基因組中廣泛存在，大約平均1000個(gè)堿基對就會出現(xiàn)一個(gè)SNP，估計(jì)整個(gè)人類基因組30億堿基中至少有300萬個(gè)SNP。

SNP大都表現(xiàn)為二等位基因多態(tài)性，即在該位置只存在兩種不同的堿基。

SNP作為一種堿基的替換，大多數(shù)為轉(zhuǎn)換(C-T，G-A)，也可能是顛換。在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，多發(fā)生C-T轉(zhuǎn)換，原因是CG中C是甲基化的，它能自發(fā)的脫氨基而替換為胸腺嘧啶。

SNP在基因組中可被人為的劃分為兩種形式：一是分布在基因編碼區(qū)的功能性突變，稱為cSNP；二是處于非編碼區(qū)的大量單堿基變異。從對生物的遺傳性狀的影響來看，cSNP又可分為兩種：同義cSNP、非同義cSNP。2-126以熒光共振能量傳遞(FRET)為基礎(chǔ)的檢測方法。在PCR反應(yīng)中，將供者-受者染料對分別結(jié)合到Taqman探針的兩端，探針未與目標(biāo)序列結(jié)合時(shí)，通過FRET作用使供者不發(fā)熒光；完全互補(bǔ)配對后，由于TaqDNA聚合酶具有5‘核酸酶的活性，可將供者從探針上切下來從而發(fā)出熒光。如果探針與目標(biāo)序列中存在錯(cuò)配堿基，會減少探針與目標(biāo)序列結(jié)合的緊密程度及TaqDNA聚合酶切割供者的活性，也就影響了供者的熒光釋放量，從而使堿基突變鏈和正常鏈得以區(qū)分。2-127分子信標(biāo)是一個(gè)U型的單鏈核苷酸探針(探針序列內(nèi)部可有一定程度的互補(bǔ)配對)，在探針兩端也加上供者-受者染料對，U型探針使兩染料靠近，通過FRET作用使供者不發(fā)熒光。當(dāng)探針與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)配對后，兩染料分離，使得供者的熒光亮增加，如果目標(biāo)序列中存在錯(cuò)配堿基，就會影響探針與其結(jié)合，從而影響到供者的熒光亮，使堿基突變鏈和正常鏈得以區(qū)分。2-186Currently,therearetwomainapproachesforSCP.Oneisflowcytometry.Scientistcollectprimarycellsfromhumantissue,thenmaketheproteinslabeling.Allthecellsonbyonepassthruthedetectionwindowofflowcytometry.Fromthedata,scientistcanmapoutthepotentialsignaltransductionpathwayandnetwork.Itisbiologist’sapproach.2-187Almostatthesametime,Dovichiproposedanotherapproach,calledchemicalcytometry.Theydevelopedaverysmart2DCEsystemsandgaveafingerprintofasinglecell.Theadvantageofthisapproachisobvious…However,identificationofproteinisverydifficultbecausetheamountofproteininsinglecellisreallyrear,anditseemsnowaytobecoupledtomassspectrometry.2-189Atthebiochemicallevel,proteinsrarelyactalone,butratherinteractwithoneanother,sometimesincomplexes,tocarryoutspecificcellularprocesses.Twohybridsystems:(+)pairwise/binaryinteractionsbetweenproteins;transientassociatio