雞蛋中溶菌酶的提取

1、雞蛋中溶菌酶的提取，純化及純度鑒定李瑩姝蔣華云*（南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 ）摘要：從蛋清中用724弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂提取溶菌酶，然后用硫酸銨溶液洗脫，鹽析得到溶菌酶。用葡聚糖凝膠層析（SephadexG-75）純化溶菌酶，收集峰值處樣品。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳鑒定個(gè)步驟留樣及所得溶菌酶樣品的純度。溶菌酶得率為0.0474mg/100ml（0.03g/kg）；葡聚糖凝膠層析過(guò)程純化樣品得到了洗脫峰曲線，但未能收集到峰值處樣品；電泳結(jié)果顯示在純化過(guò)程中溶菌酶純度不斷升高。本實(shí)驗(yàn)溶菌酶得率較低，提取工藝有待改進(jìn)，需進(jìn)一步減少樣品損失；層析過(guò)程需進(jìn)一步熟練掌握，以更

2、好達(dá)到純化效果。關(guān)鍵詞：溶菌酶；離子交換樹(shù)脂，凝膠層析；SDS-PAGEExtraction, purification and purity of Egg lysozymeYings LiHuay Jiang*(College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing , China)Abstract:From egg white, with 724 weak acid cation exchange resin extraction of lysozyme, and then eluted with ammonium sulfa

3、te, salting to be lysozyme. With dextran gel chromatography (SephadexG-75) purified lysozyme, the peak of the sample collection. By SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) electrophoresis and identified steps to stay kind of purity of the samples from lysozyme. Lysozyme yield 0.0474mg/100ml (0.03g/kg); de

4、xtran gel chromatography purified samples obtained during elution peak curve, but failed to collect samples at the peak; electrophoresis showed that the purification process of lysozyme enzyme purity rising. In this study, lysozyme was the low rate of extraction process could be improved, the need t

5、o further reduce sample losses; chromatography process needs further proficiency in order to better achieve purification.Key words:lysozyme, Ion exchange resin, Gel chromatography, SDS-PAGE溶菌酶( Lysozyme , 1,4N溶菌酶) 是一種專門(mén)作用于革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中肽聚糖的-1,4- 糖苷鍵的水解酶, 因而又稱為胞壁質(zhì)酶或者N- 胞壁質(zhì)聚糖水解酶。溶菌酶在臨床上是有效的消炎劑, 在食品防腐和基因工程

6、等方面也有廣泛的應(yīng)用。1 2溶菌酶來(lái)源廣泛, 人、動(dòng)物、植物和微生物中均有發(fā)現(xiàn), 其中雞蛋清中含量較高, 因此, 工業(yè)生產(chǎn)溶菌酶常以雞。蛋清為原料雞蛋清的溶菌酶是研究得最清楚的一種溶菌酶3，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，純品為白色或微黃色結(jié)晶體，易溶于水，不溶于丙酮、乙醇，是一種分子量在1415kD，等電點(diǎn)pH 值在11.0 左右，最適效應(yīng)溫度在50，最適pH 值為6.07.0 的堿性球蛋白。它的生物化學(xué)功能是催化某些細(xì)菌細(xì)胞壁多糖的水解，從而溶解這些細(xì)菌的細(xì)胞壁。溶菌酶的抗菌及抗病毒活力與pH 值有關(guān)，在酸性介質(zhì)中，活力顯著增強(qiáng)。當(dāng)前, 溶菌酶的制備有多種方法，最常用的是離子交換樹(shù)脂吸附法4。溶菌酶的用途

7、很多，由于它本身是一種天然蛋白質(zhì)，無(wú)毒性，可以作為防腐劑、保鮮劑。在醫(yī)藥上，溶菌酶具有多種藥理作用，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤的功效，廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)。溶菌酶是基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程中必不可少的工具酶，國(guó)外多用于菌體內(nèi)容物質(zhì)的提取，在發(fā)酵工業(yè)上是一種重要的溶菌劑，用于破壞細(xì)胞壁，制備無(wú)菌提取液。溶菌酶所具有的廣泛用途吸引了國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行研究，已發(fā)表不少關(guān)于溶菌酶的試驗(yàn)報(bào)道。1材料和方法1.1材料與儀器新鮮雞蛋3顆,購(gòu)自市場(chǎng)；724型酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂；滅菌紗布；1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl；蒸餾水（實(shí)驗(yàn)室桶裝水）；磷酸緩沖液（pH 6.5，0.15M）；10（

8、NH4）2SO4溶液；固體（NH4）2SO4；BaCl2； 12分離膠；4濃縮膠；Tris-甘氨酸電極緩沖液； loading Buffer；標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker ；染色液（考馬斯亮藍(lán)G-250）；脫色液（冰乙酸，甲醇）；葡聚糖凝膠（SephadexG-75）；藍(lán)色葡聚糖-2000（2mg/mL）； G-75洗脫液（KCl，HAc）電子分析天平；真空泵；超聲振蕩器；布氏漏斗，循環(huán)水式多用真空抽濾泵；玻璃棒，冰水浴，吸管，普通離心機(jī)，高速冷凍離心機(jī)；透析袋，磁子，磁力攪拌器，玻璃層析柱（20mm15cm），恒流泵，細(xì)滴管，Bio-Rad層析系統(tǒng)設(shè)置，部分收集器；水浴鍋；Bio-Rad垂直電泳系統(tǒng)

9、（制膠系統(tǒng)、電泳槽）；脫色搖床；可見(jiàn)分光光度計(jì)(UV-1100型)；紫外分光光度計(jì)；微量移液器；4冰箱；容量瓶；精密pH試紙；等。部分試劑詳細(xì)配方及配法見(jiàn)附錄I1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1陽(yáng)離子交換法提取溶菌酶樹(shù)脂預(yù)處理：干樹(shù)脂清水浸泡，使其充分膨脹并除去細(xì)小顆粒和較大雜質(zhì)； 1 mol/L 的HCl浸泡2 h，去離子水洗3次至至近中性；抽濾收集樹(shù)脂,1 mol/L 的NaOH溶液浸泡2 h，去離子水洗3次至近中性；抽濾收集樹(shù)脂,加0.15 mol/L、pH 值為65的磷酸緩沖液平衡過(guò)夜待用。蛋清制備：將3個(gè)新鮮雞蛋洗凈干燥，小端敲一個(gè)小洞，大端打一個(gè)小孔進(jìn)氣，分離得雞蛋清，用1 mol/L HC

10、l調(diào)節(jié)PH到7。過(guò)濾前稱量燒杯重48.7g，緩慢攪拌用滅菌的兩層紗布過(guò)濾除去臍帶塊和碎蛋殼等，蛋清與燒杯總重207.5g，蛋清凈重158.8g。用1 mol/L 的HCl 溶液調(diào)pH 值至7.0，量蛋清體積為100 ml。在調(diào)節(jié)PH時(shí)蛋清中出現(xiàn)少量白色沉淀，可能為部分蛋白由于局部過(guò)酸而變性。吸附：蛋清在不斷攪拌下加入抽濾好的724樹(shù)脂25g（相當(dāng)?shù)扒逅姆种惑w積的樹(shù)脂），冰水浴中磁力攪拌器緩慢攪拌（使樹(shù)脂全部懸浮在雞蛋清中，攪拌不能起泡）吸附2.5 h，4靜置1.5h。然后3000r/min離心15min分層，收集樹(shù)脂，回收蛋清（留樣A）。去除雜蛋白：收集樹(shù)脂用去離子水振蕩水洗直至洗液澄清（至

11、無(wú)白沫為止），吸管輕吸去洗液，以去除雜蛋白。（每洗1次，離心1次，總共3次）冰浴中用等體積的0.15mol/L、pH =6.5的磷酸緩沖液攪拌洗滌15min，抽濾，重復(fù)洗三次，注意防止樹(shù)脂流失。最后一次抽濾濾除樹(shù)脂水分至干燥。洗脫溶菌酶：樹(shù)脂中加入35ml（等體積）的10（NH4）2SO4溶液攪拌洗脫30 min，抽濾,使溶菌酶從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)，重復(fù)兩次，合并收集洗脫液（留樣），洗脫液過(guò)濾后，準(zhǔn)確量取體積100ml。（留樣B）鹽析:每83mL洗脫液加32g磨細(xì)的固體（NH4）2SO4，本實(shí)驗(yàn)中總量為38.55g。緩慢加入（NH4）2SO4攪拌待完全溶解后保鮮膜封口，置于4冰箱鹽析過(guò)夜。透析:待

12、白色沉淀析出，3000r/min離心15 min，收集沉淀，用去離子水將沉淀洗下并全部溶解（4.5ml去離子水），裝于透析袋中，于去離子水中透析（冰?。?，期間2次更換去離子水，直至用BaCl2檢測(cè)透析完全。透析裝置中加入磁子，于磁力攪拌器中攪拌加快透析速度。去雜質(zhì)蛋白：取出透析袋中的透析液，用0.1mol/L HCl調(diào)整pH4.6，產(chǎn)生少量白色沉淀（留樣D），可能為雜蛋白。3000r/min離心10min，收集上清液（留樣C 20ul）。濃縮：用PEG-20000濃縮上清液至1.5ml（留樣E，20ul，加loading buffer,出現(xiàn)黃色（可能為濃縮時(shí)透析袋中滲入了PEG-20000）。

13、5 61.2.2溶菌酶的純化凝膠溶脹及預(yù)處理:取足量SephaexG-75于燒杯中加入20倍體積洗脫液，置室溫溶脹2天。反復(fù)傾瀉去掉細(xì)顆粒，并泵脫氣；洗脫液用超聲脫氣完全。測(cè)柱床總體（Vt）：取潔凈的玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺(tái)上。在距柱上端約3cm處作一記號(hào)，關(guān)閉柱出水口，加入去離子水，打開(kāi)出水口，液面降至柱記號(hào)處即關(guān)閉出水口，然后用量筒接住柱中去離子水（水面降至層析玻璃篩板），讀出的體積即為柱床總體積Vt=32.5 ml。裝柱：在柱中注入已脫氣洗脫液（約1/3柱床高度），將溶脹好的凝膠與洗脫液1：3混勻稀釋后緩慢傾入柱中，待凝膠沉積約1cm2cm高度后打開(kāi)出水口，常壓平衡，膠面上升到柱記號(hào)處

14、則裝柱完畢，注意裝柱過(guò)程中凝膠不能分層。然后關(guān)閉出水口，靜置過(guò)夜，等凝膠完全沉降。過(guò)夜后的凝膠柱內(nèi)顆粒大小分布均勻，松緊一致，填料微孔中無(wú)氣泡，連接處無(wú)死體積。預(yù)加樣：在膠面上覆蓋一層濾紙，接恒流泵，用2倍床體積的洗脫液以0.5ml/min流速平衡柱子，使柱床穩(wěn)定，期間測(cè)定流速是否與預(yù)設(shè)的一樣，并趕走系統(tǒng)中的氣泡。用另一支相同的層析玻璃管與層析柱對(duì)比得到外水體積為26.5ml。吸去柱上端的洗脫液，打開(kāi)出水口，使殘余液體降至與膠面相切（不要干膠），關(guān)閉出水口。用細(xì)滴管吸取1.0 mL藍(lán)色葡聚糖-2000沿管壁緩慢加入，打開(kāi)出水口，等藍(lán)色葡聚糖滲入膠床與膠面相切時(shí)，關(guān)閉出水口，用少許洗脫液加入柱中

15、，柱上端再用洗脫液充滿后用0.5mL/min的速度開(kāi)始洗脫。收集洗脫液沒(méi)管1.0 ml。手動(dòng)記錄時(shí)間與對(duì)應(yīng)的OD280并繪制曲線。葡聚糖色帶狹窄、均勻平整，層析柱性能良好。藍(lán)色葡聚糖洗下來(lái)之后，用洗脫液(1倍床體積)繼續(xù)平衡一段時(shí)間。 加樣和洗脫：按加葡聚糖的操作方法加入溶菌酶樣品溶液1.0 mL，用Bio-Rad層析系統(tǒng)設(shè)置洗脫條件，以約0.5mL/min的速度洗脫并收集洗脫液每管0.5 ml。手動(dòng)記錄時(shí)間及檢測(cè)到的洗脫液在A280nm處的吸光值。將收集管編號(hào)置于4 冰箱保存.合并洗脫峰內(nèi)的收集管中的洗脫液。（預(yù)先測(cè)得記錄儀至部分收集器的死體積，出現(xiàn)峰值處的收集管延遲死體積所占的管數(shù)才為峰值

16、處樣品。）1.2.3溶菌酶純度鑒定制膠：電泳玻璃板洗凈，并把玻璃板在灌膠支架上固定好。將12%的分離膠加入到電泳槽內(nèi)的兩玻璃板之間，到上口約3cm止，再加一薄層蒸餾水填滿，趕走氣泡，水與膠面分開(kāi)并且界面清晰。靜置20min，將水倒去。將 4%的濃縮膠連續(xù)平穩(wěn)加入至剛剛沒(méi)過(guò)薄板，趕走氣泡。迅速?gòu)淖笾劣也迦胧嶙?，不要留下氣泡，靜置30min。（取下膠版放入PE手套，加適量蒸餾水4保存）點(diǎn)樣：將樣品與loading Buffer 1:1混勻。將上述處理的各級(jí)分樣品和蛋白Marker分別加到點(diǎn)樣槽中5ul。接通電源先恒壓130V電泳，待各樣品從濃縮膠進(jìn)入分離膠后恒壓220V繼續(xù)電泳，直到溴酚藍(lán)距凝膠邊

17、緣5mm是停止電泳，關(guān)閉電源。染色及脫色：電泳完畢，將膠板從玻璃板上取下，小心用塑料板開(kāi)啟電泳厚板和薄板，使膠片完整取下。用塑料板切去濃縮膠部分，分離膠放入大的培養(yǎng)皿用考馬斯亮藍(lán)R-250搖床染色20min,回收考馬斯亮藍(lán)R-250，在培養(yǎng)皿中加脫色液脫色過(guò)夜（期間多次更換脫色液直至背景清楚，條帶清晰），并對(duì)電泳圖譜拍照記錄。1.2.4蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。7先用牛血清清蛋白（BSA）及考馬斯亮藍(lán)G-250制作蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算目的蛋白濃度。附：具體組分加樣量見(jiàn)附錄II2結(jié)果和分析2.1凝膠層析純化圖1和圖2分別為藍(lán)色葡聚糖和蛋白樣品

18、的凝膠層析洗脫圖譜。圖1層析條件流速0.5ml/min,每2min收集一管。曲線呈明顯的尖峰，而且范圍狹窄，說(shuō)明層析柱性能很好。OD280在7、8、9號(hào)管出現(xiàn)峰值，根據(jù)收集管顏色判斷9、10、11號(hào)管為峰值，由此推斷從經(jīng)過(guò)紫外檢測(cè)器測(cè)得OD值到由部分收集器收集到該樣品推遲體積為2ml。圖1 藍(lán)色葡聚糖凝膠層析洗脫圖譜圖2上可以看出，在樣品峰值之前有其他的雜蛋白洗脫出來(lái)，可能為清蛋白、朊蛋白或PEG濃縮時(shí)混入的PEG。在層析過(guò)程中第25分鐘時(shí)出現(xiàn)重大失誤，發(fā)現(xiàn)凝膠柱干裂，停止洗脫，雖然記錄到峰值，但由于存在2ml延遲，未收集到峰值處洗脫液，只收集到第19和20min的洗脫樣品（24和25號(hào)管收集

19、液,），該處樣品處于多個(gè)蛋白洗脫峰之間，由此推斷成分復(fù)雜，目的蛋白不純。 圖2蛋白樣品凝膠層析洗脫圖譜2.2蛋白質(zhì)純度圖3和圖4分別為凝膠層析純化之前和之后的SDS-PAGE電泳圖譜。圖3中由于留樣A（樹(shù)脂吸附后蛋白上清液）濃度太大并可能部分發(fā)生凝固，且未稀釋，影響了蛋白Maker及其他樣品泳道的效果。但仍然可以分辨出蛋白Maker的六條帶，最下面一條為溶菌酶的條帶，分子量為143kD。對(duì)應(yīng)的4號(hào)和6號(hào)泳道蛋白樣品中分離得到的溶菌酶的條帶顏色較深，證明粗提取得到了濃度較高的溶菌酶，但含有大量雜蛋白，主要為卵清蛋白（45kD）、卵白蛋白（66.4 kD）及其他雜蛋白，還含有少量的PEG（20.1

20、kD處）。留樣A顯然含有大量雜志蛋白，分子量主要分布在44.3到97.2 kD之間。從圖4可以看出，6號(hào)和7號(hào)泳道的第19和20min的洗脫樣品即24和25號(hào)管收集液，因?yàn)樘幱陔s蛋白峰值和溶菌酶峰值之間，成分復(fù)雜，顯然是不純的，主要有兩條帶，除溶菌酶外還有少量卵清蛋白。8號(hào)泳道為借用其他組較好的層析后樣品，可以看出純化效果較好，五雜蛋白。9號(hào)泳道的留樣A稀釋100倍后電泳效果較好，主要成分為雜蛋白。兩圖中雜蛋白樣品的條帶中也有少量溶菌酶，證明溶菌酶在每一步都會(huì)不可避免的損失。隨著純度越高，得率越低。條帶顏色的深淺一方面與酶濃度有關(guān)，另一方面與染料的選擇及濃度和染色時(shí)間有關(guān)，一般染料濃度越高，染

21、色時(shí)間越長(zhǎng)，染色越深，但脫色也更難。在本試驗(yàn)中，加樣量在5 L 左右、固定染色20min 比較合適，脫色時(shí)在搖床上洗脫過(guò)夜效果最好。圖3溶菌酶產(chǎn)品的SDS-PAGE電泳圖譜1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker2.留樣A （未稀釋）樹(shù)脂吸附后蛋白上清液3.留樣B10（NH4）2SO4溶液洗脫樹(shù)脂的洗脫液4.留樣C透析液去雜蛋白離心后的樣品5.留樣D透析液調(diào)節(jié)PH至4.6后產(chǎn)生的白色雜蛋白6.留樣EPEG濃縮后的樣品圖4層析后溶菌酶產(chǎn)品的SDS-PAGE電泳圖譜1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker2.留樣B10（NH4）2SO4溶液樹(shù)脂的洗脫液3.留樣C透析液去雜蛋白離心后的樣品4.留樣D透析液調(diào)節(jié)PH至4.6后產(chǎn)生的白

22、色雜蛋白5.留樣EPEG濃縮后的樣品6.層析24號(hào)管收集樣品7.層析25號(hào)管收集樣品8.其他實(shí)驗(yàn)小組層析較好的收集樣品9.留樣A（稀釋100倍）樹(shù)脂吸附后蛋白上清液2.3蛋白質(zhì)濃度圖5所示為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)R達(dá)0.985，表明線性關(guān)系較高，符合實(shí)驗(yàn)要求。利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算樣品的溶菌酶濃度、得率等。圖5蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線提取的蛋白樣品稀釋10倍后的OD595=0.2905，代入回歸方程得到該蛋白樣品濃度為3.16mg/ml。由此計(jì)算蛋清中溶菌酶的得率為： 3.16mg/ml 1.5ml得率=_=0.0474mg/100ml100ml但據(jù)參考文獻(xiàn)，蛋清溶菌酶提取率可達(dá)0.4g/100ml。5

23、但采用本實(shí)驗(yàn)的提取方法, 實(shí)驗(yàn)的酶得率非常低。可能原因是離子交換劑選擇的不同，提取個(gè)步驟中損失較多。張文會(huì)等使用將D125陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的Na+型、H+型混合，本實(shí)驗(yàn)使用724型酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，吸附能力可能存在一定差異。在粗提取中用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)PH時(shí)局部過(guò)酸使部分溶菌酶變性凝固；在蛋清的樹(shù)脂吸附使用磁力攪拌而不是手動(dòng)攪拌，影響了吸附效果，電泳結(jié)果顯示有微量的溶菌酶殘留在蛋清上清液中；在去除雜蛋白的過(guò)程中流失了少量樹(shù)脂也損失了溶菌酶；其他個(gè)步驟中都有少量含溶菌酶的溶液殘留在容器壁上，造成溶菌酶損失。3 討論3.1 樹(shù)脂吸附實(shí)驗(yàn)后得知在陽(yáng)離子交換層析吸附過(guò)程中,不能用磁力攪拌器攪拌

24、, 需要手動(dòng)攪拌,且不能攪動(dòng)太快，不能出現(xiàn)泡沫。因?yàn)榇帕嚢杵魇强磕Σ亮嚢? 易將樹(shù)脂打碎, 影響溶菌酶的吸附效果。本實(shí)驗(yàn)吸附過(guò)程使用了磁力攪拌器攪拌，對(duì)實(shí)驗(yàn)造成了影響，直接影響了溶菌酶的得率。3.2 調(diào)節(jié)PH及鹽析在用調(diào)節(jié)蛋清PH時(shí)使用了1mol/l的HCl，可能酸度過(guò)高滴加速度過(guò)快，導(dǎo)致了部分蛋白局部過(guò)酸變性，影響的得率。吸取這次教訓(xùn)，在用硫酸銨固體鹽析溶菌酶之前，要把硫酸銨固體結(jié)晶研磨成細(xì)微的粉末狀，加入時(shí)要緩慢加入，不斷攪拌防止局部鹽度過(guò)高導(dǎo)致蛋白局部變性。由此可見(jiàn)，在提取蛋白過(guò)程中加入任何溶液或固體都要極緩慢的加入，并且攪拌，防止局部濃度過(guò)高對(duì)蛋白活性產(chǎn)生影響。3.3透析與濃縮因?yàn)?/p>

25、洗脫溶解蛋白樣品時(shí)沒(méi)能控制好蒸餾水用量，且透析過(guò)程使樣品溶液體積進(jìn)一步增加，因此用PEG-20000濃縮蛋白樣品。可能是由于透析袋沒(méi)有扎緊或透析袋本身的問(wèn)題，PEG-20000進(jìn)入到透析袋，與蛋白樣品混在一起，這樣必然影響目的蛋白的純度并可能影響溶菌酶的活性。3.4溶菌酶凝膠層析 本實(shí)驗(yàn)?zāi)z層析中凝膠柱是自己手動(dòng)填充的，這一步非常重要，裝柱的質(zhì)量直接關(guān)系到分離樣品的成敗。柱子應(yīng)固定在穩(wěn)定的支架上,并保證其垂直，同時(shí)需尋找合適體積的洗脫液與凝膠灌入柱中，注意不能出現(xiàn)斷層現(xiàn)象，再經(jīng)常壓平衡過(guò)夜，加壓平衡2小時(shí)，用藍(lán)色葡聚糖-2000檢驗(yàn)，藍(lán)色色帶狹窄均勻，才算順利制備出凝膠柱。本實(shí)驗(yàn)?zāi)z柱制備非常

26、成功，凝膠柱性能良好。層析過(guò)程所用的洗脫液一定要超聲脫氣1小時(shí)以上，脫氣后不要震蕩，不要傾倒混合，一面在此混入氣體，已脫氣的要用保鮮膜封口，以免混入雜質(zhì)。層析系統(tǒng)的入口管要保證完全沒(méi)入洗脫液。實(shí)驗(yàn)最大的遺憾是在樣品層析時(shí)發(fā)生凝膠柱干裂，雖然已記錄到峰值，但由于體積延遲未收集到峰值處電泳純的樣品。分析原因可能是系統(tǒng)接口處漏氣，凝膠柱產(chǎn)生負(fù)壓而進(jìn)入空氣。當(dāng)時(shí)兩名同學(xué)忙于記錄數(shù)據(jù)及收集樣品，未及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題。這是一次深刻的教訓(xùn)，任何實(shí)驗(yàn)中如果出現(xiàn)一點(diǎn)差錯(cuò)，就可能前功盡棄，3.5 SDS-PAGE電泳電泳是本實(shí)驗(yàn)的眼睛，用來(lái)檢測(cè)每一步驟中樣品是否存在，純度如何，以及去除的雜蛋白成分如何，多條電泳條帶進(jìn)行

27、多重、兩兩比較、橫向及縱向比較，幫助分析提取效果，凝膠層析純化及蛋白質(zhì)得率。出現(xiàn)問(wèn)題可以從電泳圖譜上尋找問(wèn)題的根源。電泳過(guò)程中還要注意的是點(diǎn)樣的蛋白樣品的濃度。如果濃度較大的樣品需要適當(dāng)稀釋，如本實(shí)驗(yàn)留樣A濃度較大，第一次電泳是未稀釋，導(dǎo)致泳道擁擠，影響了整個(gè)膠版上其他的泳道。第二次電泳把留樣A稀釋了100倍，得到較好的電泳圖譜。還要注意如果蛋白樣品已大量發(fā)生凝固，不能通過(guò)電泳分析純度，因?yàn)槟痰牡鞍谉o(wú)法在膠版內(nèi)運(yùn)動(dòng)。3.6實(shí)驗(yàn)心得從以上分析看出本次實(shí)驗(yàn)前面大部分都很順利，只是最后層析結(jié)果令人遺憾。總體上還算成功，在實(shí)驗(yàn)組人員較少，每天平均2-3個(gè)人的情況下作出這樣的成果實(shí)屬不易。當(dāng)然這也部分歸功于前期準(zhǔn)備較充分，人員安排恰當(dāng)，節(jié)省了等待時(shí)間。從實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、實(shí)驗(yàn)操作到實(shí)驗(yàn)總結(jié)我都全程參與，既要從宏觀上把我整個(gè)實(shí)驗(yàn)，又要從細(xì)節(jié)上弄清每一步的實(shí)質(zhì)，這對(duì)我來(lái)說(shuō)是一個(gè)很好的鍛煉。參加實(shí)驗(yàn)的同學(xué)從中學(xué)到了很多東西，實(shí)驗(yàn)技巧得到提升，也明白了任何實(shí)驗(yàn)不會(huì)一帆風(fēng)順，需要實(shí)驗(yàn)者不斷地探索。同學(xué)之間關(guān)系更加融洽，團(tuán)結(jié)，協(xié)調(diào)，充滿著科研的氛圍。身為本實(shí)驗(yàn)小組組長(zhǎng)我倍感欣慰。參考