泛素化對(duì)蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)ppt課件

1、.,泛素：泛素(Ubiquitin)是一種由 76 個(gè)氨基酸構(gòu)成、在真核生物中廣泛存在并具有高度保守性的多肽。泛素的氨基酸序列極其保守,例如酵母與人的泛素僅有3個(gè)殘基的差別。 泛素化修飾：一個(gè)或多個(gè)泛素分子在一系列酶的作用下與底物蛋白質(zhì)分子共價(jià)結(jié)合的翻譯后修飾過(guò)程稱為泛素化修飾。,.,泛素化修飾主要作用： 1.參與蛋白質(zhì)降解 2.直接影響蛋白質(zhì)的活性和定位,.,蛋白質(zhì)降解： 泛素化修飾最早被發(fā)現(xiàn)的功能是標(biāo)記靶蛋白, 使之被蛋白酶體識(shí)別并降解, 整個(gè)過(guò)程涉及泛素分子、底物蛋白和多種酶系統(tǒng)。 1.泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）：泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）、泛素連接酶（E3）、去泛素化酶、

2、蛋白酶體，它們共同構(gòu)成了泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（UPS）。,.,早在 20 世紀(jì) 70 年代就證實(shí)動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解是具有高度選擇性的。有一些模型提出來(lái)解釋這種選擇性降解蛋白的現(xiàn)象, 例如, 有人提出所有的蛋白都能迅速地進(jìn)入溶酶體, 但是只有那些短暫的蛋白被降解, 而長(zhǎng)壽命的蛋白質(zhì)則從溶酶體中逃出重新回到細(xì)胞質(zhì)。后期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)溶酶體降解蛋白特異性很低, 并且溶酶體降解所有的蛋白速率都一樣。此外, 用特定的抑制劑抑制溶酶體的功能對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解的影響很小。這明顯說(shuō)明了溶酶體并不是特異性降解細(xì)胞內(nèi)蛋白的細(xì)胞器。最終, 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)特異降解蛋白的系統(tǒng)-泛素蛋白酶體系統(tǒng)。,.,在細(xì)胞內(nèi), UPS 能夠

3、快速地降解那些不正常的蛋白質(zhì)和一些短暫的控制一系列基本細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)蛋白。UPS 降解蛋白質(zhì)是一個(gè)復(fù)雜的和受到嚴(yán)密調(diào)控的, 并且是高度特異性的降解細(xì)胞內(nèi)許多蛋白質(zhì)的過(guò)程。細(xì)胞是如何選擇并以高度特異的方式來(lái)降解蛋白質(zhì)的呢？它是通過(guò)給需要降解的蛋白質(zhì)加上許多小的標(biāo)簽泛素來(lái)標(biāo)記需被降解的蛋白隨后這些蛋白被泛素蛋白酶體降解。,.,蛋白酶體存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì), 它是由1020 個(gè)亞基組成的蛋白復(fù)合物。細(xì)胞內(nèi)普遍存在的蛋白酶體是 26S 蛋白酶體, 由一個(gè)核心的 20S 蛋白酶體和兩個(gè)具調(diào)節(jié)作用的 19S 蛋白酶體組成。20S蛋白酶體為中空結(jié)構(gòu), 是一個(gè)大的具有催化活性的蛋白酶, 由 2 個(gè)外環(huán)(7

4、 個(gè) a 亞基)和 2 個(gè)內(nèi)環(huán)(7 個(gè) 亞基)組成。在細(xì)胞內(nèi), 20S 蛋白酶體具有潛在的催化能力, 需要激活才具有蛋白酶活性, 至少有 2 類蛋白酶體激活劑被發(fā)現(xiàn)在能夠結(jié)合核心的20S 蛋白酶體并增強(qiáng)它的催化活性。,.,19S 調(diào)節(jié)顆粒能夠結(jié)合到20S 蛋白酶體的外環(huán)上,形成 26S蛋白酶體, 它們主要負(fù)責(zé)降解泛素化的蛋白質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)的蛋白質(zhì)是由 26S 蛋白酶體降解的。11S 調(diào)節(jié)顆粒又被稱為 PA28 或 REG, 它也能夠結(jié)合到 26S 蛋白酶體并以一種不需要 ATP 和泛素化的方式起始短肽而不是完整的蛋白質(zhì)的降解。如圖：,.,靶蛋白的泛素化降解涉及以下 3 個(gè)連續(xù)的過(guò)程：(1)泛

5、素的活化,這個(gè)過(guò)程需要以 ATP 作為能量, 泛素 C 端的羧基連接到泛素活化酶 E1 的巰基, 最終形成一個(gè)泛素和泛素活化酶 E1 之間的硫酯鍵; (2)泛素活化酶 E1 將活化后的泛素通過(guò)交酯化過(guò)程傳遞給泛素結(jié)合酶 E2; (3)泛素連接酶 E3 將結(jié)合 E2 的泛素連接到靶蛋白上。,.,靶蛋白在泛素激活酶 E1、泛素結(jié)合酶 E2 和蛋白泛素連接酶 E3 的作用下共價(jià)連接上幾個(gè)泛素分子, 然后被 26S 蛋白酶體所降解。蛋白質(zhì)的降解是在 20S 核心顆粒中的 亞基進(jìn)行的, 一般不生成部分降解的產(chǎn)物, 而是將底物蛋白完全降解為長(zhǎng)度一定的肽段。26S 蛋白酶體只識(shí)別泛素化的蛋白并將其降解為小肽

6、, 泛素在去泛素連接酶作用下回收再利用。如圖：,.,這些小肽隨后被細(xì)胞質(zhì)中的蛋白酶降解為氨基酸。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),UPS系統(tǒng)是一個(gè)層次非常鮮明體系：細(xì)胞內(nèi)只表達(dá)一種泛素激活酶E1把泛素轉(zhuǎn)移到大約50種泛素結(jié)合酶 E2上, 每種E2都可以與許多E3泛素連接酶相互作用,而E3泛素連接酶在細(xì)胞內(nèi)大約有 1 000個(gè),它們負(fù)責(zé)特異性地結(jié)合底物使其發(fā)生泛素化從而能被蛋白酶體降解。,.,泛素化修飾可分為多聚泛素化修飾和單泛素化修飾。目前報(bào)道的多聚泛素化修飾主要有8種不同類型的連接方式,其中7種涉及泛素鏈內(nèi)部賴氨酸 K 與泛素分子 C末端的甘氨酸G相連接方式，包括K6、K11、K27、K29、K33、K48

7、和K63位的多聚泛素化修飾。研究比較多的是K48位和K63位多聚泛素化修飾，其中K48位的多聚泛素化修飾主要起到降解的作用和調(diào)控蛋白的穩(wěn)定性，K63位的多聚泛素化修飾主要起到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、DNA修復(fù)的功能和調(diào)控蛋白的活性。,.,近幾年發(fā)現(xiàn)了第 8 種類型的泛素鏈連接方式即線性泛素化修飾，其泛素鏈的連接方式是由泛素甲硫氨酸Met1的氨基基團(tuán)與另一泛素甘氨酸的羧基相連形成泛素鏈標(biāo)記。目前研究表明線性泛素化修飾在先天性免疫和抑制炎癥反應(yīng)等多種過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用，成為現(xiàn)階段的研究熱點(diǎn)。,.,.,單泛素修飾影響細(xì)胞的膜運(yùn)輸、內(nèi)吞和病毒出芽等過(guò)程；由48位賴氨酸（K48）形成的泛素鏈發(fā)生的修飾，主要介

8、導(dǎo)蛋白質(zhì)的蛋白酶體降解；由63位賴氨酸（K63）形成的泛素鏈發(fā)生的修飾，與內(nèi)吞作用、炎癥響應(yīng)、蛋白質(zhì)翻譯和DNA修復(fù)相關(guān)。而其他形式的泛素鏈與細(xì)胞周期、溶酶體降解、激酶識(shí)別等一系列過(guò)程相關(guān)。,.,泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)了真核生物體內(nèi)80%85%的蛋白質(zhì)降解, 該蛋白質(zhì)降解途徑具有依賴 ATP、高效、高度選擇性的特點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)蛋白的降解主要具有兩個(gè)方面的作用, 一方面是通過(guò)降解錯(cuò)誤折疊、突變或者損傷的蛋白來(lái)維持細(xì)胞的質(zhì)量控制, 另一方面是通過(guò)降解關(guān)鍵的調(diào)節(jié)蛋白來(lái)控制細(xì)胞的基本生命活動(dòng), 例如生長(zhǎng)、代謝、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等。,.,蛋白質(zhì)的加工： 雖然蛋白酶體降解成非常短的片段, 但是在有

9、些情況下, 降解產(chǎn)物也是具有生物學(xué)活性的。一些轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物中的成分, 合成后以無(wú)活性的前體分子存在, 在經(jīng)過(guò)泛素化和蛋白酶降解后, 才轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚苑肿印＠? NF-kappa B、Spt23p 和 Mga2p 等。,.,細(xì)胞周期的調(diào)控： 細(xì)胞周期的進(jìn)程是由一系列細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)來(lái)進(jìn)行調(diào)控的, 而 CDK 的激活需要細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)的結(jié)合。在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中,細(xì)胞周期蛋白的壽命很短, 大約只有幾分鐘。在Cyclin-CDK 復(fù)合物執(zhí)行完功能后, 復(fù)合物中的Cyclin 則會(huì)很快速地被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解, 從而保證細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。此外, 在細(xì)胞退出有絲分裂的

10、過(guò)程中, Cyclin B需要從有絲分裂促進(jìn)因子上解離下來(lái), 而這一過(guò)程也依賴于蛋白酶體。例如,Cyclin A 的降解是由一種 E3 泛素連接酶-后期促進(jìn)因子(APC)來(lái)進(jìn)行的, APC 的各組分在細(xì)胞分裂間期中表達(dá), 但是它只有在M期才具有E3連接酶活性, 從而降解 M 期周期蛋白, 細(xì)胞則有中期向后期轉(zhuǎn)化。,.,細(xì)胞周期的進(jìn)程也受到細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)的調(diào)控。例如, 有絲分裂前期檢查點(diǎn) Chfr 蛋白在細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Chfr 是一個(gè) E3 泛素連接酶, 其底物包括 HDAC1、Plk1、Kif22、HLTF 等, 許多研究表明 Chfr 在細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,細(xì)胞分裂

11、存在有絲分裂應(yīng)激時(shí), Chfr 通路激活引起PLK1 的泛素化并降解, 控制 Cdc2 激酶的活性, 延遲染色體凝集和中心體分離, 阻止細(xì)胞于有絲分裂前期, 它的表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的生存能力 。一旦有絲分裂應(yīng)激解除并且缺陷修復(fù), Chfr 連接酶即失活, Plk1 再合成驅(qū)使細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期。因此, 泛素蛋白酶體系統(tǒng)在細(xì)胞周期的調(diào)控上具有非常重要的作用。,.,細(xì)胞凋亡： 細(xì)胞凋亡對(duì)個(gè)體發(fā)育的正常進(jìn)行, 自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面起著非常重要的作用.在細(xì)胞凋亡發(fā)生前, 細(xì)胞內(nèi)泛素化的蛋白質(zhì)、泛素連接酶的表達(dá)明顯上調(diào).此外, 在細(xì)胞凋亡過(guò)程中, 蛋白酶體的定位出現(xiàn)了明顯的改變,

12、 它由細(xì)胞核移位到調(diào)亡小泡的外膜.利用藥物抑制蛋白酶體的活性可以影響不同類型細(xì)胞凋亡.在大多數(shù)被研究的細(xì)胞類型中, 抑制蛋白酶體的活性可以促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡.但是, 蛋白酶體的活性并不是凋亡所必需的, 在原代培養(yǎng)的靜止和分化的細(xì)胞,如神經(jīng)元細(xì)胞, 抑制蛋白酶體的活性阻止了細(xì)胞的亡.但是這一機(jī)制到目前還不是很清楚.,.,DNA 修復(fù): 蛋白質(zhì) p53 是一個(gè)抑癌基因, 被譽(yù)為“基因衛(wèi)士”。至少有50%的人類癌癥是由于 p53 的突變導(dǎo)致的。在正常細(xì)胞中, p53 始終處于合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài), 并維持在較低水平上。這種平衡狀態(tài)的維持是離不開泛素蛋白酶體系統(tǒng)的。正常情況下, MDM2 這一 E3 泛

13、素連接酶與 p53 相互作用并使 p53不斷地降解。當(dāng) DNA 受到損傷時(shí), p53 被磷酸化而不再與 MDM2 相互作用, 從而不再被泛素化降解,細(xì)胞內(nèi) p53 的蛋白水平迅速增加。p53 是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子, 能夠控制許多基因的表達(dá), 這些基因能夠調(diào)控細(xì)胞周期、DNA 的修復(fù)和細(xì)胞的凋亡等。如果 p53 的蛋白水平上升, 細(xì)胞周期會(huì)被阻斷, 為DNA 修復(fù)提供時(shí)間.,.,細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng): 當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生時(shí), 熱休克蛋白大量表達(dá),其作用是識(shí)別錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì), 并標(biāo)記他們以供蛋白酶體的降解。目前, 已經(jīng)證實(shí) Hsp27 和 Hsp90具有提高泛素-蛋白酶體活性的功能。例如, Hsp27能

14、夠直接與多聚泛素鏈和 26S 蛋白酶體相互作用。在應(yīng)激條件下, Hsp27 促進(jìn)泛素化蛋白質(zhì)的降解, 例如, 磷酸化的I-kB蛋白.I-kB是轉(zhuǎn)錄因子 NF-kB的一個(gè)主要的抑制劑。因此, 在應(yīng)激條件下, 促進(jìn)泛素-蛋白酶體降解 I-kB, 從而可以激活 NF-kB 的活性.,.,此外, Hsp70 可以結(jié)合到錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)上, 并引導(dǎo) E3 泛素連接酶(如 CHIP)將錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)標(biāo)記上泛素, 使得蛋白酶體能夠降解它們.對(duì)于氧化損傷的蛋白質(zhì), 泛素蛋白酶體系統(tǒng)也以類似的機(jī)制把它們降解.例如, 細(xì)胞核內(nèi)的蛋白酶體可以選擇性地降解氧化損傷的組蛋白, 這個(gè)過(guò)程是由 PARP 蛋白所調(diào)控進(jìn)行的

15、。泛素蛋白酶體系統(tǒng)選擇性地降解一些損傷的蛋白質(zhì)可以減輕對(duì)細(xì)胞的損害。,.,調(diào)節(jié)免疫反應(yīng): 大多數(shù)蛋白由蛋白酶體降解為特定長(zhǎng)度的短肽,然而, 也有一些蛋白能夠逃脫這個(gè)過(guò)程而轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)這些多肽結(jié)合到主要組織相容性復(fù)合物(MHC)類型 I 蛋白上, 隨后傳遞到抗原呈遞細(xì)胞表面。如果這些蛋白不是來(lái)源于此細(xì)胞, 例如,侵入機(jī)體的病毒、細(xì)菌或腫瘤, 細(xì)胞毒性 T 淋巴細(xì)胞則會(huì)破壞這個(gè)細(xì)胞.雖然一般的蛋白酶體就可以參與這個(gè)過(guò)程, 但是在這個(gè)過(guò)程中起主要作用的是一種特殊的復(fù)合物, 其可以生成合適大小和成分的降解片斷以供 MHC 結(jié)合.,.,這種復(fù)合物是由11S調(diào)節(jié)顆粒和特殊的亞基(1i、2i、

16、5i,具有不同的底物特異性)組成的, 它們的表達(dá)由干擾素所誘導(dǎo)。NF-kB是一種抗凋亡和促炎癥調(diào)控因子, 它能夠調(diào)控細(xì)胞因子的表達(dá)。26S 蛋白酶體在 NF-kB的激活中起著非常重要的作用, 在 NF-kB的激活過(guò)程中, NF-kB的抑制劑I-kB的快速降解和其前體p105加工成活性的NF-kB即p50。因此, 泛素蛋白酶體系統(tǒng)被認(rèn)為與炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病相關(guān).,.,調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和發(fā)育: 在植物的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中, 泛素蛋白酶體系統(tǒng)起著必不可少的作用,它參與了許多發(fā)育過(guò)程,包括激素反應(yīng)、光形態(tài)、晝夜節(jié)律、花發(fā)育和衰老等。例如, 茁長(zhǎng)素(Auxin)或植物激素(Phytohormone)的作用是

17、調(diào)控植物生長(zhǎng)的方向和向性, 它們通過(guò)細(xì)胞信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo)一系列轉(zhuǎn)錄因子的抑制蛋白(Aux/IAA蛋白)進(jìn)入蛋白酶體降解途徑。,.,這些抑制蛋白被 SCFTIR1 蛋白或者 SCF 蛋白進(jìn)行泛素化降解。Aux/IAA 蛋白降解后, 對(duì) Auxin 反應(yīng)因子(ARF)家族的轉(zhuǎn)錄因子的抑制就被解除, 從而誘導(dǎo) ARF 基因的表達(dá)。ARF 的激活參與了對(duì)根和葉脈生長(zhǎng)的指導(dǎo)。ARF 蛋白和 Aux/IAA 蛋白之間配對(duì)的特異性被認(rèn)為是 ARF 的去抑制作用具有反應(yīng)特異性的原因.,.,在個(gè)體的正常發(fā)育過(guò)程中, 通過(guò)有絲分裂來(lái)增加細(xì)胞數(shù)目、通過(guò)有序的細(xì)胞分化來(lái)增加細(xì)胞類型,進(jìn)而由不同類型的細(xì)胞組成組織和器官。

18、顯然, 這個(gè)生長(zhǎng)和發(fā)育的過(guò)程是受到高度調(diào)控的, 其中, 蛋白質(zhì)降解起著非常重要的作用, 特別是泛素蛋白酶體對(duì)特異蛋白的降解.例如, NEDD4 通過(guò)調(diào)節(jié) IGF-1信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)物的生長(zhǎng)。,.,在哺乳動(dòng)物中, 胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)信號(hào)軸是胎兒和出生后生長(zhǎng)的主要調(diào)節(jié)者。這個(gè)信號(hào)軸主要包括 3 個(gè)配體(IGF-1、IGF-2 和胰島素)和兩個(gè)跨膜的酪氨酸激酶受體(IGF-1R 和 IR)。IGF -1 和 IGF- 2 都可以促進(jìn)胎兒生長(zhǎng)。在出生后, 生長(zhǎng)激素可以促進(jìn)自主增長(zhǎng)和誘導(dǎo)全身和局部生產(chǎn) IGF-1, 通過(guò) IGF-1R 信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)增殖。,.,因此,IGF-1在動(dòng)物的生長(zhǎng)過(guò)程中

19、起著至關(guān)重要的作用.NEDD4是一個(gè)E3泛素連接酶, 它可以調(diào)節(jié)PTEN蛋白的穩(wěn)定性.雖然NEDD4 與 IGF1R不是直接相互作用的, 但是NEDD4能夠通過(guò)與Grb10相互作用, 調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性, 進(jìn)一步調(diào)控IGF1R的定位.Grb10抑制了IGF-1R和IR正確的細(xì)胞膜定位.因此, NEDD4可以促進(jìn)IGF-1R的激活.NEDD4基因敲除小鼠其表型是生長(zhǎng)遲緩和圍產(chǎn)期死亡.,.,泛素蛋白酶體系統(tǒng)與遺傳疾病: 正常細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育離不開蛋白的合成與降解之間的平衡。毫無(wú)疑問(wèn), 如果這個(gè)平衡被打破, 包括蛋白的降解受到抑制和過(guò)度降解, 都有可能參與許多人類疾病的發(fā)病過(guò)程。與 UPS 相關(guān)的許多疾病的病理因素根據(jù)其機(jī)制主要分為2類：第一類是UPS系統(tǒng)的酶或者某些底物突變(功能喪失)導(dǎo)致這些底物不能正常降解; 第二類是加速降解(功能獲得)某些蛋白.,.,.,泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的收錄: 隨著世界范圍內(nèi)泛素化修飾相關(guān)的研究報(bào)道越 來(lái)越多, 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)不斷產(chǎn)出, 合理地組織、儲(chǔ)存、呈現(xiàn)以及更新這些數(shù)據(jù)顯得很有必要, 這