微生物非培養(yǎng)技術(shù)的未知種群檢測與功能解析.ppt

1、25.06.2020,1,歡迎各位同學(xué) 批評指正！,25.06.2020,2,馬放,微生物非培養(yǎng)技術(shù)的未知種群 檢測與功能解析,25.06.2020,3,主要內(nèi)容,傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn) 現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述 rDNA序列同源性微生物鑒定及其種群組成分析中的應(yīng)用 PCR擴增技術(shù)的應(yīng)用 核酸探針雜交技術(shù)的應(yīng)用 DNA指紋圖譜技術(shù),25.06.2020,4,傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn),利用傳統(tǒng)的微生物純培養(yǎng)技術(shù)獲得單一的微生物包括純種分離和培養(yǎng)兩個過程。純種分離的方法很多，可歸納為兩大類：一類是單細胞或單孢子分離；一類是單菌落分離。,25.06.2020,5,微生物與農(nóng)業(yè)

2、 微生物與工業(yè) 微生物與醫(yī)學(xué) 微生物與環(huán)境保護 微生物與能源開發(fā),傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn),傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)的現(xiàn)狀 微生物與人類社會,25.06.2020,6,在分子生物學(xué)誕生的20多年時間里，人們運用基因工程的幾大基本技術(shù)：凝膠電泳技術(shù)、核酸分子雜交技術(shù)、細菌轉(zhuǎn)化技術(shù)、DNA序列分析技術(shù)及基因定點突變技術(shù)，對食品、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)及環(huán)境保護等各個領(lǐng)域的應(yīng)用微生物進行基因改造，實現(xiàn)了人為改造或修飾生物遺傳特性并創(chuàng)造生物新性狀的夢想。,傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn),傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)的現(xiàn)狀 微生物與現(xiàn)代分子生物學(xué),25.06.2020,7,基因改造后的工程菌,傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的

3、挑戰(zhàn),25.06.2020,8,傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn),隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，尤其是可以利用16S rRNA技術(shù)鑒定純培養(yǎng)物種的歸屬，大大豐富了我們所獲得的環(huán)境微生物種類及遺傳多樣性。從分子水平上對微生物進行基因研究，為探索微生物個體以及群體間作用的奧秘提供了新的線索和思路。,25.06.2020,9,純培養(yǎng)技術(shù)使得研究者擺脫了多種微生物共存的復(fù)雜局面，從而能夠不受干擾地對單一菌落進行研究，確保了人類對微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理和遺傳特性的認識。但是，隨著研究的不斷進行，這一技術(shù)暴露出巨大的局限性平板計數(shù)異常 (Plate Countanomaly)，即環(huán)境中微生物實際數(shù)量同平板菌落計

4、數(shù)之間存在巨大差異。,傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn),25.06.2020,10,造成平板計數(shù)異常的原因： 由于實驗室難以再現(xiàn)微生物的自然生存條件 大種群微生物易形成優(yōu)勢種進而抑制了小種群的生長,傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn),因此，利用傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)總是重復(fù)篩選到相同的微生物，而多數(shù)難以被常規(guī)實驗室方法培養(yǎng)的微生物被稱為未培養(yǎng)微生物或不可培養(yǎng)微生物 (Uncultured Microorganism) 。,25.06.2020,11,微生物的自然多樣性 結(jié)構(gòu)多樣性 代謝多樣性 行為多樣性 進化多樣性 生態(tài)多樣性,傳統(tǒng)環(huán)境微生物分析方法面臨的挑戰(zhàn),25.06.2020,12,傳統(tǒng)環(huán)境微生

5、物分析方法面臨的挑戰(zhàn),科學(xué)家根據(jù)現(xiàn)有的科學(xué)證據(jù)推測微生物種類數(shù)目應(yīng)該在105-106。 采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)對不同生境微生物可培養(yǎng)性的驗證來看，海水中可培養(yǎng)的微生物約占0.001%-0.1%，淡水約占0.25%，土壤約占0.3%，活性污泥約占1%-15%左右。 許多實驗室證實，有些微生物處于一種活的但不可培養(yǎng) (Viable but Nonculturable，VBNC) 的狀態(tài)。 據(jù)報道，至少有16個屬的30種細菌屬于此類微生物。,因此，純培養(yǎng)技術(shù)的局限性已經(jīng)成為研究微生物自然生態(tài)和多樣性的主要瓶頸，這迫使我們不得不重新審視傳統(tǒng)的純培養(yǎng)技術(shù)。,25.06.2020,13,The omics

6、 組學(xué)技術(shù),Genome Transcriptome Proteome Metabolome,現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,系統(tǒng)生物學(xué),25.06.2020,14,現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,組學(xué)技術(shù)在微生物群落結(jié)構(gòu)解析方面的應(yīng)用,25.06.2020,15,現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,微生物非培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展,微生物學(xué)家運用非培養(yǎng)方法來研究自然界中的微生物，即避開傳統(tǒng)的微生物分離培養(yǎng)方法，利用DNA含有不同的信息內(nèi)容和信息容量這一特性，直接研究細胞的DNA以獲取自然界微生物的多樣性及群落組成的信息，及從分子生態(tài)學(xué)的角度研究未培養(yǎng)微生物在環(huán)境中的變化。非培養(yǎng)技

7、術(shù)的主要任務(wù)在于：革命性地改變了人們對原核生物多樣性和自然界微生物群落組成的理解，并提供開發(fā)不可培養(yǎng)微生物資源的新途徑。,25.06.2020,16,現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,非培養(yǎng)技術(shù)的分類,25.06.2020,17,現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,以群落分析為目的的非培養(yǎng)技術(shù),大尺度的分析群落DNA的非培養(yǎng)法有DNA-DNA復(fù)性和G+C含量分析兩種方法，它們能分別給出所研究微生物群落總的基因多樣性和結(jié)構(gòu)的改變。,DNA指紋技術(shù),大尺度群落分析,變性梯度凝膠電泳 (DGGE) 擴增rDNA限制性分析 (ARDRA) 末端限制性片段長度多態(tài)性 (T-RFLP) 核糖體基因間序列分析 (

8、RISA),25.06.2020,18,現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,以生物材料獲取為目的的非培養(yǎng)技術(shù),1. 基于目標(biāo)瞄定的PCR直接擴增法，即不需知道基因的序列，僅根據(jù) 保守序列設(shè)計引物，就可以直接從環(huán)境DNA中擴增到目的基因，該 法方便、簡單、快速但不易獲得新型基因。,2. 宏基因組技術(shù)，即通過對環(huán)境DNA構(gòu)建插入基因組文庫，并利用活 性或序列篩選的方法以獲取目標(biāo)基因的新技術(shù)。,宏基因組技術(shù)不僅可以將系統(tǒng)發(fā)育信息和未培養(yǎng)群落成員隱含的功能信息以及未被發(fā)現(xiàn)的有意義的新的功能基因聯(lián)系起來，而且還可用于共生關(guān)系或其他簡單群落中未培養(yǎng)群落的全基因組測序，有利于我們重新認識有意義但未被開發(fā)的生物學(xué)

9、過程。,25.06.2020,19,現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,微生物非培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)勢與局限性,微生物非培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)越性,(1) 發(fā)現(xiàn)新種 (2) 評價具有重要生態(tài)地位的種類 (3) 古菌的研究 (4) 菌種與環(huán)境功能的關(guān)聯(lián),非培養(yǎng)技術(shù)也有其缺陷和偏差。比如，克隆文庫測序不完全，細胞裂解程度的不同、特定細胞DNA被優(yōu)先擴增以及由PCR的循環(huán)步驟帶來的一些分析難題影響著克隆文庫的應(yīng)用。,25.06.2020,20,現(xiàn)代環(huán)境微生物分析方法發(fā)展概述,微生物非培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用前景,(1) 微生物多樣性程度的測定 (2) 生態(tài)學(xué)和進化 (3) 目標(biāo)基因的獲取 (4) 非培養(yǎng)微生物特征的鑒定 (5) 系

10、統(tǒng)水平理解微生物群落動力學(xué),25.06.2020,21,rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析,研究DNA多態(tài)性的最直接、有效的途徑就是測定DNA的序列，但測序是一項極為復(fù)雜和艱難的工作，同時也需要昂貴的設(shè)備。目前，在針對微生物研究的DNA指紋技術(shù)中，最常見的靶基因是16S rDNA和核糖體DNA的基因間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)。,細菌的rRNA 組成,25.06.2020,22,細菌的23S rDNA、16S rDNA和5S rDNA分別含有約為2900個、1540個和120個呈現(xiàn)不同堿基對排列的核苷酸。,rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析,

11、Carl Woese,上世紀(jì)60年代末，Woese開始采用寡核苷酸編目法對生物進行分類，他通過比較各類生物細胞的rDNA特征序列，認為16S rDNA及其類似的rDNA基因序列作為生物系統(tǒng)發(fā)育指標(biāo)最為合適。,25.06.2020,23,rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析,rDNA序列的微生物鑒定主要依據(jù)為： rDNA是生物體細胞中必要的成分，具有功能同源性且最為古老，而且同時含有保守序列和可變序列，分子大小適合操作，它的序列變化與進化距離相適應(yīng)等。,25.06.2020,24,用于一些DNA指紋分析方法（如DGGE/TGGE）的引物主要是針對16S rDNA為靶基因的引物，通過它的分析可以

12、直接鑒定到屬或種。根據(jù)核糖體16S rDNA結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，在所測定的區(qū)域中包括了V1、V2、V3、V8共8個高變區(qū)，尤其是V3這一高變區(qū)，由于其進化速度相對較快，其中所包含的信息足夠用于物種屬及屬以上分類單位的比較分析。常用引物包括341F/534R（V3區(qū)）、968F/1401R（V6-V8區(qū)）、63F/534R（V1-V3區(qū)）、341F/926R（V3-V5區(qū)）等。,rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析,16S rDNA,25.06.2020,25,常用16S rDNA序列引物,注：M=C或A，Y=C、A或T，K=G或T，R=A或G，S=G或C，W=A或T。,25.06.2020,26,

13、1980年，Brosius等利用23S rRNA基因序列測定的方法推導(dǎo)出大腸桿菌23S rRNA的全部核苷酸排列順序，整個分子含有2904個核苷酸。1981年相繼有三個實驗室提出了大腸桿菌23S rRNA的二級結(jié)構(gòu)模型。目前已經(jīng)獲得了大量有關(guān)23S rRNA基因序列的信息，不同來源的23S rRNA約有60%70%的結(jié)構(gòu)共同性。大腸桿菌23S rRNA的一級結(jié)構(gòu)與酵母也有很大相似性。雖然已有大量的大腸桿菌23S rRNA基因序列信息，但是相比于16S rRNA基因序列信息要少得多，因此在微生物分析中還沒有得到廣泛的應(yīng)用。,rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析,23S rDNA,25.06.2

14、020,27,rDNA序列的微生物鑒定及種群組成分析,核糖體DNA的基因間隔區(qū) (ITS區(qū)),細菌的rDNA通常由5S、16S和23S及一些間隔序列組成。近十幾年來，人們成功的以核糖體大小亞基基因間的間隔序列為對象，對細菌進行更細致的分類和鑒定，并對細菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性進行分析。,核糖體DNA的基因間隔區(qū)示意圖,25.06.2020,28,PCR擴增技術(shù)的應(yīng)用,PCR擴增原理示意圖（左）及PCR儀工作原理曲線（右）,DNA指紋技術(shù)通常需要大量的DNA片段，因此，需要一種手段能夠同比例的放大混合DNA樣品的量。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）通過試管

15、中進行的DNA復(fù)制反應(yīng)使極少量的基因組DNA或RNA樣品中的特定基因片段在短短幾小時內(nèi)擴增幾百萬倍。,25.06.2020,29,不同種類的PCR方法,25.06.2020,30,巢式PCR技術(shù),巢式PCR原理示意圖,巢式PCR (nested PCR)，是指利用兩套PCR引物 (巢式引物) 對DNA模板進行兩輪PCR擴增反應(yīng)。,25.06.2020,31,反向PCR技術(shù),反向PCR的原理示意圖,常規(guī)PCR是擴增兩引物之間的DNA片段，反向PCR（reverse PCR）是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段。,25.06.2020,32,原位PCR技術(shù),原位PCR可應(yīng)用于多種類型的研

16、究材料（組織切片、離心細胞、懸浮細胞等）不同拷貝數(shù)目的序列（病毒的或基因組的DNA或RNA），擴增方法可分為單個或多個引物對，檢測系統(tǒng)也分為直接和間接兩種。,原位PCR的大致流程主要包括： 染色體、細胞及組織切片樣品的制備 PCR前處理，包括石蠟切片、去石蠟、染色體變性和細胞穿透 PCR擴增，一般采用熱啟動PCR，病毒RNA的擴增需用反轉(zhuǎn)錄PCR d. 原位雜交及檢測。,25.06.2020,33,定量PCR技術(shù),定量PCR技術(shù)的方法主要包括：PCR產(chǎn)物的直接定量、有限稀釋法、外對照PCR定量、內(nèi)對照PCR定量、競爭性PCR定量以及熒光定量PCR。其中又以實時熒光定量PCR（Real time

17、 Fluorescent Quantitative PCR，RFQ-PCR）的方法應(yīng)用最為廣泛。,25.06.2020,34,實時熒光定量PCR的兩種定量技術(shù)原理,定量PCR技術(shù),實時熒光定量PCR的動態(tài)變化圖（左）和標(biāo)準(zhǔn)曲線圖（右）,25.06.2020,35,反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),反轉(zhuǎn)錄PCR（Reversed Transcript PCR，RT-PCR），是一種將cDNA合成與PCR技術(shù)結(jié)合，用以分析基因表達的快速、靈敏的方法。,反轉(zhuǎn)錄P CR原理示意圖,25.06.2020,36,熱不對稱交錯PCR技術(shù),熱不對稱交錯PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR

18、，簡稱TAIL-PCR）是一種用來分離與已知序列鄰近的未知DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)。,TAIL-PCR反應(yīng)流程,25.06.2020,37,核酸探針雜交技術(shù)的應(yīng)用,分子雜交技術(shù) (technique of molecular hybridization) 又稱核酸雜交技術(shù)，是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)手段從分子水平探討組織細胞內(nèi)特定基因的表達變化規(guī)律，并闡明細胞功能調(diào)節(jié)機制的一種極為重要的方法，在一定程度上具有其他生物檢測技術(shù)所不能替代的作用。,25.06.2020,38,常規(guī)分子雜交技術(shù)的定義及分類,25.06.2020,39,菌落原位雜交,菌落原位雜交是將細菌從培養(yǎng)平板轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上

19、，然后將濾膜上的菌落裂解以釋出DNA與探針進行雜交反應(yīng)的方法。,用菌落原位雜交方法進行的FAST Plaque TB實驗,25.06.2020,40,Southern印跡,Southern印跡雜交的操作流程,25.06.2020,41,熒光原位雜交技術(shù),原位雜交 (In Situ Hybridization，ISH) 技術(shù)是用標(biāo)記的核酸探針，使用非放射檢測系統(tǒng)或放射自顯影系統(tǒng)，在組織切片、細胞涂片及染色體制片上等對核酸進行定性、定位和相對定量研究的一種分子生物學(xué)方法，具有靈敏、特異、直觀等優(yōu)點。,ANAMMOX污泥中浮霉?fàn)罴毦鸁晒庠浑s交分析,25.06.2020,42,熒光原位雜交技術(shù),熒光

20、原位雜交技術(shù)的基本原理是基于堿基互補的原則，用熒光素標(biāo)記的已知外源DNA或RNA作探針，與待檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA相互補的核酸探針進行染色體水平上的原位雜交，通過檢測雜交位點熒光來顯示特定核苷酸序列的存在、數(shù)目和定位。,FISH技術(shù)具體步驟,25.06.2020,43,熒光原位雜交技術(shù),mFISH技術(shù)的實驗路線圖,25.06.2020,44,熒光原位雜交技術(shù),利用熒光原位雜交技術(shù)觀測鐵沉積樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu),25.06.2020,45,生物芯片技術(shù),生物芯片是指通過微加工和微電子技術(shù)在固相基質(zhì)表面構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞及蛋白質(zhì)、核酸等生物分子進行準(zhǔn)確、快速

21、、高通量檢測。生物芯片的本質(zhì)特征是利用微電子、微機械、化學(xué)、物理以及計算機技術(shù)，將生命科學(xué)研究中的樣品檢測、分析過程實現(xiàn)連續(xù)化、集成化、微型化。,生物芯片各部分高度整合,25.06.2020,46,生物芯片技術(shù),生物芯片新技術(shù)及其優(yōu)點,25.06.2020,47,生物芯片技術(shù),基因芯片技術(shù)的原理,25.06.2020,48,生物芯片技術(shù),cDNA微陣列芯片原理圖,25.06.2020,49,生物芯片技術(shù),核酸編程的蛋白質(zhì)芯片制備原理,25.06.2020,50,DNA指紋圖譜技術(shù),DNA指紋技術(shù)包括：,變性梯度凝膠電泳（DGGE） 溫度梯度凝膠電泳（TGGE） 單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）

22、限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP） 末端限制性片段長度多態(tài)性分析（T-RFLP） 核糖體基因間隔序列分析（RISA） 擴增的rDNA限制酶切分析技術(shù)（ARDRA） 隨機擴增多態(tài)性DNA分析（RAPD）,25.06.2020,51,DNA指紋圖譜技術(shù),DNA指紋圖譜的建立過程示意圖,總DNA提取流程示意圖,25.06.2020,52,匹配指紋技術(shù)的電泳技術(shù),25.06.2020,53,DNA指紋圖譜技術(shù),瓊脂糖凝膠電泳示意圖,25.06.2020,54,DNA指紋圖譜技術(shù),聚丙烯酰胺電泳示意圖,25.06.2020,55,常見DNA指紋技術(shù)的比較,25.06.2020,56,常見DNA指紋技術(shù)

23、的比較,25.06.2020,57,DNA指紋圖譜技術(shù),變性梯度凝膠電泳 (DGGE),DGGE的原理是：在堿基序列上存在差異的不同DNA雙鏈解鏈時需要不同的變性劑濃度，DNA雙鏈一旦解鏈，其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度將會急劇下降，因此，將PCR擴增得到的等長DNA片段加入到含有變性劑梯度的凝膠中進行電泳，序列不同的DNA片段就會在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構(gòu)型的變化，導(dǎo)致電泳速度的急劇下降，以至停留在其相應(yīng)的變性劑梯度位置，染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分開的條帶，每個條帶代表一個特定序列的DNA片段。在不同泳道中停留在相同位置的條帶，一般可視為具有相同序列的DNA。,25.06.20

24、20,58,DNA指紋圖譜技術(shù),不同偶氮染料脫色菌群的DGGE指紋分析圖譜,25.06.2020,59,溫度梯度凝膠電泳 (TGGE),DNA指紋圖譜技術(shù),TGGE技術(shù)的基本原理與DGGE技術(shù)相似，含有高濃度甲醛和尿素的凝膠溫度梯度呈線性增加，這樣的溫度梯度凝膠可以有效分離PCR產(chǎn)物及目的片段。,大熊貓面部菌群的TGGE圖譜,25.06.2020,60,單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP）,DNA指紋圖譜技術(shù),PCR-SSCP技術(shù)是1989年日本關(guān)谷實驗室將PCR反應(yīng)與單鏈DNA非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳相結(jié)合而創(chuàng)立的。,活性污泥體系的SSCP指紋圖譜,25.06.2020,61,擴增片段長度多態(tài)性分析（AFLP）,DNA指紋圖譜技術(shù),擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）是1993年由荷蘭科學(xué)家Zabeau和Vos發(fā)展起來的一種檢測DNA多態(tài)性的新方法，它可以檢測整個生物基因組的多態(tài)性。,引物組合E7P16230在F2群體檢測結(jié)果,25.06.2020,62,DNA指紋圖譜技術(shù),末端限制性片段長度多態(tài)性分析（T-RFLP）,末端限制性酶切片段長度多態(tài)性分析（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）是RFLP基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)，相對于其它分子生物學(xué)技術(shù)具有分辨率高、易于實現(xiàn)自動化等特