實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞化學(xué)染色POX.ppt

1、a,1,細(xì)胞化學(xué)染色,滄州醫(yī)專醫(yī)學(xué)技術(shù)系 侯振江,a,2,細(xì)胞化學(xué)染色，是一種以形態(tài)為基礎(chǔ)，結(jié)合運(yùn)用化學(xué)或生物化學(xué)技術(shù)對血細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分作定位、定性及半定量分析的方法。 用于研究血細(xì)胞生理、病理和化學(xué)結(jié)構(gòu)； 臨床上為某些血液病的診斷、鑒別診斷、療效觀察、預(yù)后監(jiān)測和發(fā)病機(jī)制的探討，提供重要依據(jù)。,a,3,血細(xì)胞化學(xué)染色的基本要求是在原位顯示細(xì)胞成分和結(jié)構(gòu)，反應(yīng)產(chǎn)物應(yīng)是有色沉淀物，具有一定的穩(wěn)定性。 血細(xì)胞化學(xué)染色可顯示糖原、脂類、酶、蛋白質(zhì)等。,a,4,（一）固定 固定有物理法與化學(xué)法， 物理法為干燥和火焰固定， 化學(xué)法最常用的是甲醛、乙醇、丙酮和醋酸等。,血細(xì)胞化學(xué)染色流程,a,5,（二）

2、顯示 1、偶氮偶聯(lián)法：利用人工合成的酶底物，在酶作用下，產(chǎn)生分解產(chǎn)物，再與重氮鹽結(jié)合引起偶氮偶聯(lián)，使其形成不溶性的偶氮色素，以此證明酶的存在。 2、聯(lián)苯胺法：粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中的過氧化物酶作用于過氧化氫，釋放新生態(tài)氧，使無色的聯(lián)苯胺形成藍(lán)色沉淀。,a,6,3、普魯士藍(lán)法：細(xì)胞內(nèi)、外鐵與酸性亞鐵氰化鉀作用，形成藍(lán)色亞鐵氰化鐵沉淀。 4、雪夫反應(yīng)：過碘酸氧化細(xì)胞內(nèi)糖類中乙二醇基形成乙醛基，醛基與雪夫試劑作用，使無色品紅形成紅色沉淀。 5、金屬沉著法 其他尚有物理學(xué)方法，如脂溶性染料染色（顯示脂質(zhì)）、熒光顯示、放射自顯影以及體外活體染色亦常用于臨床血液細(xì)胞學(xué)診斷。,a,7,（三）細(xì)胞化學(xué)定量 粗略估

3、量，以染色反應(yīng)的強(qiáng)弱，受色的深淺，人為地區(qū)別為陰性和各種程度的陽性。 百分法，只能反映細(xì)胞陽性率，不能反映受色強(qiáng)弱。 積分法，是常用的半定量法，將等級估量與百分率相結(jié)合它既反映了細(xì)胞陽性率的高低，又反映了細(xì)胞受色的強(qiáng)弱。,a,8,下面介紹幾種常用的細(xì)胞化學(xué)染色方法 這些方法學(xué)在白血病的鑒別診斷上具有重要意義。,a,9,一、過氧化物酶染色（POX）,（一）四甲基聯(lián)苯胺法(TMB) 【原理】 粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的胞漿內(nèi)的髓過氧化物酶（POX orMPO）分解過氧化氫，釋放新生態(tài)氧，使無色聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)色聯(lián)苯胺，后者進(jìn)一步變成棕色化合物沉著于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。,a,10,POX,新生態(tài)氧 O,過氧化氫 （基質(zhì)

4、中）,四甲基聯(lián)苯胺TMB （無色）,聯(lián)苯胺藍(lán)（藍(lán)色）,亞硝基鐵氰化鈉,藍(lán)色顆粒 （漿內(nèi)酶部位）,粒、單核 細(xì)胞胞漿,【原理】,四甲基苯醌二胺,(棕色),自我脫氫氧化,a,11,【試劑】 1%TMB 亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液 1%過氧化氫溶液 稀過氧化氫溶液 瑞氏染色液,a,12,【操作】 1. 取0.1%TMB乙醇溶液lml，加亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液10l，混合溶液呈淡棕黃色。 2. 在新鮮干燥的血片上，加混合溶液0.5ml, 放置lmin后，再加稀過氧化氫溶液0.7ml，染色6min 。 3. 瑞氏染液復(fù)染1520min 。 4. 油鏡鏡檢。,a,13,【結(jié)果】 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有藍(lán)黑色顆粒者為陽性。

5、 （） 無顆粒沉著； （） 顆粒細(xì)小 ，分布稀疏； （+） 顆粒較粗，局灶分布； （+） 顆粒粗大，分布較密，占胞質(zhì) 1/22/3； （+） 顆粒粗大，呈團(tuán)塊分布； （+） 全部胞質(zhì)均部滿顆粒，可覆蓋胞核。,a,14,a,15,骨髓片POX染色,a,16,【臨床意義】 （1）粒系： POX主要分布在粒細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)，隨著粒細(xì)胞成熟的程度而逐漸增強(qiáng)，中性分葉核粒細(xì)胞為強(qiáng)陽性。 嗜酸性粒細(xì)胞陽性程度最強(qiáng)，其陽性顆粒比中性粒細(xì)胞粗大，有折光。 堿性粒細(xì)胞為陰性。,a,17,（2）單核細(xì)胞： 原始單核細(xì)胞為陰性反應(yīng)， 幼稚單核細(xì)胞和成熟單核細(xì)胞呈弱陽性反應(yīng)，顆粒細(xì)小，彌散分布。,a,18,（3）其他

6、細(xì)胞 淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、幼紅細(xì)胞、組織細(xì) 胞、巨核細(xì)胞均呈陰性反應(yīng)。 （4）血小板過氧化物酶 主要定位于幼稚型巨核細(xì)胞的核膜上，可作為原巨核細(xì)胞的一種標(biāo)志物，有助于FAB M7的識別。,a,19,（5）過氧化物酶染色 主要用于鑒別急性白血病類型， 急性髓細(xì)胞白血病多呈陽性反應(yīng)，以M3和M2型反應(yīng)最強(qiáng)，MI和M5型反應(yīng)較弱， 故有助于區(qū)別M3和M5型。 急性淋巴細(xì)胞白血病呈POX陰性反應(yīng)，故為急性髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞白血病鑒別的重要指標(biāo)。,a,20,注意事項(xiàng),涂片應(yīng)新鮮制作、厚薄適宜。 TMB 配制在8588的乙醇溶液中染色效果較好，勿用9095乙醇，否則細(xì)胞表面蛋白質(zhì)很快凝固，妨礙試劑向胞內(nèi)滲入而

7、使顯色反應(yīng)減弱或消失。 過氧化氫溶液需新鮮配制，其濃度與加入量不能隨意更改。涂片中粒細(xì)胞看不見陽性顆粒，紅細(xì)胞呈棕色或綠色，即表示過氧化氫過濃。若過氧化氫加于血片上不產(chǎn)生氣泡，則示無效。 染色液適宜pH值應(yīng)為5.5，若pH值 10個(gè)鐵顆粒。 正常范圍：30% 90% ，平均60%， 多見型，少見型，無、型。,a,67,細(xì)胞內(nèi)鐵,a,68,（3）環(huán)形鐵粒幼紅細(xì)胞： 指含鐵顆粒6個(gè)，其中2/3以上鐵顆粒圍繞核周排列成完整環(huán)形或不完整環(huán)形。 正常或非鐵粒幼細(xì)貧血無環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞，鐵粒幼細(xì)貧血中環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞6% 。,a,69,環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞,a,70,【臨床意義】 1缺鐵性貧血時(shí)， 骨髓細(xì)胞外鐵明顯減少，為“一”“士”，細(xì)胞內(nèi)鐵平均5.9%，僅為I型。 經(jīng)有效鐵劑治療后，外鐵增多。 因此骨髓鐵染色是診斷缺鐵性貧血及指導(dǎo)鐵劑治療的重要方法。,a,71,2鐵粒幼細(xì)胞性貧血時(shí)， 外鐵“2”一“3”，內(nèi)鐵平均70%，其鐵粒粗大，以 型為主，出現(xiàn)較多環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞。 因此，本實(shí)驗(yàn)是診斷鐵粒幼細(xì)胞貧血的有效方法。 MDS也可出現(xiàn)環(huán)形鐵粒幼細(xì)胞。,a,72,3.