酵母RNA的提取

1、酵母RNA的提取一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?了解從植物、動(dòng)物等材料中提取有效成分的方法途徑，掌握在實(shí)驗(yàn)過程中細(xì)胞破壁的方法。2了解酵母RNA提取的不同方法，掌握稀堿法提取RNA的技術(shù)。二 實(shí)驗(yàn)原理：稀堿法使用稀堿（0.2%氫氧化鈉）使酵母細(xì)胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清夜用乙醇沉淀RNA或調(diào)pH2.5利用等電點(diǎn)沉淀。三 實(shí)驗(yàn)技術(shù)：1細(xì)胞破壁的方法：（1）物理方法：研磨法，組織搗碎器法（低溫操作，防止變性），超聲波法，壓砸法，凍融法。（2）溶脹和自溶：溶脹細(xì)胞壁內(nèi)外存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，引起細(xì)胞膜發(fā)生脹破的現(xiàn)象稱溶脹。自溶細(xì)胞結(jié)構(gòu)在本身所具有的各種水解酶作用下，發(fā)生溶解的現(xiàn)象稱

2、自溶。（3）化學(xué)方法：用脂溶性的溶劑或表面活性劑處理細(xì)胞時(shí)，可把細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)部分溶解，進(jìn)而使細(xì)胞釋放出各種有效成分，導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞破碎。（4）生物酶降解法：如溶菌酶有降解細(xì)胞壁的功能。2生物材料的選擇：原材料豐富，易得、廉價(jià)、有效成分含量高。3溶劑的選擇：有效成分溶解度盡可能的大，不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不改變有效成分的化學(xué)性質(zhì)，價(jià)格低，成本低，收益高。4影響提取的因素：溶液PH值，溶劑的極性和離子強(qiáng)度，溫度，水解酶，攪拌，金屬離子，抽提液與抽提物的比例要適當(dāng)，一般5：1。5酵母RNA的提取方法：苯酚法保存了生物活性，去污劑法，濃鹽法，稀堿法。四 試劑：1. 0.2%氫氧化鈉 2. 95%酸性乙

3、醇：500毫升乙醇加5毫升濃鹽酸。3. 95%乙醇 4. 無水乙醇五 儀器：離心機(jī)、電爐、氺浴鍋、天平等六 操作：稱取4克干酵母粉置于200毫升錐形瓶中，加入40毫升0.2%氫氧化鈉溶液，沸水浴30分鐘，經(jīng)常攪拌，后流水冷卻，4000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，取上清液，加入40毫升95%酸性乙醇，邊加邊攪拌，后靜置5分鐘，再4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，保留沉淀，再用95%乙醇20毫升洗滌兩次，每次洗后3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，再用20毫升無水乙醇分兩次洗滌，每次洗后3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集沉淀于濾紙上干燥備用。產(chǎn)量計(jì)算： RNA量干酵母粉RNA含量= 100% 干酵母粉量七 注意事項(xiàng)：1沸水浴要

4、加小漏斗回流，經(jīng)常攪拌。2離心機(jī)的使用，要注意平衡、轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)由慢至快，對(duì)稱放置等。3電爐安全使用。4天平使用，稱量要注意的問題。紫外吸收法測(cè)量RNA含量一 試驗(yàn)?zāi)康模?了解測(cè)量核酸濃度不同方法的原理。2掌握紫外吸收法測(cè)核酸濃度的原理和技術(shù)。二 試驗(yàn)原理：1紫外吸收法原理：核酸具有吸收紫外線的性質(zhì)，在波長(zhǎng)260nm處有最大吸收，且在一定濃度范圍內(nèi)光吸收值與濃度成正比（0-50微克/毫升），符合朗伯-比爾定律。優(yōu)點(diǎn)是樣品用量少，不用顯色，測(cè)完后樣品可以繼續(xù)使用。2地衣酚顯色法：核酸與濃鹽酸共熱，發(fā)生降解，生成糠醛，后者與地衣酚反應(yīng)，在三價(jià)鐵離子或二價(jià)銅離子作用下，生成鮮綠色的復(fù)合物，670nm處有

5、最大吸收，且光吸收值與濃度成正比，符合朗伯-比爾定律。缺點(diǎn)是反應(yīng)特異性差，易受干擾。3定磷法：在酸性環(huán)境中，定磷試劑中的鉬酸銨以鉬酸形式與樣品中無機(jī)磷酸生成磷鉬酸，當(dāng)有還原劑存在時(shí)，磷鉬酸立即被還原生成藍(lán)色的還原產(chǎn)物-鉬藍(lán)，其最大吸收在660nm處，當(dāng)無機(jī)磷含量在每毫升1-25微克范圍內(nèi)，光吸收與含磷量成正比。測(cè)量樣品核酸的總磷量，需先將它用硫酸或高氯酸消化成無機(jī)磷再行測(cè)定?？偭琢繙p去未消化樣品中測(cè)得的無機(jī)磷量，即得核酸含磷量，由此可計(jì)算出核酸含量。優(yōu)點(diǎn)是測(cè)量準(zhǔn)確，缺點(diǎn)是操作繁瑣。三 化學(xué)試劑1酵母粉 2. 0.2%氫氧化鈉溶液 3. pH1-14試紙 4. 標(biāo)準(zhǔn)核酸：100微克/毫升四 實(shí)驗(yàn)

6、儀器 1紫外分光光度計(jì) 2. 精密電子天平 五 實(shí)驗(yàn)操作1準(zhǔn)確稱取0.20-0.25克樣品核酸，加2毫升0.2%氫氧化鈉溶液和1毫升水溶解，調(diào)成糊狀，再加入50毫升左右水溶解，邊溶解邊轉(zhuǎn)移到100毫升燒杯中，用0.2%氫氧化鈉調(diào)至中性，定容至100毫升，再取2毫升定容至100毫升備用。（開始溶液呈乳白色，完全溶解后變?yōu)槌吻逋该魅芤海?制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品：管號(hào)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（0.5-4.5稀釋2次）100倍編號(hào)123456789標(biāo)準(zhǔn)RNA0.50.51.01.52.09水9.54.543.5311260nmOD0.0990.1310.3440.4160.5560.6720.3540.3310.354濃度ug/ml5102030404524容量瓶中的濃度是2400ug/ml