第十二章分子發(fā)光分析.ppt

1、2020/6/26,第十二章 分子發(fā)光分析法,一、分子熒光與磷光產(chǎn)生過程 luminescence process of molecular fluorescence phosphorescence 二、激發(fā)光譜與熒光光譜 excitation spectrum and fluore-scence spectrum 三、熒光的產(chǎn)生與分子結構關系 relation between fluorescence and molecular structure 四、影響熒光強度的因素 factor influenced fluorescence,第一節(jié) 分子熒光與磷光,molecular lumines

2、cence analysis,molecular fluorescence and phosphorescence,2020/6/26,問題： 1、幾個概念：單重態(tài)、三重態(tài)。 2、振動馳豫、內(nèi)轉換、系間竄越、外轉換。 3、熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。 4、熒光效率及影響因素。,2020/6/26,分子發(fā)光包括熒光，磷光，化學發(fā)光，生物發(fā)光。 室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動能級，處于基態(tài)的分子吸收能量（光能、化學能、電能或熱能）后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變到基態(tài)，若返回到基態(tài)時伴隨著光子的輻射，這種現(xiàn)象稱為“發(fā)光”。,2020/6/26,一、熒光與磷光的產(chǎn)生過程 lumines

3、cence process of molecular fluorescence phosphorescence,由分子結構理論，主要討論熒光及磷光的產(chǎn)生機理。 1. 分子能級與躍遷 分子能級比原子能級復雜； 在每個電子能級上，都存在振動、轉動能級； 基態(tài)(S0)激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動能級)：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位； 激發(fā)態(tài)基態(tài)：多種途徑和方式(見能級圖)；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢； 第一、第二、電子激發(fā)單重態(tài) S1 、S2 ； 第一、第二、電子激發(fā)三重態(tài) T1 、 T2 ；,2020/6/26,2.電子激發(fā)態(tài)的多重度,電子激發(fā)態(tài)的多重度：M=2S+1 S為

4、電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)； 大多數(shù)有機分子的基態(tài)處于單重態(tài)； 平行自旋比成對自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級比相應單重態(tài)能級低；,S0T1 禁阻躍遷； 通過其他途徑進入 (見能級圖)；進入的幾率小；,2020/6/26,2.激發(fā)態(tài)基態(tài)的能量傳遞途徑,電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時，通過輻射躍遷(發(fā)光)和無輻射躍遷等方式失去能量；,激發(fā)態(tài)停留時間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強度相對大； 熒光：10-710 -9 s,第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)； 磷光：10-410s；第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)；,2020/6/26,2020/6/26,非輻射能量傳遞過程,

5、振動弛豫：同一電子能級內(nèi)以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。發(fā)生振動弛豫的時間10 -12 s。 內(nèi)轉換：同多重度電子能級中,等能級間的無輻射能級交換。 通過內(nèi)轉換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。 外轉換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉移能量的非輻射躍遷； 外轉換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。 系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的轉動能級間的非輻射躍遷。 改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋軌道耦合進行。,2020/6/26,輻射能量傳遞過程,熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級基態(tài)（ 多為 S1 S0躍遷），發(fā)射波長為 2的熒光；

6、10-710 -9 s 。 由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長； 2 2 1 ； 磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級基態(tài)（ T1 S0躍遷）； 電子由S0進入T1的可能過程：（ S0 T1禁阻躍遷） S0 激發(fā)振動弛豫內(nèi)轉移系間跨越振動弛豫 T1 發(fā)光速度很慢： 10-4100 s 。 光照停止后，可持續(xù)一段時間。,2020/6/26,二、激發(fā)光譜與熒光(磷光)光譜 excitation spectrum and fluore-scence spectrum,熒光(磷光)：光致發(fā)光，照射光波長如何選擇？ 1.熒光(磷光)的激發(fā)光譜曲線 固定測量波長(選最大發(fā)射波長),

7、化合物發(fā)射的熒光(磷光)強度與照射光波長的關系曲線 （圖中曲線I ） 。,激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強度最大；,2020/6/26,2.熒光光譜(或磷光光譜),固定激發(fā)光波長(選最大激發(fā)波長), 化合物發(fā)射的熒光(或磷光強度)與發(fā)射光波長關系曲線(圖中曲線II或III)。,2020/6/26,2020/6/26,3.激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關系,a.Stokes位移 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。 b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖 2 , 1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回

8、到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如 2 )。 c. 鏡像規(guī)則 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。,2020/6/26,鏡像規(guī)則的解釋,基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似；,基態(tài)上的零振動能級與第一激發(fā)態(tài)的二振動能級之間的躍遷幾率最大，相反躍遷也然。,2020/6/26,200,250,300,350,400,450,500,熒光激發(fā)光譜,熒光發(fā)射光譜,nm,蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜,2020/6/26,三、熒光的產(chǎn)生與分子結構的關系 relation between fluorescence and mol

9、ecular structure,1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件 （1）具有合適的結構； （2）具有一定的熒光量子產(chǎn)率。 熒光量子產(chǎn)率（）：,熒光量子產(chǎn)率與激發(fā)態(tài)能量釋放各過程的速率常數(shù)有關，如外轉換過程速度快，不出現(xiàn)熒光發(fā)射；,2020/6/26,2.化合物的結構與熒光,（1）躍遷類型：* 的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產(chǎn)生； （2）共軛效應：提高共軛度有利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移 （3）剛性平面結構：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。如熒光素和酚酞有相似結構，熒光素有很強的熒光，酚酞卻沒有。,（4）取代基效應：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強。,202

10、0/6/26,2020/6/26,四、影響熒光強度的因素 relation between fluorescence and molecular structure,影響熒光強度的外部因素 1.溶劑的影響 除一般溶劑效應外，溶劑的極性、氫鍵、配位鍵的形成都將使化合物的熒光發(fā)生變化； 2.溫度的影響 熒光強度對溫度變化敏感，溫度增加，外轉換去活的幾率增加。 3. 溶液pH 對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制；,2020/6/26,4.內(nèi)濾光作用和自吸現(xiàn)象,自吸現(xiàn)象：化合物的熒光發(fā)射光譜的短波長端與其吸收光譜的長波長端重疊，產(chǎn)生自吸收；如蒽化合物。,內(nèi)濾光作用：溶液中含有能吸收激發(fā)光或

11、熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光，如色胺酸中的重鉻酸鉀；,2020/6/26,5.溶液熒光的猝滅,碰撞猝滅； 氧的熄滅作用等。,2020/6/26,內(nèi)容選擇,第一節(jié) 分子熒光和磷光 molecular fluorescence and phosphorescence 第二節(jié) 分子熒光和磷光分析法 molecular fluorescence and phosphorescence analysis 第三節(jié) 分子發(fā)光分析 chemiluminescence analysis,結束,2020/6/26,第十二章 分子發(fā)光分析法,一、 儀器與結構流程 instrument and general process

12、二、 熒光分析法和應用 fluorescence analysis and application 三、 磷光分析法的應用 phosphorescence analysis and application,第二節(jié) 分子熒光與磷光分析法,molecular luminescence analysis,molecular fluorescence and phosphorescence analysis,2020/6/26,一、儀器結構流程,測量熒光的儀器主要由四個部分組成：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。 特殊點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角。,基本流程如圖： 單色器：選擇激發(fā)光

13、波長的第一單色器和選擇發(fā)射光(測量)波長的第二單色器； 光源：燈和高壓汞燈，染料激光器(可見與紫外區(qū)) 檢測器：光電倍增管。,2020/6/26,儀 器 光 路 圖,2020/6/26,儀器框圖,該型儀器可進行熒光、磷光和發(fā)光分析；,2020/6/26,同步掃描技術,根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關系，同步掃描可分為固定波長差()和固定能量差及可變波長三種；,同步掃描技術可簡化光譜，譜帶變窄，減少光譜重疊，提高分辨率； 如圖。 合適的可減少光譜重疊； 酪氨酸和色氨酸的熒光激發(fā)光譜相似，發(fā)射光譜嚴重重疊，但60nm時，只顯示色氨酸的特征光譜，實現(xiàn)分別測定。,2020/6/26,可

14、獲得三維光譜圖的儀器,可獲得激發(fā)光譜與發(fā)射光譜同時變化時的熒(磷)光光譜圖,2020/6/26,磷光檢測,熒光計上配上磷光測量附件即可對磷光進行測量。在有熒光發(fā)射的同時測量磷光。,測量方法： （1）通常借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開。 （2）采用脈沖光源和可控檢測及時間分辨技術。 室溫測量時，不需要杜瓦瓶。,2020/6/26,二、熒光分析方法與應用,1. 特點 （1）靈敏度高 比紫外-可見分光光度法高24個數(shù)量級；為什么？ 檢測下限：0.10.1g/cm-3 相對靈敏度：0.05mol/L 奎寧硫酸氫鹽的硫酸溶液。 （2）選擇性強 既可依據(jù)特征發(fā)射光譜，又可根據(jù)特征吸

15、收光譜； （3）試樣量少 缺點：應用范圍小。,2020/6/26,2.定量依據(jù)與方法,(1)定量依據(jù) 熒光強度 If正比于吸收的光量Ia和熒光量子效率 ： If = Ia 由朗伯-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3 l c ) 濃度很低時，將括號項近似處理后： If = 2.3 I0 l c = Kc,2020/6/26,（2）定量方法,標準曲線法： 配制一系列標準濃度試樣測定熒光強度，繪制標準曲線，再在相同條件下測量未知試樣的熒光強度，在標準曲線上求出濃度； 比較法： 在線性范圍內(nèi)，測定標樣和試樣的熒光強度，比

16、較；,2020/6/26,3.熒光分析法的應用,(1)無機化合物的分析 與有機試劑配合物后測量；可測量約60多種元素。 鈹、鋁、硼、鎵、硒、鎂、稀土常采用熒光分析法； 氟、硫、鐵、銀、鈷、鎳采用熒光熄滅法測定； 銅、鈹、鐵、鈷、鋨及過氧化氫采用催化熒光法測定； 鉻、鈮、鈾、碲采用低溫熒光法測定； 鈰、銪、銻、釩、鈾采用固體熒光法測定 (2)生物與有機化合物的分析 見表,2020/6/26,2020/6/26,2020/6/26,三、磷光分析法的應用,1.稠環(huán)芳烴分析 采取固體表面室溫磷光分析法快速靈敏測定稠環(huán)芳烴和雜環(huán)化合物（致癌物質(zhì)）；見表 2.農(nóng)藥、生物堿、植物生長激素的分析 煙堿、降煙堿

17、、新煙堿，2，4-D等分析 檢測限0.01 g/cm-3 3.藥物分析和臨床分析 見表,2020/6/26,2020/6/26,2020/6/26,內(nèi)容選擇,第一節(jié) 分子熒光和磷光 molecular fluorescence and phosphorescence 第二節(jié) 分子熒光和磷光分析法 molecular fluorescence and phosphorescence analysis 第三節(jié) 分子發(fā)光分析 chemiluminescence analysis,結束,2020/6/26,第十二章 分子發(fā)光分析法,一、基本原理 principle 二、化學發(fā)光分析的特點 charac

18、teristics 三 裝置與技術 instrument and technology,第三節(jié) 化學發(fā)光分析法,molecular luminescence analysis,chemiluminescence analysis,2020/6/26,一、基本原理 principle,1. 化學發(fā)光反應 在化學反應過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時，發(fā)射出一定波長的光。 A +B = C + D* D* D + h （1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機化合物，芳香族化合物； （2）化學發(fā)光反應多為氧化還原反應，激發(fā)能與反應能相當 E=170300 kJ/mol；位于可見光區(qū)； （

19、3）發(fā)光持續(xù)時間較長，反應持續(xù)進行； 化學發(fā)光反應存在于生物體(螢火蟲、海洋發(fā)光生物)中，稱生物發(fā)光(bioluminescence)。,2020/6/26,2.化學發(fā)光效率,化學效率：,發(fā)光效率：,時刻t 的化學發(fā)光強度(單位時間發(fā)射的光量子數(shù))：,dc/dt 分析物參加反應的速率；,2020/6/26,3.化學發(fā)光強度與化學發(fā)光分析的依據(jù),在化學發(fā)光分析中，被分析物相對于發(fā)光試劑小得多，對于一級動力學反應：,dc/dt =Kc； K 為反應速率常數(shù)。 定性依據(jù)： （1）在一定條件下，峰值光強度與被測物濃度成線性；,（2）在一定條件下，曲線下面積為發(fā)光總強度(S)，其與被測物濃度成線性：,2

20、020/6/26,4.化學發(fā)光反應的類型,（1）氣相化學發(fā)光反應 a. 一氧化氮與O3的發(fā)光反應 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 發(fā)射的光譜范圍：600875nm，靈敏度1ng/cm-3； b.氧原子與SO2、NO、CO的發(fā)光反應 O3 O2 + O （1000 C石英管中進行） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最大發(fā)射波長：200nm；靈敏度1ng/cm-3；,2020/6/26,O3 O2 + O （1000 C石英管中進行） NO + O NO2* NO2 * NO2 + h 發(fā)射光譜范圍：4001400nm；靈敏度1ng/c

21、m-3； 氧原子與CO的發(fā)光反應： CO + O CO2* CO2 * CO2 + h 發(fā)射光譜范圍：300500nm；靈敏度1ng/cm-3；,氧原子與NO的發(fā)光反應：,2020/6/26,c. 乙烯與O3的發(fā)光反應,乙烯與O3反應，生成激發(fā)態(tài)乙醛：,CH2O* CH2O + h 最大發(fā)射波長：435nm；對O3的特效反應；線性響應范圍1 ng/cm-3 1g/cm-3；,2020/6/26,（2）火焰中的化學發(fā)光反應,在富氫火焰中，也存在著很強的化學發(fā)光反應； a. 一氧化氮 NO + H HNO* HNO * HNO + h 發(fā)射光譜范圍：660770nm； 最大發(fā)射波長：690nm；

22、在富氫火焰中： NO2 + 2H NO + H2O 該反應十分迅速；,2020/6/26,b.硫化物,揮發(fā)性硫化物SO2 、H2S 、CH3SH、 CH3SCH3等在富氫火焰中燃燒，產(chǎn)生很強的化學發(fā)光（藍色）： SO2 + 2H2 S + 2H2O S + S 2S2 * S2 * S2 + h 發(fā)射光譜范圍：350460nm； 最大發(fā)射波長：394nm； 靈敏度： 0.2 ng/cm-3； 發(fā)射光強度與硫化物濃度的平方成正比。,2020/6/26,（3）液相中的化學發(fā)光反應,機理研究較多，在分析中應用最多；可測痕量的H2O2 、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Th等。 應用最多

23、的發(fā)光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）； 化學發(fā)光反應效率：0.150. 05； 魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應過程：,該發(fā)光反應速度慢，某些金屬離子可催化反應；利用這一現(xiàn)象可測定這些金屬離子。 魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應過程：,2020/6/26,5. 化學與生物發(fā)光分析的應用,（1） 該發(fā)光反應速度慢，某些金屬離子可催化反應；利用這一現(xiàn)象可間接測定這些金屬離子。可測痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等 （2） 可檢測低至 10-9 mol/L 的H2O2； （3） 間接測定某些生物試樣,氨基酸 + O2 酮酸

24、 +NH3 + H2O2,氨基酸氧化酶,葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2 通過測定生成的H2O2 ，確定氨基酸、葡萄糖含量。,葡萄糖氧化酶,2020/6/26,草酸二酯(能量提供體)+高濃度雙氧水+稠環(huán)芳烴(能量接受體)+金屬離子+溶劑組成的反應體系，可發(fā)出很強的可見光，發(fā)光效率高，使用不同的稠環(huán)芳烴，發(fā)射出不同顏色的光(冷光源)。,2020/6/26,生物發(fā)光分析應用 1,在pH 78；熒光素酶(E)和Mg2+的存在下，熒光素(LH2)與磷酸三腺甙(ATP)的反應，生成磷酸腺甙(AMP)熒光素和熒光素酸的復合物和鎂的焦磷酸鹽(ppi)：,ATP + LH2 + E + Mg2+ AMP LH2 E +Mg ppi + 2H+,pH7 - 8,復合物與氧反應，產(chǎn)生化學發(fā)光：,AMP LH2 E + O2 氧化熒光素* + AMP+CO2 + H2O