PCR技術(shù)及其應(yīng)用

1、第八章 PCR技術(shù)及其應(yīng)用,前言 PCR技術(shù)簡史 第一節(jié) PCR技術(shù)原理和工作方式 第二節(jié) PCR產(chǎn)物的克隆 第三節(jié) PCR擴增未知DNA片段 第四節(jié) 與反轉(zhuǎn)錄相關(guān)的PCR 第五節(jié) PCR產(chǎn)生DNA指紋 第六節(jié) 實時定量PCR,本課件是在網(wǎng)絡(luò)資源基礎(chǔ)上改進而成，在此對有關(guān)人士特致感謝！,一、PCR的基本原理,類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。 首先待擴增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。,第一節(jié) PCR

2、技術(shù)原理和工作方式,Denature template DNA by heat (95 oC),Target Sequence,Target Sequence,模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至95左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；,PCR Cycle - Step 1 ,PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,P

3、rimer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；,PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymeras

4、e,引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTPs為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈。,End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,7,1 緩沖液,10mmol/L Tris-HCl，50mmol/L KCl，pH=8.3-9.0(室溫時約為

5、7.2)，還可能有添加劑、共溶劑等。廠商一般以10倍的貯存液形式提供。 Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。 廠商一般以25mmol MgCl2+形式提供，使用濃度為0.5mmol/L至2.5mmol/L反應(yīng)體系。 Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。 Mg2+可與負離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTPs、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。,二、PCR反應(yīng)體系,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,8,2、脫氧三磷酸核苷(dNTPs) dATP、dGTP、dCTP、dTTP四種的等量混合物。 廠商一般提供為10mmol/L或4mm

6、ol/L的貯存液，使用濃度為0.2mmol/L左右。 dNTPs濃度取決于擴增片段的長度。 濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量。 dNTPs可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,9,PCR引物的設(shè)計一般原則 1.引物長度一般以1830bp為宜，過短則降低特異性，過長則會引起引物間的退火而影響有效擴增，同時也增加引物合成的成本。 2.解鏈溫度(Tm值)很重要，直接決定了擴增中可使用的退火溫度(Ta值)的高低，較高時特異性增加，但退火效率下降，過低時退火效率較高，但特異性下降。兩條引物間的Tm值越

7、接近越好。 計算Tm值的方法很多，簡易公式為Tm=4(G+C)+2(A+T)，適于短于20nt的引物。長引物的Tm值計算公式見書，但比實際值往往偏低。 精確的Tm計算需要考慮緩沖液的鹽離子濃度和引物內(nèi)部的相鄰堿基的動力學(xué)參數(shù)。,3、引物 一般溶成10 mol/L的貯存液，使用濃度為0.1-0.5 mol/L。 濃度過低則產(chǎn)量低，過高則易導(dǎo)致錯配，PCR特異性下降。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,10,3.避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免序列內(nèi)有較長的回文結(jié)構(gòu)，使引物自身不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 4.要避免兩個引物間特別是3末端堿基序列互補以及同一引物自身3末端堿基序列互補的，使它

8、們不能形成引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 5.G/C和A/T堿基均勻分布，G+C含量在4060%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。 6.引物3末端堿基一般應(yīng)與模板DNA嚴格配對，并且3末端為G、C或T時引發(fā)效率較高，但3要避免較密的C+C或G+C連排。 7.引物5末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無關(guān)的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列、ATG起始密碼子或啟動子序列等)，便于克隆和表達，但其保護堿基有一定的要求。 8.引物的堿基順序不能與非擴增區(qū)有同源性。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,11,4、模板 單、雙鏈DNA均可。 一個PCR反

9、應(yīng)中104至107個模板分子可獲得較理想的效果，但由于PCR較靈敏，更少的模板分子數(shù)在循環(huán)數(shù)增加時也會得到大量擴增。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類，模板純度不高往往是限制PCR擴增的重要因素。 不同屬性的模板所加的理想的量不同，哺乳動物基因組總DNA、酵母DNA、細菌DNA、質(zhì)粒、M13噬菌體作模板時，需要的量分別為1g、10ng、1ng、1pg和1%噬菌斑。 模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,12,5、耐熱性的DNA聚合酶 有多種，均從耐熱性的細菌中分離出來，均耐高溫，普遍具有53聚合酶和53外切酶活性

10、，但在35外切酶活性(proofreading, 校正功能，決定保真度, fidelity)、耐熱性和附加功能上有差異。酶量增加使產(chǎn)量增加，但反應(yīng)特異性下降，酶量過少雖能保證特異性，但影響產(chǎn)量。常用的有： 1）Taq DNA聚合酶：最常用，來自嗜熱水生菌(Thermus aquaticus)，95時的半衰期為40分鐘，75時活性最強，沒有校正功能，錯配率為8.910-5至1.110-4。標準使用濃度一般為2.5 U/50 l。 2）Tth DNA聚合酶：來自嗜熱熱細菌(Thermus thermophilus) HB8，95時的半衰期為20分鐘，74時進行擴增，除在Mg2+催化下進行常規(guī)的PC

11、R擴增外，還具有在MnCl2催化下的高溫反轉(zhuǎn)錄功能。 3）Vent DNA聚合酶：來自嗜熱高溫球菌(Thermococcus litoralis)，100時的半衰期為1.8小時，具校正功能，保真度比Taq高5-15倍。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,13,4）Pwo DNA聚合酶：來自嗜熱細菌(Pyrococcus woesei)，100時的半衰期大于2小時，有校正功能，保真度高。 5）Pfu DNA聚合酶：來自激烈熱球菌(Pyrococcus fariosus)，具有極高的熱穩(wěn)定性，目前公認是最保真的。 6）混合DNA聚合酶：將具有校正功能的酶與Taq酶按一定比例混合，

12、具有類似Taq的強啟動合成能力，同時又有一定的保真度，而且具有一定的擴增長片段的能力。 Taq酶的延伸速度為1-2kb/min，但具有校正功能的酶的延伸速度要小些，一般只能按照600-700bp/min來預(yù)計。 PCR擴增不是絕對真實的，因為具校正功能的DNA聚合酶只是比不具校正功能的DNA聚合酶相對保真而已，錯配率相差在兩個數(shù)量級以內(nèi)。 一些具校正功能的酶作PCR時，即使產(chǎn)物短也可能得不到產(chǎn)物，原因不明，估計可能與該酶的外切活性將引物降解有關(guān)。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,14,三、PCR反應(yīng)程序 1、常規(guī)程序： 94左右預(yù)變性幾十秒至幾分鐘； 94左右變性10秒至1

13、分鐘； 50-65左右退火30秒至1分鐘； 20-35個循環(huán) 72左右延伸30秒至幾分鐘； 72左右最后延伸和加尾3-10分鐘； 4-25保持3分鐘或更長。 2、退火和延伸溫度： 退火溫度Ta值由Tm值決定，多數(shù)情況下Ta采用Tm減去3-5，較高時特異性強但退火效率低，較低時退火效率增加而非特異擴增增加，可根據(jù)實際研究目的采用高特異性或低特異性退火。 當退火溫度高到與延伸溫度接近時，可以將退火和延伸溫度合為一個，這時PCR就由三步法變成了兩步法。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,15,3、反應(yīng)時間： 變性步驟一般為5秒至1分鐘，變性溫度高時時間短，低時時間長，簡單模板時間短

14、，復(fù)雜模板時間長，尤其是直接用細胞作模板時預(yù)變性和變性時間都要長。 退火時間一般為30秒至1分鐘即可，引物結(jié)構(gòu)好的時間短，引物結(jié)構(gòu)差的退火時間宜長。 延伸時間從半分鐘到10分鐘以上不等，由擴增片段的長度和DNA聚合酶的延伸速度共同決定。Taq擴增時按1kb/min計算，具校正活性的酶則按0.6-0.7kb/min計算。 4、循環(huán)次數(shù)： 多數(shù)為25-35，主要取決于模板屬性、模板豐度、引物退火效率DNA聚合酶的擴增能力。裸露DNA、雜質(zhì)少、高豐度模板、引物結(jié)構(gòu)好、DNA聚合酶擴增能力強時，循環(huán)數(shù)宜少，以盡量減少突變。否則宜多，以保證獲得必要的PCR產(chǎn)物量。 PCR擴增的后期循環(huán)易進入平臺期，實際

15、上是由于PCR擴增條件的逐步劣化而引起的。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,16,5、PCR反應(yīng)液的配制： 加試劑順序：雙蒸水、緩沖液、MgCl2、dNTPs、正向引物、反向引物、模板、DNA聚合酶。加DNA聚合酶前應(yīng)將其余試劑混勻后再加入酶。加完酶后應(yīng)先放回酶，然后再混勻PCR成分，覆蓋礦物油，并上機。 酶要用冰盒取放，禁止因手的接觸或暴露于空氣中而使酶升溫。 第一次使用各試劑時要輕柔充分混勻。 正確保存各種試劑，尤其是要避免核酸因反復(fù)凍融而降解，各試劑宜分裝成適量的小管。 熱啟動(hot start)：購買的DNA聚合酶偶連有特異抗體，只有當溫度升至68度或更高時，抗體

16、才會失活并釋放出DNA聚合酶，從而增加PCR的特異性，減少低溫下尤其是配制PCR體系過程中由于引物錯配而帶來的非特異性擴進。但啟動的DNA聚合酶的價格較貴。早期有蠟珠法。 冷啟動(cool start)：在冰水浴上配制PCR成分，然后立即放到已運行并暫停于預(yù)變性之初的PCR儀的block上面，直接進入高溫變性和隨后的PCR擴增。 延遲成分法：扣留一種PCR關(guān)鍵成分，直到已進入預(yù)變性后才加入。,PCR中其它注意的事項,1.防止污染 試劑小量分裝 吸頭及EP管一次性使用 器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作 2.設(shè)立對照： 陽性對照： 陽性模板 陰性對照： 陰性模板、無模板 試劑對照： 除模板外的所有組

17、分,第二節(jié) PCR產(chǎn)物的克隆,一、在PCR產(chǎn)物兩端添加限制性酶切位點 在PCR引物的5加上根據(jù)需要而設(shè)計的酶切位點，PCR產(chǎn)物內(nèi)部沒有該切點。 在酶切位點的5加3個左右的保護堿基，基數(shù)目多少取決該酶的性質(zhì)。 PCR物產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收后，直接用限制酶進行切割，純化后與目標載體連接重組。 該法適用于直接將PCR產(chǎn)物克隆到表達載體進行功能研究，但構(gòu)建好的表達載體必須測序才能證明PCR產(chǎn)物的身份正確且沒有突變。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,20,二、TA克隆 這是目前最通行的PCR產(chǎn)物克隆方法，基本思路是先將PCR產(chǎn)物與特制的T載體進行連接重組，測序證明正確無誤后，再從T載體上

18、亞克隆到表達載體上進行功能研究。 Taq酶PCR產(chǎn)物的特點：該酶具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，通常在其產(chǎn)物DNA分子每條鏈的3末端加上一個突出的A。 T載體：通過特定制作技術(shù)制作的在多克隆位點中間已開環(huán)的質(zhì)粒載體，其每條鏈的3末端具有一個突出的T，如promega公司的pGEM T-easy。 TA克隆：將3末端具一個突出的A的PCR產(chǎn)物與T載體連接重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對鑒定為陽性的重組克隆子的多克隆位點區(qū)的插入片段進行測序，然后再亞克隆到其它載體進行功能研究等。 pCR-TOPO技術(shù)：T載體上已經(jīng)偶連有拓撲異構(gòu)酶，因此PCR產(chǎn)物無需DNA連接酶而可直接與該T載體進行快速連接重組。,2020/6/24,

19、西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,21,三、平末端DNA片段的克隆 所有具有校正功能的DNA聚合酶擴增出來的PCR產(chǎn)物均為平末端，有兩種克隆思路： 一是在PCR完成后加入適量的Taq酶并在72保溫20-30分鐘，使PCR產(chǎn)物每條鏈的3末端加上一個突出的A后進行TA克隆。 二是將平末端PCR產(chǎn)物與平末端進行載體連接克?。?1、pCR-Script Amp SK(+)克隆載體：連接體系中除加有T4 DNA連接酶外，還加有限制酶Srf，連接過程中載體自連的產(chǎn)物總是被Srf切開，而重組載體確不能被切開，轉(zhuǎn)化子中重組子的比例就較高。 2、pCR-Blunt克隆載體：載體的lacZ基因下游融合了一個致死基因

20、ccdB，載體自連轉(zhuǎn)化的大腸桿菌不能存活，重組載體的轉(zhuǎn)化子則能長成菌落，因為致死基因已被插入失活。,2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,22,四、長片段DNA的PCR擴增 長片段DNA的PCR擴增效率較低，因為有許多降低PCR效率的因素。 策略有： 一是改進PCR緩沖液體系。 二是采用混合酶，尤其是Taq與Pwo的混合酶可擴增40kb左右的片段。,一、反向PCR (reverse PCR),是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。 可對未知序列擴增后進行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,

21、擴增基因文庫的插入DNA；建立基因組步移文庫。,已知序列,未知序列,未知序列,第三節(jié) PCR擴增未知DNA片段,二、利用接頭的PCR/錨定PCR (anchored PCR),將基因組總DNA用限制酶切割，然后將序列已知的接頭連接到酶切片段的兩端，以提供PCR的錨定引物，該錨定引物與已知序列中的基因特異引物(gene-specific primer, GSP)組合后，用于目標基因側(cè)翼序列的擴增。 為了減少錨定引物與錨定引物之間組合后構(gòu)成的非特異擴增，可以將接頭替換為一端平、另一端為5突變的結(jié)構(gòu)，且對3凹陷的堿基實行亞氨基修飾。,不對稱PCR 目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。 方法：采用兩種

22、不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。 用途：制備核酸序列測定的模板 制備雜交探針 基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究,三、熱不對稱交錯PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR),2020/6/24,西南大學(xué)生物技術(shù)專業(yè) 基因工程,26,TAIL-PCR： 利用特異引物與隨機引物組合后進行PCR，產(chǎn)生3種產(chǎn)物： 型產(chǎn)物：特異引物和隨機引物共同延伸的產(chǎn)物； 型產(chǎn)物：特異引物單獨延伸的產(chǎn)物； 型產(chǎn)物：隨機引物單獨延伸的產(chǎn)物。 5輪高嚴謹度PCR，形成特異引物介導(dǎo)的目標序列的單鏈擴增； 1個低嚴謹度PCR循環(huán)，將目標序列轉(zhuǎn)換為雙鏈； 高嚴謹度與低嚴謹度循環(huán)交錯進行，共14個超級循環(huán)； PCR產(chǎn)物稀釋1000倍； 換用新的特異引物與隨機引物進行第二次擴增，10個超級循環(huán)； PCR產(chǎn)物稀釋1000倍； 換用第三特異