分子細(xì)胞生物學(xué)——細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù)

1、第二章 細(xì)胞生物學(xué)研究技術(shù),2003.9 - 2010.9,生命科學(xué)是實驗科學(xué)，它的很多成果都是通過實驗才得以發(fā)現(xiàn)和發(fā)展的。許多細(xì)胞生物學(xué)的重要進(jìn)展以及新概念的形成，往往來自新技術(shù)的應(yīng)用。因此，方法上的突破，對于理論和應(yīng)用上的發(fā)展具有巨大的推動作用。,第一節(jié) 顯微鏡技術(shù) 第二節(jié) 細(xì)胞成分分析技術(shù) 第三節(jié) 細(xì)胞組分分離技術(shù) 第四節(jié) 細(xì)胞分選技術(shù) 第五節(jié) 細(xì)胞工程技術(shù) 第六節(jié) 分子生物學(xué)技術(shù),學(xué)習(xí)內(nèi)容,一、光學(xué)顯微鏡技術(shù) (light microscopy),第一節(jié) 顯微鏡技術(shù),二、電子顯微鏡技術(shù) (electron microscopy),觀察細(xì)胞及其組分的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。,顯微鏡成像三要素: 照明

2、系統(tǒng)， 被觀察的樣品，聚焦和成像的透鏡系統(tǒng),一、顯微鏡成像基本原理,在光學(xué)顯微鏡中，照明系統(tǒng)是可見光，使用的是玻璃透鏡系統(tǒng)，可直接通過目鏡觀察鏡像。,在電子顯微鏡中，照明系統(tǒng)為電子束，使用電磁透鏡，通過熒光屏觀察樣品的鏡像。,: 光源波長; : 物鏡鏡口角; n: 介質(zhì)折射率,顯微鏡的分辨能力,肉眼：0.2 mm; 光鏡：0.2 um; 電鏡：0.2 nm,二、常用光學(xué)顯微鏡,普通光學(xué)顯微鏡 倒置顯微鏡(inverted microscope) 熒光顯微鏡 (fluorescence microscope) 相差顯微鏡(phase-contrast microscope) 微分干涉相差顯微鏡(

3、differential interference contrast microscope, dic) 暗視野顯微鏡(dark field microscope) 激光共焦掃描顯微鏡 (laser confocal microscope),倒置顯微鏡,組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，用于觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞，具有相差物鏡。,相差顯微鏡,在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行了特別設(shè)計，尤其是光學(xué)系統(tǒng)，將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差，主要用于觀察體外培養(yǎng)中活細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。,利用紫外線發(fā)生裝置(如弧光燈、水銀燈等)發(fā)出強(qiáng)烈的紫外線光源，用于觀察細(xì)胞中有自發(fā)熒光、誘發(fā)熒光或經(jīng)熒光染料標(biāo)記的結(jié)構(gòu)。,熒光顯微鏡,特點

4、是：a 光源為紫外光，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡；b有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人目。,微分干涉顯微鏡,偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。,暗視野顯微鏡,暗視野顯微鏡 (dark field microscope) 的聚光鏡中央有當(dāng)光片，使照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。利用這種顯微鏡能見到小至 4200 nm的微粒子，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。,暗視野顯微鏡主要觀察的是物體的輪廓，

5、不分辨內(nèi)部的微細(xì)構(gòu)造，適合于觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細(xì)菌和霉菌等。,可對細(xì)胞內(nèi)部非侵入式光學(xué)斷層掃描成像，可進(jìn)行一系列亞細(xì)胞水平的結(jié)構(gòu)和功能研究 。,激光共聚焦掃描顯微鏡,掃描電子顯微鏡 scanning electron microscopy，sem,透射電子顯微鏡 transmission electron microscopy，tem,三、電子顯微鏡,電子顯微鏡觀察到的結(jié)構(gòu)稱超(亞)微結(jié)構(gòu)，可放大幾萬倍至幾十萬倍。,掃描隧道顯微鏡 scanning tunneling microscope，stm,觀察細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)，分辨率 0.2 nm。 用電子束穿透標(biāo)本，經(jīng)電磁場

6、的會聚和放大后在熒光屏上顯像或?qū)⒂跋裢渡涞秸障嗟灼?由于電子束穿透力弱，故經(jīng)固定后的電鏡標(biāo)本需制成超薄切片(5080 nm) ，并用重金屬鹽如檸檬酸鉛和醋酸鈾等染色。 標(biāo)本制備：固定(戊二醛等) 包埋(環(huán)氧樹脂) 切片(50-80nm) 染色(醋酸鈾和檸檬酸鉛等重金屬鹽)。,透射電鏡術(shù),掃描電鏡術(shù),用于觀察細(xì)胞表面的立體細(xì)微結(jié)構(gòu)。 需將小塊組織經(jīng)固定、脫水、干燥后，在其表面噴鍍薄層碳膜或金屬膜。 圖像清晰，富有立體感 。,儀器設(shè)備使用注意事項,使用前必須認(rèn)真閱讀“說明書”，了解其工作原理和性能，按照“說明書”的要求進(jìn)行操作，或在技術(shù)人員的指導(dǎo)下操作。,第二節(jié) 細(xì)胞組分的分析方法,一、細(xì)胞化學(xué)

7、技術(shù) 二、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 三、核酸雜交技術(shù) 四、放射自顯影技術(shù),一、細(xì)胞化學(xué)技術(shù),主要用于顯示細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等。,利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。,如用過碘酸schiff反應(yīng)檢測多糖，用脂溶性染料顯示脂類，用酶化學(xué)染色顯示某種酶，用孚爾根反應(yīng)顯示dna。,二、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù),是應(yīng)用免疫學(xué)原理，采用標(biāo)記的抗原或抗體，通過抗原與抗體的特異性結(jié)合，然后用顯微鏡觀察標(biāo)記物，顯示細(xì)胞內(nèi)的抗體或抗原(肽或蛋白質(zhì)等)的分布部位及相對含量。,常用的標(biāo)記物有辣根過氧化物酶、熒光素等，因此又可分

8、為免疫酶技術(shù)、免疫熒光技術(shù)等。,二種基本染色法 直接法：第一抗體被標(biāo)記。 間接法：第一抗體也被看作抗原，而第二抗體被標(biāo)記。 由于信號被放大，故靈敏度更高。,是用標(biāo)記的rna或dna探針檢測rna或dna片段的有無、及在轉(zhuǎn)錄水平檢測基因的活性(mrna) 的一種重要方法。,三、核酸分子雜交技術(shù),原理：具有互補(bǔ)核苷酸序列的兩條單鏈核苷酸分子片段，在適當(dāng)條件下，通過氫鍵結(jié)合，形成dna-dna，dna-rna或rna-rna雜交的雙鏈分子。,用核酸雜交技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)某一基因在染色體上的定位，稱染色體原位雜交。,用核酸雜交技術(shù)檢測某一基因或轉(zhuǎn)錄物mrna在細(xì)胞內(nèi)的定位和轉(zhuǎn)錄狀況，稱細(xì)胞原位雜交。,原位

9、雜交技術(shù),southern 雜交,是體外分析特異dna序列的方法。操作時先用限制性內(nèi)切酶將核dna或線粒體dna切成dna片段，經(jīng)凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到醋酸纖維薄膜上，再用標(biāo)記的探針雜交，即可辨認(rèn)出與探針互補(bǔ)的特殊核苷序列。,四、放射自顯影術(shù),放射自顯影術(shù)(radioautography,autoradiography)用于研究標(biāo)記化合物在機(jī)體、組織和細(xì)胞中的分布、定位、變化、作用機(jī)理、作用部位等等。,其原理是將放射性同位素標(biāo)記物導(dǎo)入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，進(jìn)行制片、放射性曝光、顯影、定影等處理，即得知標(biāo)本中標(biāo)記物的準(zhǔn)確位置和數(shù)量。放射自顯影的切片還可再用染料染色，這樣便可在顯微鏡下對標(biāo)記上

10、放射性的化合物進(jìn)行定位或相對定量測定。,第三節(jié) 細(xì)胞成分的分離技術(shù),分離技術(shù)是一大類技術(shù)的總稱，包括細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的分離和生物大分子的分離。,一、離心分離技術(shù) (centrifugation) 二、層析分離技術(shù)(chromatography),一、 離心分離技術(shù),離心分離細(xì)胞組分和生物分子是最常用的分離方法，因為不同的細(xì)胞器和生物分子有不同的體積和密度，可在不同離心力的作用下沉降分離。,常用的兩類離心分離方法： 差速離心(differential centrifugation) 密度梯度離心(density gradient centrifugation),細(xì)胞器及大分子的密度及其沉降系數(shù),不同的

11、細(xì)胞結(jié)構(gòu)分離所需的離心力,差速離心,在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細(xì)胞器。 在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為：核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。,由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊，差速離心只用于分離大小懸殊的細(xì)胞，更多用于分離細(xì)胞器。通過差速離心可將細(xì)胞器初步分離，常需再通過密度梯度離心進(jìn)一步分離純化。,密度梯度離心,用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一個連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞器分層、分離。 又可分為速度沉降和等密度沉降兩種。,速度沉降(velocity sedimentatio

12、n)主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞器。這種沉降方法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。 生物顆粒(細(xì)胞器)在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。,速度沉降,等密度沉降(isopycnic sedimentation)適用于分離密度不等的顆粒。 細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞器分離。,等密度沉降,二、層析分離技術(shù),層析是廣泛使用的分離蛋白質(zhì)的方法，它是根據(jù)蛋白質(zhì)的形態(tài)、大小和電荷的不同而設(shè)計的物理分離方法。,凝膠過濾層析(gel

13、 filtration chromatography) 離子交換層析(ion-exchange chromatography) 親和層析(affinity chromatography),凝膠過濾層析 又稱排阻層析或分子篩過濾，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化的一種方法。 原理：蛋白質(zhì)的體積大小不一，凝膠上有大小不一的孔；大的蛋白質(zhì)在凝膠中不進(jìn)入孔內(nèi)直接下來，速度最快，中等大小的進(jìn)入大孔中，下來速度較慢，小的蛋白質(zhì)則進(jìn)入小孔中，下來速度最慢。,離子交換層析 離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的差異進(jìn)行分離純化的一種方法。 它以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與

14、交換劑上的平衡離子進(jìn)行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進(jìn)行分離的一種層析方法。,在生物分子中，有些分子的特定結(jié)構(gòu)部位能夠同其他分子相互識別并結(jié)合，如酶與底物的識別結(jié)合、受體與配體的識別結(jié)合、抗體與抗原的識別結(jié)合，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可使這種結(jié)合解除，生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。親和層析就是根據(jù)這樣的原理設(shè)計的蛋白質(zhì)分離純化方法,親和層析,一、離心分選術(shù) 二、流式細(xì)胞分選術(shù) 三、免疫磁珠分選術(shù) 四、電泳分選術(shù),第四節(jié) 細(xì)胞分選技術(shù),流式細(xì)胞術(shù)是對單個細(xì)胞進(jìn)行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。 在分析或分選過程中，包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細(xì)胞的液滴

15、，在激光束的照射下，這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機(jī)處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群，分離純度可達(dá)99%。 包被細(xì)胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細(xì)胞計(儀) (flow cytometer)。,二、流式細(xì)胞術(shù),三、免疫磁珠法,磁珠可以結(jié)合蛋白質(zhì)，也可以被磁鐵吸引而發(fā)生力學(xué)移動。將微小磁珠用抗體(或抗原)包被后，使之與溶液中目的細(xì)胞表面的抗原(或抗體)特異性結(jié)合，再通過磁力作用發(fā)生力學(xué)移動，從而達(dá)到目的細(xì)胞與其他細(xì)胞(或物質(zhì))分離。,四、細(xì)胞電泳,在一定ph值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動，這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞

16、電泳 (cell electrophoresis)。 各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞電荷量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同，可用來分離不同種類的細(xì)胞。,所謂細(xì)胞工程，就是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，對細(xì)胞進(jìn)行操作。,第五節(jié) 細(xì)胞工程技術(shù),細(xì)胞工程基本技術(shù)主要包括：細(xì)胞體外培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞器移植及基因轉(zhuǎn)移等。,一、細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù) 二、細(xì)胞融合及單抗技術(shù) 三、顯微操作技術(shù) 四、干細(xì)胞技術(shù),將離體細(xì)胞或組織放置在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使其能生長并增殖的一種技術(shù)。 用于檢測各種理化因子、細(xì)胞因子等對細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、增殖、分化、代謝、運(yùn)動、吞噬、分泌等生命活動的影響，還可用于

17、研究細(xì)胞癌變及逆轉(zhuǎn)的機(jī)制，也可用于獲取特定的細(xì)胞、細(xì)胞產(chǎn)物等等。,一、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),二、細(xì)胞融合技術(shù),通過培養(yǎng)和誘導(dǎo)，兩個或多個細(xì)胞合并成一個雙核或多核細(xì)胞的過程稱為細(xì)胞融合(cell fusion)或細(xì)胞雜交。相同基因型細(xì)胞融合成同核體(homokaryon)；不同基因型的雜交細(xì)胞則稱為異核體(heterokaryon)。 動物細(xì)胞融合有以下三條途徑： 1. 病毒誘導(dǎo)融合； 2. 化學(xué)誘導(dǎo)融合； 3. 電激誘導(dǎo)融合。,單克隆抗體技術(shù),單克隆抗體(monoclone antibody)技術(shù)是細(xì)胞雜交技術(shù)的成功應(yīng)用。 正常淋巴細(xì)胞(如小鼠脾細(xì)胞)具有分泌抗體的能力，但不能在體外長期培養(yǎng)，瘤細(xì)胞(

18、如骨髓瘤) 可以在體外長期培養(yǎng)，但不分泌抗體。 1975英國人kohler和milstein 將兩種細(xì)胞雜交而創(chuàng)立了單克隆抗體技術(shù)，獲1984年諾貝爾獎。,單克隆抗體制備流程,三、顯微操作技術(shù),在顯微鏡下，用顯微操作儀對細(xì)胞進(jìn)行解剖手術(shù)和微量注射的技術(shù)屬顯微操作技術(shù)。 包括細(xì)胞核移植、嵌合體制作、細(xì)胞器移植、基因或染色體注入、胚胎切割、體外胚胎生產(chǎn)等。,1 核移植(克隆動物)技術(shù),細(xì)胞核移植技術(shù)，就是將供體細(xì)胞核移入除去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)過受精等有性過程 (無性繁殖) 即可被激活，構(gòu)成新的重組胚胎，重組胚胎移植后，發(fā)育成與供體細(xì)胞基因型相同的后代，使得核供體的基因得到完全復(fù)制。,嵌合體

19、(chimeras)是指由不同基因型細(xì)胞構(gòu)成的生物體。 嵌合動物是指由兩種或兩種以上具有不同遺傳性質(zhì)的細(xì)胞系組成的聚合胚發(fā)育成的動物個體。 嵌合動物技術(shù)是指由兩個或兩個以上同種或異種的受精卵組合發(fā)育而來的一個復(fù)合個體的制作技術(shù)。 制作嵌合動物的方法主要有聚合法和囊胚注射法。,2 嵌合動物技術(shù),聚合法是將2個或多個去除透明帶的早期胚胎，簡單地聚合在一起培養(yǎng)形成一個嵌合胚胎的過程。 囊胚注射法是把細(xì)胞注射入囊胚腔中，囊胚經(jīng)培養(yǎng)進(jìn)一步發(fā)育形成一個嵌合胚胎的過程。 注射的細(xì)胞可以是卵裂球、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞、es細(xì)胞和eg細(xì)胞，甚至是已分化的細(xì)胞。,3 染色體操作技術(shù),按照人們的意圖，有計劃地削減、添加和替

20、換染色體或其某一部分的方法和技術(shù)，以改變生物的遺傳基礎(chǔ)，達(dá)到人類需要的目的。,四、干細(xì)胞技術(shù),干細(xì)胞是一類能自我更新和分化為特殊種類細(xì)胞的細(xì)胞。干細(xì)胞被science1999，2000及 2003年評為“十大科技進(jìn)展之一”。 干細(xì)胞技術(shù)主要包括：建立干細(xì)胞系，體外誘導(dǎo)分化，遺傳改造，移植、體外構(gòu)建組織和器官等。,干細(xì)胞分類,胚胎性干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞ess、胚胎生殖細(xì)胞egs,組織特異性干細(xì)胞：造血干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、 皮膚干細(xì)胞、,全能干細(xì)胞：受精卵、卵裂球,專能干細(xì)胞：造血干細(xì)胞,精原干細(xì)胞,皮膚干細(xì)胞,多能干細(xì)胞： ess 、egs；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,按來源劃分,按分化潛能劃分,第五節(jié) 分子生物學(xué)技術(shù),一、 pcr技術(shù) 二、基因工程技術(shù) 三、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù),一、pcr技術(shù),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, pcr)用于在體外將微量的目標(biāo)dna進(jìn)行大量擴(kuò)增，以便進(jìn)一步分析或操作。,反應(yīng)體系：樣